干血样本预处理及检测方法
技术领域
本发明涉及血液检测领域,具体而言,涉及一种对干血样本进行预处理、用于检测干血样本的中的特定血液成分的方法以及制备特定血液成分的标准品的方法。
背景技术
血液作为人体循环***的“物流”载体,含有数千种蛋白质和小分子等成分。对于血液样品中的各种成分进行检测,可以了解人体的各项机能状态,这就是临床血液检测的理论基础。而在国内的血液临床检测通常是现场抽取新鲜静脉血测定。
血脂是在血液中或游离或结合至其它分子的脂质,通常以甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度来表征个人的血脂水平,统称为血脂四项。高脂血症是血液中的脂质和/或脂蛋白的升高或异常水平的存在,其是心血管疾病的主要危险因素。
对于例如高血脂等慢性病患者来说,需要定期监控血脂含量。由于现场抽取静脉血测定存在采血困难、标本运输不便以及保存时间短等问题,而现有的家用血糖仪准确度和灵敏度都往往比较低,无法达到准确测量的目的,因此迫切需要建立一种便捷、准确的检测血液样本的***。
干血点(DBS)采样是一种便捷的采血方式,其中血液样品被印迹在样本收集片上并干燥。并且,根据Friedewald公式:TC=TG/5+HDL-C+LDL-C,血脂四项中任何一项的浓度水平可以根据测定的其他三项的浓度水平推算得到,所以只要测出TG、TC、HDL-C和LDL-C中的任三项,就可以通过应用公式计算最后一项。
发明内容
本申请提供了对干血样本进行预处理的方法、制备特定血液成分的标准品的方法以及用于检测干血样本中的特定血液成分的方法,其结合干血采集技术,通过利用新的干血样本中处理方法以及特定血液成分的标准品的制备方法,对干血样本中包括的特定血液成分进行检测,从而使得大范围收集样本、高精度检测和长期监控成为可能。
在本申请的一个方面中,提供了一种对干血样本进行预处理的方法,包括:获取包含特定血液成分的干血样本;将溶血试剂加入到所述干血样本中以得到所述干血样本和溶血试剂的混合液;以及将所述混合液在特定溶解温度下放置一定的溶解时间以得到所述干血样本的复溶溶液,所述溶血试剂包括第一有机溶剂以及第二有机溶剂,其中所述第一有机溶剂可以与所述第二有机溶剂是不同的,或者所述第一有机溶剂可以与所述第二有机溶剂是相同的,并且当所述第一有机溶剂与所述第二有机溶剂相同时,所述第一有机溶剂和所述第二有机溶剂不为甲醇。
在一些实施方式中,所述特定血液成分选自甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇或上述的任意组合。
在一些实施方式中,所述第一有机溶剂和第二有机溶剂分别选自下组:乙醇、异丙醇、***、石油醚、正己烷、乙腈或上述的任意组合。
在一些实施方式中,所述溶血试剂包括甲醇与乙腈。在一些实施方式中,所述溶血试剂中乙腈的含量范围为5%-30%(v/v)。在一些实施方式中,所述溶血试剂中甲醇的含量范围为70%-95%(v/v)。在一些实施方式中,所述溶血试剂包括乙腈。在一些实施方式中,所述特定血液成分为甘油三酯、总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇,所述溶血试剂为甲醇与乙腈的混合,其中,所述溶血试剂中乙腈的含量范围为5%-30%(v/v)并且所述溶血试剂中甲醇的含量范围为70%-95%(v/v)。在一些实施方式中,所述溶血试剂为100%的甲醇。在一些实施方式中,所述特定血液成分为高密度脂蛋白胆固醇,所述溶血试剂为100%的乙腈。在一些实施方式中,所述溶血试剂进一步包括PBS。
在一些实施方式中,所述溶解时间为至少15分钟至3小时。在一些实施方式中,所述溶解时间为至少15分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时或至少3小时。在一些实施方式中,所述溶解温度为室温或37℃。在一些实施方式中,所述溶解温度为室温,即20±5℃。
在一些实施方式中,所述所述干血样本是通过以下方法获取的:血液样本被采集和存储在干血斑片上,并使所述血液样本覆盖整个所述干血斑片;以及对所述干血斑片进行取样以得到干血样本。在一些实施方式中,所述干血斑片直径大于或等于10mm。在一些实施方式中,所述干血斑片的含血区域的直径等于10mm。在一些实施方式中,对所述干血斑片进行取样以得到一个或多个直径小于或等于10mm的干血样本。在一些实施方式中,对所述干血斑片进行取样以得到一个或多个直径为6mm的干血样本。在一些实施方式中,对所述干血斑片进行取样以得到一个或多个直径为3mm的干血样本。在一些实施方式中,所述取样是通过利用打孔仪对所述干血斑片打孔进行的。在一些实施方式中,所述取样是通过对所述干血斑片的含血区域进行全部剪切进行的。
在一些实施方式中,所述干血斑片为干血纸片。
在一些实施方式中,所述对干血样本进行预处理的方法进一步包括:使用混合仪来回摇动所述混合液以充分溶解所述干血样本中的特定血液成分。
在一些实施方式中,所述混合仪为旋转混合仪,并且所述旋转混合仪被设置为旋转速度为10转/分钟-60转/分钟,并且旋转时间为5分钟至1小时。在一些实施方式中,所述混合仪为振荡器,并且所述振荡器被设置为振荡速度为500转/分钟-1000转/分钟,并且振荡时间为10分钟-30分钟。
在另一些实施方式中,所述对干血样本进行预处理的方法进一步包括:使用自动化液体处理平台配备并摇动所述混合液以充分混合所述干血样本和溶血试剂。在一些实施方式中,所述自动化液体处理平台包括内置振荡器,所述内置振荡器被设置为振荡速度是500转/分钟-1000转/分钟,振荡时间是10分钟-30分钟。
在一些实施方式中,使用自动化或半自动化生化仪检测所述混合液以确定所述混合液中是否包含待测血液成分以及该血液成分的含量。
在本申请的另一个方面中,提供了一种制备特定血液成分的标准品的方法,包括:获取Z个随机血液样本,并进行混合离心以分离得到上层血浆和下层沉积物,其中Z大于等于3;获取具有已知含量的所述特定血液成分的标准溶液;以及将所述沉积物与所述标准溶液混合以制得所述特定血液成分的标准品,其中所述标准品中特定血液成分浓度为Rs。
在一些实施方式中,将所述沉积物与所述标准溶液以约5.8:4.2、5.5:4.5或5.2:4.8的比例混合以制得所述特定血液成分浓度为Rs的标准品。在一些实施方式中,将所述沉积物与所述标准溶液以5.5:4.5的比例混合以制得所述特定血液成分浓度为Rs的标准品。
