CN102323225B - 一种检测低密度脂蛋白胆固醇的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物化学领域，公开了一种检测低密度脂蛋白胆固醇的方法和试剂盒。该方法将磷钨酸与琼脂胶组成pH值为6.1-6.2的混合液，待测样品在镁离子的作用下与混合液和聚乙二醇20000混合，得到悬浊液，然后在630nm波长下检测吸光度，与经上述相同处理的标准溶液比浊，计算待测样品的低密度脂蛋白胆固醇浓度。本发明所述试剂盒包括2-4g/L的氯化镁、6-10g/L的聚乙二醇20000、4-5g/L的磷钨酸和0.2-0.4g/L的琼脂胶。本发明所述方法能够不用去除杂蛋白，特异性的与低密度脂蛋白反应，使低密度脂蛋白胆固醇的检测简单、快速、准确，能够广泛应用于低密度脂蛋白胆固醇的检测中。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种检测低密度脂蛋白胆固醇的方法和试剂盒。
背景技术
胆固醇是人体不可缺少的重要物质，它不仅参与形成质膜，而且还是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激素的原料。在正常血液中，胆固醇主要与低密度脂蛋白(LDL)结合以脂蛋白形式在血液中运转，所结合的胆固醇称为低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，当细胞需要利用胆固醇合成质膜等物质时，细胞制造出LDL受体蛋白，并把它安装到质膜上。LDL与细胞表面受体结合后与溶酶体融合，将LDL上的胆固醇水解下来，用于质膜等物质合成。
随着生活水平的提高，人们的饮食趋于精致化，常常不自觉地摄取过量的、高于人体细胞需求的胆固醇，这使得LDL在血液中的浓度不断升高。而高浓度的LDL易被氧化成ox-LDL，然后被巨噬细胞吞噬，由于LDL上结合有胆固醇，所以会形成泡沫细胞沉积在动脉壁上，造成动脉粥样硬化，最终引发心脑血管疾病。有研究表明，血液中LDL-C浓度每升高1％，患心脑血管疾病的风险增加2-3％。因此，检测血液中LDL-C浓度对预防和治疗心脑血管疾病具有重要意义。
目前，为了适应于全自动生化分析仪的普遍应用，出现了许多检测LDL-C的方法。如抑制法，它的反应原理是采用一种表面活性剂，使高密度脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇和乳糜微粒受到抑制，使其结合的胆固醇不水解，而LDL-C结合的胆固醇水解下来，接着通过胆固醇氧化酶、过氧化物酶生成醌型有色化合物，然后检测吸光度计算LDL-C的浓度。还有一种是利用两种表面活性剂对高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇和乳糜微粒的亲和力不同建立的消除法，它的反应原理是多聚阴离子与低密度脂蛋白胆固醇和表面活性剂I结合，在缺乏偶联剂时不与胆固醇反应，而高密度脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇和乳糜微粒反应生成过氧化氢被消除，加入表面活性剂II使低密度脂蛋白胆固醇水解出胆固醇，这时整个反应体系中产物为低密度脂蛋白胆固醇，通过胆固醇显色程度测定低密度脂蛋白胆固醇含量。但是，上述方法中所提及的表面活性剂均未公开，并且同时需要精密的全自动生化仪进行严格操作，这就使其在检测LDL-C中不能被广泛应用。
为了能够使检测方法广泛应用，特别是能够在一些基层医疗单位应用，现有技术利用沉淀剂与低密度脂蛋白反应生成悬浊液，然后检测吸光度，由于反应产生的悬浊液吸光度与低密度脂蛋白胆固醇的浓度呈正比，所以通过比浊法计算就可以得到检测结果。然而，这种沉淀剂法需要将血样中干扰检测的球蛋白、高密度脂蛋白等物质除去，使检测步骤繁琐、复杂，不利于快速检测。同时，沉淀剂法在准确度上略低于抑制法和消除法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测低密度脂蛋白胆固醇的方法和试剂盒，使得该方法和试剂盒能够不用除去血样中干扰物质就能检测，并且获得较高准确度。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种检测低密度脂蛋白胆固醇的方法，将磷钨酸与琼脂胶组成pH值为6.1-6.2的混合液，待测样品在镁离子的作用下与混合液和聚乙二醇20000混合，得到悬浊液，然后在630nm波长下检测吸光度，与经上述相同处理的标准溶液比浊，计算待测样品的低密度脂蛋白胆固醇浓度。
其中，样品低密度脂蛋白胆固醇浓度(mmol/L)＝标准溶液浓度×A样/A标，所述待测样品、混合液和聚乙二醇20000的体积比为1∶48∶12。
本发明所述混合液中琼脂胶的浓度为0.2-0.4g/L，所述混合液中磷钨酸的浓度为4-5g/L，所述镁离子浓度为2-4g/L，优选采用氯化镁溶液，所述聚乙二醇20000浓度为6-10g/L。
现有沉淀剂法是利用低密度脂蛋白(LDL)与多聚阴离子和二价阳离子反应生成沉淀颗粒悬浊液的原理，通过比浊法检测低密度脂蛋白胆固醇的浓度。但是，由于现有沉淀剂法中采用的沉淀剂是非特异性的，所以血样中球蛋白、高密度脂蛋白等干扰蛋白同样能与其反应生成悬浊液，对检测造成干扰，因而需要提前去除干扰蛋白，这样就使检测变得繁琐复杂。此外，由于干扰蛋白去除的不彻底，使得现有沉淀剂法的检测结果也出现