在本申请的再一个方面中,提供了一种用于对待测干血样本中的特定血液成分进行检测的方法,包括:获取根据上述对待测干血样本进行预处理的方法制备得到的待测干血样本的复溶溶液,其中所述待测干血样本中所包括的干血的体积为Vt;取Vtd体积的所述待测干血样本的复溶溶液并加入所述特定血液成分的检测试剂以得到待测样本溶液;对所述待测样本溶液进行检测以获得所述特定血液成分含量的检测值Mt;以及利用校准方程将所述特定血液成分含量的检测值Mt转化为所述特定血液成分含量的实际值Rt。
在一些实施方式中,所述用于对待测干血样本中的特定血液成分进行检测的方法进一步包括获取所述校准方程的步骤,包括:获取N种含有不同已知浓度的Rs={Rs1、Rs2、Rs3、Rs4…RsN}的特定血液成分的标准品干血样本,其中N≥5,并且所述标准品干血样本中所包括的干血的体积为Vs={Vs1、Vs2、Vs3、Vs4…VsN};制备N种标准品干血样本的复溶溶液;取Vsd体积的所述N种标准品干血样本的复溶溶液,并分别加入所述特定血液成分的检测试剂得到N种标准品样本溶液;对所述N种标准品样本溶液进行检测获得其中特定血液成分含量的检测值Ms={Ms1、Ms2、Ms3、Ms4…MsN};以及根据已知浓度Rs和检测值Ms之间的关系获取标准方程。
在一些实施方式中,所述利用校准方程将所述特定血液成分含量的检测值Mt转化为所述特定血液成分含量的实际值Rt的过程包括:将Mt作为y值代入所述校准方程中,计算获得x值;以及通过将x值进行体积校正获得所述特定血液成分含量的实际值Rt。
在一些实施方式中,所述Vtd=Vsd,通过将所述x值乘以Vt/Vs来进行所述体积校正。
在一些实施方式中,所述Vtd不等于Vsd,通过将所述x值乘以(Vt/Vs)*(Vsd/Vtd)来进行所述体积校正。
在一些实施方式中,所述用于对待测干血样本中的特定血液成分进行检测的方法进一步包括制备含有已知浓度Rs的所述特定血液成分的标准品干血样本的步骤,包括:获取Z个随机血液样本,并进行混合离心以分离得到上层血浆和下层沉积物,其中Z大于等于3;获取具有已知含量的所述特定血液成分的标准溶液;以及将所述沉积物与所述标准溶液混合以制得所述特定血液成分的标准品,其中所述标准品中特定血液成分浓度为Rs。
在一些实施方式中,将所述沉积物与所述标准溶液混合以5.5:4.5的比例以制得所述特定血液成分浓度为Rs的标准品。
在一些实施方式中,在制得所述特定血液成分的标准品之后,进一步包括:将所述特定血液成分的标准品点样和存储在干血斑片,并使所述血液样本覆盖整个所述干血斑片;以及对所述干血斑片进行取样以得到一份包括Vb体积的干血量的所述标准品干血样本。在一些实施方式中,所述待测干血样本是通过以下方法获取的:血液样本被采集和存储在干血斑片上,并使所述血液样本均匀覆盖整个所述干血斑片;以及对所述干血斑片进行取样以得到一份包括Vs体积的干血量的所述待测干血样本。
在一些实施方式中,所述特定血液成分选自下组:总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇或上述的任意组合。
本发明提供的上述干血样本的预处理的方法,可以利用特定的溶血试剂(例如甲醇和乙腈的混合溶剂,或纯乙腈等)快速高效地提取干血样本中的特定血液成分(例如总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇或其任意组合)的含量,使得利用干血样本对特定血液成分进行大量、高效、准确的检测成为可能。
进一步,本发明发现:通过调整溶解温度、溶解时间,并且可以通过使用混合仪和或振荡器,使干血样本能最大程度地溶解在溶血试剂中,从而使得即使使用少量的干血样本就能准确地测得特定血液成分的含量,提高了整个实验的准确度,并且使得小样本量检测成为可能。
另外,本发明中提供了用于检测干血样本中的特定血液成分的方法,其结合干血采集技术,通过利用新的干血样本中处理方法对干血样本中包括的特定血液成分进行检测,从而使得大范围收集样本、高精度检测和长期监控成为可能。
最后,本发明还提供了针对特定的血液成分制备标准品的方法,从而为上述对干血样本中的特定血液成分的检测提供了更加精准的校准参考,从而提高整个实验的准确度。
以上为本申请的概述,可能有简化、概括和省略细节的情况,因此本领域的技术人员应该认识到,该部分仅是示例说明性的,而不旨在以任何方式限定本申请范围。本概述部分既非旨在确定所要求保护主题的关键特征或必要特征,也非旨在用作为确定所要求保护主题的范围的辅助手段。
附图说明
通过下面说明书和所附的权利要求书并与附图结合,将会更加充分地描述本申请内容的上述和其他特征。可以理解,这些附图仅描绘了本申请内容的若干实施方式,因此不应认为是对本申请内容范围的限定。通过采用附图,本申请内容将会得到更加明确和详细的说明。
图1示出了根据本发明的一种具体实施方式的样本收集器的示意图。
图2示出了根据本发明的一种具体实施方式的干血样本的预处理的方法的示例性流程图。
图3示出了根据本发明的一种具体实施方式的针对特定的血液成分制备标准品的方法的示例性流程图。
图4示出了根据本发明的一种具体实施方式的用于检测待测干血样本中的特定血液成分的方法的示例性流程图。
图5示出了根据本发明的一种具体实施方式的获得校准方程的方法的示例性流程图。
图6示出了根据本发明的另一种具体实施方式的用于检测待测干血样本中的特定血液成分的方法的示例性流程图。
图7A-7C分别示出了在75%甲醇+25%乙腈的混合溶液作为溶血试剂时,TC、TG和LDL-C的干血检测值与其对应的全血血清检测值的相关性。
图8A-8C分别示出了在100%甲醇作为溶血试剂时,TC、TG和LDL-C的干血检测值与其对应的全血血清检测值的相关性。
图9A-9C分别示出了采用打孔方式时,TC、TG和LDL-C的干血检测值与其对应的全血血清检测值的相关性。
图10A-10C示出了采用剪切方式时,TC、TG和LDL-C的干血检测值与其对应的全血血清检测值的相关性。
具体实施方式
在下面的详细描述中,参考了构成其一部分的附图。在附图中,类似的符号通常表示类似的组成部分,除非上下文另有说明。详细描述、附图和权利要求书中描述的示例性实施方式并非旨在限定。在不偏离本申请的主题的精神或范围的情况下,可以采用其他实施方式,并且可以做出其他变化。可以理解,可以对本文中一般性描述的、在附图中图解说明的本申请内容的各个方面进行多种不同构成的配置、替换、组合、设计,而所有这些都明确地构成本申请内容的一部分。
在下文中,为了对具体实施例进行清楚的描述,将采用一些特定的术语。然而采用这些术语的本意并非限制本申请的保护范围,这些术语的范围应该扩展至任何以大致相同的手段达到大致相同的目的的等同替换。
干血斑片
对于待采血的人群来说,通过使用包括干血基质的样本收集器,比如干血斑片(包括干血纸片和干血高分子塑料片、干血玻纤及混合材质载体等)、干血海绵以及干血棉等,方便人群自己采血,无需到医药采血,节省了时间和精力,而且只需要少量的指尖血量,也便于收集大量样本。而且血液样品即干血样本的运输也非常便捷,为病人和实验室节省了成本。在某些实施方式中,该样本收集器为干血斑片。在某些实施方式中,该干血斑片为干血纸片。
图1以样本收集器为干血斑片为例示出了根据本发明的一种具体实施方式的干血斑片100的示意图。
如图1所示,该干血斑片100包括血样收集区101以及样本信息区102。其中血样收集区101设有供采集血样的载片(例如,滤纸片),所述样本信息区102设有供填写与该血样对应的样本信息(例如提供该样本的患者的姓名、手机号、地址和采样日期等)。虽然如图1所示,血样收集区101包括3个圆形的供采集血样的滤纸片,但是本领域技术人员可以根据实际需要设置滤纸片的个数、形状和大小。
优选的,该干血斑片100还包括保护部103以及连接边104。其中该保护部1103具有保持空白血样收集区101的清洁、保护取样后的干血斑片不受污染的作用;并且保护部103通过连接边104连接血样收集区101,形成一体式结构,,所述保护部103相对于连接边104弯折,将所述空白血样收集区101覆盖。通过折叠的方式覆盖于血样收集区101上,不会对空白取样面或采集血样后得到的干血斑片表面产生摩擦,进而影响检测结果。
在一些实施方式中,血样收集区101包括多个圆形的供采集血样的Waterman滤纸片,由患者在家中自行消毒并采集血液样品(例如指尖血),将血液样品滴入在血样收集区101的滤纸片上并使其至少覆盖全部滤纸片的面积,进一步自然晾干1-2小时。在一些实施方式中,所述滤纸片单位面积内吸附血液的饱和容量固定。在一些实施方式中所述圆形的供采集血样的Waterman滤纸片直径为12.5mm,但因为周边区域不适于储血,所以所述干血斑片的含血区域大约为直径10mm。而其上可吸附血液的饱和容量大约为40-45μl。在一些实施方式中,在一定的时间周期内,定期、多次采集血液,并使得每次采集的血液样品分别自然饱和吸收在一系列的干血斑片上,并进一步干燥。并且,每次采血后在2天之内将干血斑片通过快递等方式递送到相应的检测机构。
干血样本预处理方法
图2示出了根据本发明的一种具体实施方式的干血样本的预处理的方法200的示例性流程图。所述方法200包括以下步骤:获取包含特定血液成分的干血样本(201);将溶血试剂加入到所述干血样本中以得到所述干血样本和溶血试剂的混合液(202);以及将所述混合液在特定溶解温度下放置一定的溶解时间以得到所述干血样本的复溶溶液(203)。
在本申请中使用的术语“特定血液成分”是指甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇或其任意组合。
本申请中涉及的“溶血试剂”包括分别选自下组:乙醇、异丙醇、***、石油醚、正己烷、乙腈或上述任意组合的第一有机溶剂以及第二有机溶剂。在一些实施方式中,所述第一有机溶剂与所述第二有机溶剂是不同的。在一些实施方式中,所述第一有机溶剂可以与所述第二有机溶剂是相同的,并且此时所述第一有机溶剂和所述第二有机溶剂不为甲醇。在一些实施方式中,所述溶血试剂包括甲醇与乙腈。在一些实施方式中,所述溶血试剂中乙腈的含量范围为5%-30%(v/v)。在一些实施方式中,所述溶血试剂中甲醇的含量范围为70%-95%(v/v)。在一些实施方式中,所述溶血试剂为甲醇与乙腈,且所述溶血试剂中乙腈的含量范围为5%-30%(v/v),所述溶血试剂中甲醇的含量范围为70%-95%(v/v)。在一些实施方式中,所述特定血液成分为甘油三酯、总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇,所述溶血试剂为甲醇与乙腈,其中,所述溶血试剂中乙腈的含量范围为5%-30%(v/v)并且所述溶血试剂中甲醇的含量范围为70%-95%(v/v)。在一些实施方式中,所述溶血试剂包括乙腈。在一些实施方式中,所述溶血试剂为纯甲醇。在一些实施方式中,所述特定血液成分为高密度脂蛋白胆固醇,所述溶血试剂为100%的乙腈。在一些实施方式中,所述溶血试剂进一步包括PBS。上述特定的溶血试剂可以非常有效地将血液样品中的特定血液成分溶解于溶血试剂中。
本申请中所述的“干血样本”是指一个或多个由干血斑片上取得的载有干血血样的样本。在一些实施方式中,可以通过以下方法获取所述的“干血样本”:血液样本被采集和存储在如上所述的干血斑片100的血样收集区101上,并使所述血液样本至少覆盖血样收集区101的全部血样采集区域(即含血区域)的面积,并通过如利用打孔仪对所述干血斑片进行打孔或者剪切出全部样本采集区等方法对所述干血斑片进行取样以得到一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多)所述干血样本,其中本文涉及的干血样本可以是待测干血样本也可以是标准品干血样本。
在一些实施方式中,所述干血样本为直径小于或等于10mm(例如10mm、8mm、7mm、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm)的载有干血血样的滤纸片。本领域技术人员同时还应当考虑到的圆形干血样本的直径越小,其中所包括的干血的体积越小,因此可能需要获得更多个的圆形干血样本以保证样本量足够进行后续的特定血液成分的检测。在一些实施方式中,上述一个直径为10mm的干血样本中所包括的干血的体积为不低于25μl。
应当理解一个或多个干血样本中包括的总的干血体积(如上述可对应总取样面积)和溶血试剂的体积比例能够影响所述特定血液成分的溶出率、溶出效率以及特定血液成分在溶出液中的浓度。所以在以下的实验步骤中,均需要保证对于待测干血样本和标准品干血样本进行检测时,所取的干血样本的总面积、所加入的溶血试剂以及检测试剂的含量一致。
在步骤202中,运用试剂添加装置将溶血试剂加入到干血样本中以得到所述干血样本和溶血试剂的混合液。所述试剂添加装置可以是移液器或自动化液体处理平台。在一些实施方式中,移液器是手工移液器。在一些实施方式中,手工移液器可以是单道移液器或多道移液器。在一些实施方式中,运用可以批量将溶血试剂加入干血样本中的自动化液体处理平台(例如安捷伦Bravo 96LT)以获得干血样本和溶血试剂的混合液。
在步骤203中,所述干血样本和溶血试剂的混合液在特定溶解温度下放置一定的溶解时间以得到所述干血样本的复溶溶液。本领域技术人员应当理解,在溶血试剂被加入到干血样本中后,可以通过调节溶解温度和/或溶解时间来调节特定血液成分溶解于溶血试剂的效率和含量,还可以通过以手动或机械的方式混合溶血试剂和干血样本,以提高特定血液成分溶解于溶血试剂的效率和含量。在一些实施方式中,所述溶解时间为至少15分钟至3小时。在一些实施方式中,溶解时间为至少15分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时或至少3小时。在一些实施方式中,溶解温度为室温或37℃。在一些实施方式中,溶解温度为室温,即20±5℃。在一些优选的实施方式中,溶解温度为室温,溶解时间为2小时。
在一些实施方式中,步骤203还进一步包括使用混合仪来回摇动干血样本和溶血试剂的混合液以充分溶解所述干血样本中的特定血液成分。其中,可以通过设定混合仪的速度以提高特定血液成分溶解于溶血试剂的效率和含量。在一些实施方式中,所述混合仪是旋转混合仪(例如DHS JC502-DR-MIX)或振荡器。在一些实施方式中,所述旋转混合仪可被设置为旋转速度在10转/分钟-60转/分钟范围内,旋转时间在5分钟至1小时范围内。在一些实施方式中,在步骤202中使用自动化液体处理平台将溶血试剂加入干血样本中,而该自动化液体处理平台带有内置的振荡器可用于在步骤203中充分混合干血样本和溶血试剂,以提高特定血液成分溶解于溶血试剂的效率和含量。在一些实施方式中,上述振荡器可被设置为振荡速度在500转/分钟-1000转/分钟范围内,振荡时间在10分钟-30分钟范围内。
标准品制备方法
图3示出了根据本发明的一种具体实施方式的针对特定的血液成分制备标准品的方法300的示意图。如下文的校准方法所示,本发明还提供了一种在对待测干血样本进行了预处理并得到待测干血样本的复溶溶液之后,对复溶溶液进行检测从而得到测量值,并且针对该测量值利用校准方程进行校准的方法。其中,为了确定校准方程,需要利用N种含有不同已知浓度的Rs={Rs1、Rs2、Rs3、Rs4…RsN}的特定血液成分的标准品样本。下文介绍了制备标准品样本的方法。
所述针对特定的血液成分制备标准品的方法300包括以下步骤:获取Z个随机血液样本,并进行混合离心以分离得到上层血浆和下层沉积物(301);获取具有已知含量的所述特定血液成分的标准溶液(302);将所述沉积物与所述标准溶液以一定比例混合制得特定血液成分浓度为Rs的标准品(303)。
其中步骤301中获得的随机血液样本为经抗凝处理的血液样本,随机样本的量Z不小于3,进行混合离心得到的下层沉积物主要为红细胞另外还包括白细胞及血小板等。一般情况下,人体血液中血浆含量为55±3%(v/v),下层沉积物含量为45±3%(v/v)。不同人的血液中血浆及下层沉积物的含量比例略有差别,但当样本量较大(例如≥100、≥500、≥1000、≥2000等)时,将各血液样本混合后离心得到的上层血浆和下层沉积物的比例约为5.5:4.5。
本申请中涉及的“含量”包含质量百分比、体积百分比、数量百分比、质量、摩尔数、质量浓度或摩尔浓度等。
在步骤302中,可以通过购买市售的具有已知含量的所述特定血液成分的标准溶液(例如已知浓度的TG、TC、LDL-C、HDL-C的人造血清)、或利用已知质量或已知摩尔数的所述特定血液成分的干粉或已知浓度的浓缩液等配置得到具有已知含量的所述特定血液成分的标准溶液。
在步骤303中,将所述沉积物与所述标准溶液以一定比例(例如以约5.8:4.2、5.5:4.5或5.2:4.8的比例)混合制得特定血液成分浓度为Rs的标准品。本领域技术人员应当理解此处特定血液成分的浓度Rs与在步骤302中获得的标准溶液的“已知含量”并不相同,两者之间存在着由混合比例导致的比例差异,例如设步骤302中获得的特定血液成分TC的标准溶液中已知TC含量为5mmol/L,将步骤301中获得的沉积物与上述步骤302中获得的标准溶液以5.5:4.5混合制得TC的标准品,此时该标准品中TC的浓度(mmol/μl)Rs为2.25mmol/L。应当理解,特定血液成分浓度Rs的单位可以为mmol/L、mg/dl、pmol/μl等任意本领域公知的浓度单位。
在一些实施方式中,上述制备标准品的方法300还可以进一步包括将已制得的标准品点样、存储在干血斑片上,并且在干血斑片上的标准品干燥后对其进行取样,从而获得标准品干血样本的步骤(具体可以参照上文对方法200的描述中“干血样本”的制备方法的相关部分)。
检测干血样本中特定血液成分的方法
图4示出了根据本发明的一种具体实施方式的用于检测待测干血样本中的特定血液成分的方法400的示意图。所述用于检测待测干血样本中的特定血液成分的方法400包括步骤:获取根据对待测干血样本的预处理的方法制备的待测干血样本的复溶溶液(401);取Vtd体积的所述待测干血样本的复溶溶液并加入所述特定血液成分的检测试剂以得到待测样本溶液(402);对所述待测样本溶液进行检测以获得所述特定血液成分含量的检测值Mt(403);利用校准方程将检测值Mt转化为待测样本中特定血液成分含量的实际值Rt(404)。
在步骤401中,获取的步骤可以包括通过如方法200中所描述的具体步骤来制备待测干血样本的复溶溶液的制备步骤,也可以是不包括制备仅包括直接获取的行为(例如购买获得、交付获得等)。
在步骤402中,取Vtd体积的所述待测干血样本的复溶溶液并加入所述特定血液成分的检测试剂以得到待测样本溶液。本领域技术人员应当理解,可以通过经验估计、数学推算或者实验测试确定所取的复溶溶液的体积Vtd,从而使得在复溶溶液和检测试剂的混合液中特定血液成分的终浓度在适合检测的浓度范围内,该适合检测的浓度范围受包括仪器检测灵敏度、试剂检测范围、干血样本取样量(如其中包含的干血体积Vt/干血样本总面积St)等任何本领域技术人员公知因素的限制。本申请涉及的“检测试剂”是指任何已知的或市售的可用于特定血液成分的检测的试剂。
在步骤403中,对所述待测样本溶液进行检测以获得所述特定血液成分含量的检测值Mt,其中所述“检测值”是指在医学检验中通过仪器测量获得的信号在经过某种内置的数据处理或者程序转化后得到的特定血液成分含量的测定值。
在步骤404中,利用校准方程将检测值Mt转化为待测样本中特定血液成分含量的实际值Rt的步骤通过数学转化完成,其中校准方程可以通过本领域技术人员公知的任何方式获得,如校准方程可以通过利用已知浓度的标准品在同一机器及同一检测批次中的测量值与已知浓度的关系获得。
图5示出了根据本发明的一种具体实施方式的获得校准方程的方法500的示意图。所述获得校准方程的方法500包括步骤:获取N种含有不同已知浓度Rs的特定血液成分的标准品干血样本(501);制备N种标准品干血样本的复溶溶液(502);取Vsd体积的所述N种标准品干血样本的复溶溶液,并分别加入所述特定血液成分的检测试剂得到N种标准品样本溶液(503);对所述N种标准品样本溶液进行检测获得其中特定血液成分含量的检测值Ms={Ms1、Ms2、Ms3、Ms4…MsN}(504);根据已知浓度Rs和检测值Ms之间的关系获取标准方程(505)。
在步骤501中,N种不同标准品干血样本中含有的特定血液成分的已知浓度Rs={Rs1、Rs2、Rs3、Rs4…RsN},其中N≥5,并且所述N种标准品干血样本中所包括的干血的体积Vs={Vs1、Vs2、Vs3、Vs4…VsN}。
步骤502中制备N种标准品干血样本的复溶溶液的步骤可参照上文干血样本预处理方法200中的具体描述。
方法500中的步骤503、504对应于方法400中的步骤402、403;具体操作细节参见方法400中对相应的步骤的描述。
在步骤505中,根据已知浓度Rs和检测值Ms之间的关系获取标准方程的过程通过数据处理完成,具体地以所述Rs={Rs1、Rs2、Rs3、Rs4…RsN}中的每一个为横坐标和所述Ms={Ms1、Ms2、Ms3、Ms4…MsN}中的相应一个为纵坐标获得N个校准点,并且根据上述N个校准点的分布情况,确定反映已知浓度Rs和检测值Ms之间映射关系的校准方程。上述校准方程可以是任何形式的,例如线性方程、指数方程、对数方程等。在一些实施方式中,校准方程为线性的,且该线性方程在x、y轴上均无截距。在一些实施方式中,校准方程为线性的,且该线性方程在y轴上的截距为正数(即在特定血液成分的实际含量为0时,由于检测方法或者检测试剂的原因产生的检测本底值)。
图6示出了根据本发明的另一种具体实施方式的用于检测待测干血样本中的特定血液成分的方法600的示意图。其中方法600中的步骤601-604对应于方法400中的步骤401-404,具体操作细节参见方法400中对相应的步骤的描述;方法600中进一步包括获取校准方程的步骤(603’),其对应于方法500中的步骤501-505,具体操作细节参见方法500中对相应的步骤的描述。在某些实施方式中,方法600还进一步包括制备N种含有不同已知浓度Rs的特定血液成分的标准品的步骤(601’),其对应于方法300中的步骤301-303,具体操作细节参见方法300中对相应的步骤的描述;和将上述N种含有不同已知浓度Rs的特定血液成分的标准品制备成N种含有不同已知浓度Rs的特定血液成分的标准品的干血样本的步骤(602’),其具体操作步骤可参照方法200中所描述的“干血样本”的制备方法。
以下将通过实验例具体描述本发明。
实验例
通过下述非限制性实验例进一步描述本发明。需要说明的是举出这些实验例只是用于进一步说明本发明的技术特征,并非旨在也不能够被解释为对本发明的限制。所述实验例不包含本领域一般技术人员所公知的传统方法(化学合成技术等)的详细描述。
本发明使用的仪器是上海艾诺电子有限公司的Amorsino 460全自动生化分析仪。
在现有的临床实验室中,对于高血脂的检测所使用的标准方法是基于全血(例如新鲜的静脉血)的血脂四项检测。在本申请中主要基于干血并且使用上海艾诺电子有限公司的Amorsino 460全自动生化分析仪测定的血脂四项,而一部分对照实验中为基于全血血清测定血脂四项。
实施例1:一般实验操作
样本的采集及制备
待测干血样本的制备:对受试者手指进行消毒,并通过采血针穿刺指尖推挤手指根部血管,使指尖血自然流出,并滴入到干血斑片上用于收集血样的滤纸片区域内,其中指尖流出的血滴量应至少可以浸润并覆盖全部滤纸片的面积,之后进一步室温干燥约1-2个小时直至浸润血液的滤纸片干透。之后使用低透气性的塑胶样品袋封存干燥后的干血斑片,并且可选地在样品袋内包括干燥剂以确保样本在存储运输过程中保持干燥。由于载有血液样品中可能包含血源性病原体,所以整个实验过程应小心处理,在任何处理干血斑片的时候都应保持使用手套。在检测前利用打孔仪对所述干血斑片进行打孔,或者利用剪刀剪切出全部滤纸片区域对所述干血斑片进行取样以得到一个或多个直径在1mm-10mm之间的干血样本。
全血血液作为对照的采血方法:对于每一位受试者采集新鲜的静脉血液样品,将其血液样品分成两份,第一份是全血血液,存储在含有抗凝剂的采血管中置于4℃冷藏备用,用于测定基于全血样本的特定血液成分的浓度;第二份则用于待测干血样本的制备,即移取滴入在干血斑片上用于收集血样的滤纸片区域内,使血样浸润并覆盖滤纸片的全部面积(例如大约直径为10mm的圆形区域),之后室温干燥约1-2个小时,得到载有干血样品的斑片,用于测定基于干血样本的特定血液成分的浓度。
干血样本的预处理(待测干血样本与标准品干血样本的预处理方法相同)
将干血样本置于1.5ml的微量离心管中并加入750μl溶血试剂。将上述微量离心管置于旋转混合仪DHS JC502-DR-MIX上,将旋转速度设置为30转/分钟,旋转时间设置为1小时,室温条件下溶解一个小时,获得复溶溶液。
特定血液成分的检测
本申请中采用的检测试剂主要来源于利德曼(Leadman)(总胆固醇测定试剂盒-TC,货号:TC7150;甘油三酯测定试剂盒-TG,货号:TG7160;高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒-HDL-C,货号:HD7173;低密度脂蛋白测定试剂盒-LDL-C,货号:LD7182)及九强(BSBE)(总胆固醇检测试剂盒,货号:GS101Z;甘油三酯检测试剂盒,货号:GS111Z;高密度脂蛋白检测试剂盒,货号:GS131Z;低密度脂蛋白检测试剂盒,货号:GS141Z),其中对各个特定血液成分的检测流程,除样本处理及用量部分需根据不同的样本类型进行调整以外,其他基本依照各检测试剂盒及Amorsino 460的操作手册进行。
在干血样本的特定血液成分的检测中,根据各个检测用试剂盒的操作手册内针对血清检测的用样量,以其4-5倍的用量适当调节复溶溶液的用量(例如,若针对血清为1μl血清+199μl检测试剂,则针对复溶溶液可以为5μl复溶溶液+195μl检测试剂),之后利用Amorsino 460全自动生化分析仪进行检测。
实施例2:溶血试剂的选择
根据实施例1中所述的样本的采集及制备、干血样本的预处理及对特定血液成分进行检测的方法,其中共有受试者10人(以S1-S10表示),各取全血样本一份及多个干血斑片,通过剪切获得若干直径为10mm的圆片,每3个圆片加入一个1.5ml的微量离心管中并加入750μl溶血试剂进行溶解。其中使用的溶血试剂为:
第一组:PBS加上甲醇、乙醇、异丙醇、***、石油醚、正己烷、乙腈中的任一,其中两者比例包括1:9、2:8、5:5,共21种;
第二组:甲醇加上乙醇、异丙醇、***、石油醚、正己烷、乙腈中的任一,其中两者比例包括8:2、6:4、4:6、2:8,共24种。
上述各组溶血试剂被用于溶解干血样本中的特定血液成分,其溶解效率通过比较干血样本溶解得到的复溶溶液中与全血血清中的特定血液成分的检测值来计算。利用上述利德曼的TC7150、TG7160、HD7173、LD7182试剂盒分别检测上述第一组和第二组溶血试剂的特定血液成分溶解效率。其中第一组PBS与其他有机试剂的混合体系在部分比例有一定效果,但不是最佳。在第二组的甲醇与与其他有机试剂的混合体系中,甲醇与正巳烷、甲醇与乙醇、甲醇与乙腈、异丙醇与甲醇的部分混合比例对于某些血液成分(例如TC、TG、LDL-C)具有相对高的溶解效率(数据未包括)。但就总体数据与现有技术中利用100%甲醇进行溶血的效率进行比较的结果而言,其中甲醇(MeOH)与乙腈(ACN)的混合体系相较其他与100%甲醇的体系相比有更为显著的溶解效率的提高。之后针对甲醇与乙腈的体系的最佳配比进行了又一组的溶解试剂的检测。
也就是说,对于甲醇和乙腈的混合体系,按照如下表所示的比例进行混合以作为溶解试剂,并且测得了各个比例的溶解试剂对于TG的检测值(单位:毫摩尔/升)。
表1:不同溶血试剂的TG溶出率
相类似的,对于甲醇和乙腈的混合体系,按照如下表所示的比例进行混合以作为溶解试剂,并且测得了各个比例的溶解试剂对于TC的检测值。
表2:不同溶血试剂的TC溶出率
同样,对于甲醇和乙腈的混合体系,按照如下表所示的比例进行混合以作为溶解试剂,并且测得了各个比例的溶解试剂对于LDL-C的检测值。
表3:不同溶血试剂的LDL-C溶出率
(注:上述表一至表三中的每个值均为四次平行试验的平均值,其中*表示显著异常可以剔除的数据。)
对于HDL-C而言,上述所有的不同溶血试剂对其的提取率均很低,体现为利用不同溶血试剂得到的复溶溶液中HDL-C的检测值均大大低于其对应的全血血清的检测值,其中在利用100%乙腈作为溶血试剂时HDL-C的溶解效率最高,其检测值为对应的全血血清的检测值的40%。对于HDL-C的浓度,可以通过其他三项的浓度水平,利用Friedewald公式:TC=TG/5+HDL-C+LDL-C推算得到。
根据表1、表2、表3中所列的数据可知,相比100%甲醇作为溶血试剂,75%甲醇+25%乙腈对TC的提取率提高45%,对TG的提取率提高9%,对LDL-C的提取率提高25%以上。
此外,根据表1、2、3中所列的数据,可以确定在不同溶解试剂中特定血液成分的干血检测值与其对应的全血血清检测值的相关性。结果表明,75%甲醇+25%乙腈提取的TC干血检测值与TC血清检测值的相关性系数(简称为TC结果的相关性)为R2=0.6988(图7A),TG结果的相关性为R2=0.9423(图7B),LDL-C结果的相关性为R2=0.4581(图7C)。相比100%甲醇作为溶血试剂提取的TC与血清TC结果的相关性为R2=0.7101(图8A),TG结果的相关性为R2=0.7966(图8B),LDL-C结果的相关性为R2=0.1614(图8C)。由此可见75%甲醇+25%乙腈作为溶血试剂相较于纯甲醇作为溶血试剂时,其干血样本的特定血液成分的检测值与其对应的全血血清检测值具有更好的相关性。需要注意的是:图7A-7C以及图8A-8C中的横坐标均代表血清样本检测值(单位:毫摩尔/升),而纵坐标则代表干血样本检测值(单位:毫摩尔/升)。
实施例3:不同检测试剂的本底干扰
由实施例2的表1-3中数据可见,无论是针对TC、TG、还是LDL-C,其干血样本在甲醇或甲醇与乙腈的混合溶液作为溶血试剂时,相应的血液成分的检测值均大于其在对应的全血样本中的检测值。即,干血样本的预处理方法对应检测试剂存在本底干扰。为检测是否该干扰是仅存在于实施例1、2中所述的对干血样本的预处理方法与实施例2中使用的利德曼的检测试剂之间,我们购买了其他市售的TC、TG、LDL-C检测试剂(例如实施例1中所述的九强检测试剂盒),并依照实施例2中所述的内容对应进行了检测。实验发现,在以100%甲醇、80%甲醇+20%乙腈、70%甲醇+30%乙腈作为溶血试剂,在利用不同公司的检测试剂进行检测时,不同的溶血试剂对于检测试剂均存在干扰。
但是,使用利德曼试剂检测干血样本中的TC、TG、LDL-C,所得的检测值比使用九强的检测试剂得到的检测值与全血样本中的检测值的相关性更好,并且具有更小的干扰。
实施例4:溶血时间及溶血温度的选择
根据实施例2中所述的样本的采集及制备、干血样本的预处理及对特定血液成分进行检测的方法,其中对于溶血时间及溶血温度进行调整,以确定能够最大程度溶解特定血液成分的最佳溶解时间及温度。其中采用70%甲醇+30%乙腈为溶血试剂,各样本的干血样本在溶血温度下经不同的溶血时间,最后测定的TC检测值列于下表4。
表4:不同溶血时间或不同溶解温度下的TC溶出率
由表4所示数据可见,室温下2小时已足够将干血样本中的特定血液成分TC溶出。在相同的溶解时间范围内,在室温与37℃条件下,特定血液成分的溶出效率并无明显不同,但根据表4中数据进行与血清检测值的相关性分析表明,室温下溶解的干血样本其特定血液成分的检测值具有与血清检测值更好的相关性(数据未包括)。
并且,不同溶血时间或不同溶解温度下的TG以及LDL-C的溶出率实验(数据未包括)也表明,室温下2小时已足够将干血样本中的TG以及LDL-C溶出。在此不再重复。
在本实验中,还以100%甲醇或者以80%甲醇+20%乙腈为溶血试剂进行了上述相同的检测,结果显示不同的溶血试剂中优选的溶血时间、溶血温度并未有显著性的差异,室温下2小时在后两种溶血试剂的相应实验中同样可以有效地溶出特定血液成分,且室温较37℃的条件可以提供更好的相关性(数据未包括)。
实施例5:经预处理的干血样本中特定血液成分检测的可重复性
据实施例1中所述的样本的采集及制备、干血样本的预处理及对特定血液成分进行检测的方法,其中共有受试者5人(以S1′-S5′表示),各取全血样本一份及多个干血斑片,其中全血样本保存于4℃下直至使用,而用于批内可重复性检测的干血斑片封存于包含干燥剂的样品袋中存储于-80℃左右直至使用,用于批间可重复性检测的干血斑片封存于包含干燥剂的样品袋中存储于20℃左右直至使用。所有干血样本在检测前使用100%甲醇作为溶血试剂(考虑到乙腈的毒性,在以下的实验中均采用100%的甲醇作为溶血试剂),在室温下溶解2个小时。
批内检测可重复性
在单批次检测中,对同一样本进行20次重复检测,将每个样本的多次检测结果进行平均,并计算得到标准方差(SD)列于下表中,其中变异系数(CV)表示SD占平均值的百分比。
表5:批内多次检测TC值
样本 |
N |
平均值 |
SD |
CV |
S1″ |
20 |
7.41 |
0.24 |
3.25% |
S2′ |
20 |
6.24 |
0.22 |
3.57% |
S3′ |
20 |
5.3 |
0.15 |
2.57% |
S4′ |
20 |
5.59 |
0.2 |
3.62% |
S5′ |
20 |
5.63 |
0.25 |
4.37% |
表5中所示的5个样本TC检测值的CV分别为:3.25%、3.57%、2.75%、3.62%和4.37%。
表6:批内多次检测TG值
样本 |
N |
平均值 |
SD |
CV |
S1″ |
20 |
1.15 |
0.05 |
4.25% |
S2′ |
20 |
0.81 |
0.03 |
3.35% |
S3′ |
20 |
0.73 |
0.03 |
3.49% |
S4′ |
20 |
0.70 |
0.02 |
2.87% |
S5′ |
20 |
1.28 |
0.05 |
3.84% |
表6中所示的5个样本TG检测值的CV分别为:4.25%、3.35%、3.49%、2.87%和3.84%。
表7:批内多次检测LDL-C值
样本 |
N |
平均值 |
SD |
CV |
S1″ |
20 |
4.47 |
0.17 |
3.82% |
S2′ |
20 |
3.96 |
0.22 |
5.61% |
S3′ |
20 |
3.30 |
0.09 |
2.8% |
S4′ |
20 |
3.62 |
0.19 |
5.16% |
S5′ |
20 |
3.07 |
0.11 |
3.61% |
表7中所示的5个样本TG检测值的CV分别为:3.82%、5.61%、2.8%、5.16%和3.61%。
批间检测可重复性
在7个不同检测批次中,分别对相同的样本进行重复检测,将每个样本的多次检测结果进行平均,并计算得到标准方差(SD)以及CV列于下表中。
表8:批间多次检测TC值
样本 |
N |
平均值 |
SD |
CV |
S1″ |
7 |
6.45 |
0.54 |
8.38% |
S2′ |
7 |
5.51 |
0.46 |
8.34% |
S3′ |
7 |
5.25 |
0.34 |
6.65% |
S4′ |
7 |
5.76 |
0.40 |
6.91% |
S5′ |
7 |
5.52 |
0.64 |
11.65% |
表8中所示的5个样本TC检测值的CV分别为:8.38%、8.34%、6.65%、6.91%和11.65%。
表9:批间多次检测TG值
样本 |
N |
平均值 |
SD |
CV |
S1″ |
7 |
1.20 |
0.15 |
12.89% |
S2′ |
7 |
0.79 |
0.09 |
11.77% |
S3′ |
7 |
0.79 |
0.08 |
9.57% |
S4′ |
7 |
0.80 |
0.08 |
9.51% |
S5′ |
7 |
1.39 |
0.11 |
7.65% |
表9中所示的5个样本TG检测值的CV分别为:12.89%、11.77%、9.57%、9.51%和7.65%。
表10:批间多次检测LDL-C值
样本 |
N |
平均值 |
SD |
CV |
S1″ |
7 |
4.01 |
0.41 |
10.24% |
S2′ |
7 |
3.64 |
0.37 |
10.15% |
S3′ |
7 |
3.43 |
0.32 |
9.26% |
S4′ |
7 |
3.86 |
0.26 |
6.81% |
S5′ |
7 |
3.26 |
0.23 |
7.18% |
表10中所示的5个样本TG检测值的CV分别为:10.24%、10.15%、9.26%、6.81%和7.18%。
上述批内和批间重复检测的实验结果表明,对于经特殊预处理的干血样本中的特定血液成分特别是TC、TG、LDL-C的检测具有非常好的可重复性,可见本发明所述的对于干血样本中特定血液成分的检测方法切实可行。
实施例6:经预处理的干血样本中特定血液成分检测的准确性
据实施例1中所述的样本的采集及制备、干血样本的预处理及对特定血液成分进行检测的方法,其中共有受试者33人,各取全血样本一份及多个干血斑片,其中针对干血斑片,在检测前或打孔或剪切获得干血样本。所有干血样本在检测前使用100%甲醇作为溶血试剂,在室温下溶解2个小时。
标准品的制备:
将来自多个血液捐献者的血液混合后,离心分离后得到上层血浆及下层沉积物。将上述沉积物与市售的已知浓度的TC、TG、LDL-C标准品溶液(或者经系列稀释后具有不同已知浓度的TC、TG、LDL-C标准品溶液)以5.5:4.5的体积比混合,得到针对不同特定血液成分的标准品。
具体地,将10ml全血样本加入15ml Nunc 339650离心管中,使用LS离心机Baiyang400C进行离心,3000rpm离心5min。去除离心后上层的约4ml上清,后在离心管中加入8mlPBS溶液(Sigma-Aldrich公司,货号:P5368-10PAK),使用移液器轻轻混合,重复离心、移除上清的步骤5次后得到血液下层沉积物。之后量取4ml来自Bio-Rad公司的血脂质控标准品Bio-Rad 641,并将其加入到上述15ml离心管中轻轻混合均匀以得到第一标准品。重复上述步骤,但是使用Bio-Rad 642代替Bio-Rad 641,获得第二标准品。以及重复上述步骤,使用其他具有不同浓度的特定血液成分的溶液代替Bio-Rad 642、Bio-Rad 641获得第N个标准品。
取25μl第一标准品、第二标准品…第N个标准品,将其滴入并储存到BM0401干血斑片上用于收集血样的滤纸片区域内,使其覆盖全部滤纸片的面积,针对每个标准品重复该步骤5次点样于5个单独的血样收集区域内。之后室温干燥约2个小时直至滤纸片干透。将干燥后的干血斑片封存于包含干燥剂的样品袋中,存储于-80℃直至使用。
在检测前利用打孔仪对上述干血斑片进行打孔,或者利用剪刀剪切出全部滤纸片区域对所述干血斑片进行取样以得到一个或多个直径在1mm-10mm之间的干血样本,所述标准品的一个或多个干血样本的总面积之和等于待测干血样本的总面积之和。
打孔取样方式以及剪切取样方式的比较:
对于标准品干血样本,使用100%甲醇作为溶血试剂,在室温下溶解2个小时。之后取复溶溶液,加入检测试剂,之后按照试剂盒的操作步骤以及Amorsino460自动化生化仪的相应检测程序对特定的血液成分进行检测(其中,所取的复溶溶液和所增加的检测试剂的体积必须和检测待测干血样本时保持一致)。
同时,分别取450μl上文所述的第一标准品、第二标准品…第N个标准品,经离心,取150μl上清,加入检测试剂,之后按照试剂盒(九强)的操作步骤以及Amorsino 460自动化生化仪的相应检测程序对特定的血液成分进行检测。
结果显示,依据全血血清检测得到的特定的血液成分的测量值与其依据理论计算得到的实际值(例如Bio-Rad 641/642中各血液成分的浓度乘以45%)基本无偏差。
对于第一标准品、第二标准品…第N个标准品对应的标准品干血样本中特定血液成分的检测,将其结果作为纵轴,将对应标准品中特定血液成分的实际值(血清真值)作为横轴作图,并根据数据点之间的趋势获得校准曲线如图9-10所示。
其中图9A-9C中所示的校准曲线为通过打孔方法(通过打孔仪取八个直径约为3mm的含血区域)对标准品干血样本进行取样时得到的。其中如图所示,TC的校准曲线为y=0.5834x+2.7557,其中R2=0.9671;TG的校准曲线为y=0.8363x+0.1622,其中R2=0.9729;LDL-C的校准曲线为y=0.6171x+1.6813,其中R2=0.9763。
图10A-10C中所示的校准曲线为通过剪切方法(剪切三个直径约为10mm的含血区域)对标准品干血样本进行取样时得到的。其中如图所示,TC的校准曲线为y=0.6143x+3.8064,其中R2=0.9973;TG的校准曲线为y=0.9732x+0.4463,其中R2=0.9863;LDL-C的校准曲线为y=0.5175x+2.8873,其中R2=0.9959。需要注意的是:图9A-9C以及图10A-10C中的横坐标均代表血清样本检测值(单位:毫摩尔/升),而纵坐标则代表干血样本检测值(单位:毫摩尔/升)。
所以,根据上述DBS样本以及血清样本的检测值的相关性分析可知,无论是通过剪切取样方式还是通过打孔取样方式,上述校准曲线的相关系数均大于96%,而且TC的平均相对偏差均小于18%,TG的平均相对偏差均小于29%;而LDL的平均相对偏差均小于23%。
最后,可以根据以上实验,确定定标公式。其中直接比较法是工业界常用的定标方法,仅将样品和校准曲线直接比较,得出样品浓度。定标方程通常是简单线性方程,斜率与截距由方程直接得出,不探究斜率与截距来源。
定标公式
针对“DBS标准品打孔+样本打孔”的定标公式如下:
TC:y=x×A1-B1
其中y为TC的校准后结果,x为DBS样本测得的生化结果,A1为定标曲线斜率(其范围为5.3-6.3),B1为定标曲线截距(其范围为3.8-4.8)。
TG:y=x×A2-B2
其中y为TG的校准后结果,x为DBS样本测得的生化结果,A2为定标曲线斜率(其范围为4.1-5.1),B2为定标曲线截距(其范围为0.1-0.5)。
HDL-C:y=x×A3-B3
其中y为HDL的校准后结果,x为DBS样本测得的生化结果,A3为定标曲线斜率(其范围为4.4-5.3),B3为定标曲线截距(其范围为0.3-1.3)。
LDL-C:y=x×A4-B4
其中y为LDL的校准后结果,x为DBS样本测得的生化结果,A4为定标曲线斜率(其范围为5.2-6.5),B4为定标曲线截距(其范围为2.1-3.3)。
而如果DBS标准品和样本采用的取样体积不一致时,需要在上述方程的基础上利用体积校正系数进行体积校准。即通过将所述x值乘以Vt/Vs(其中所述待测干血样本中所包括的干血的体积为Vt,所述标准品干血样本中所包括的干血的体积为Vs)来进行所述体积校正。
综上所述,本发明提供的上述用于处理干血样本的方法、检测干血样本中特定血液成分的检测方法,可以利用高精度检测设备便捷地检测血液中各种成分(例如血脂四项)的含量,解决了采血困难、标本运输不便以及保存时间短等问题。
并且,本发明提出了一种快速、便捷、易于配制的溶血试剂,并且通过实验证明了本发明提出的溶血试剂能够有效地溶解干血中的特定血液成分,使得整个制样过程简化,从而使得大规模制样、检测成为可能。
进一步,本发明提供了一种针对上述干血样本及对应的特定血液成分的检测的标准品的制备方法,提高了整个实验的准确度。
最后,本发明的还为上述干血样本中特定血液成分的检测方法提供了一种校准方程的获得方法,从而能够更加准确快速的获得特定血液成分的实际值。
上述示意图仅仅为了示例的目的而示出的,并非是对本发明的限制。在一些情况下,可以根据需要添加或者减少其中的一些模块或装置。
应当注意,尽管在上文详细描述中提及了检测设备的若干装置或子装置,但是这种划分仅仅是示例性的而并非强制性的。实际上,根据本发明的实验例,上文描述的两个或更多装置的特征和功能可以在一个装置中具体化。反之,上文描述的一个装置的特征和功能可以进一步划分为由多个装置来具体化。
那些本技术领域的一般技术人员可以通过研究说明书、公开的内容及附图和所附的权利要求书,理解和实施对披露的实施方式的其他改变。在权利要求中,措词“包括”不排除其他的元素和步骤,并且措辞“一”、“一个”不排除复数。在发明的实际应用中,一个零件可能执行权利要求中所引用的多个技术特征的功能。权利要求中的任何附图标记不应理解为对权利要求的范围的限制。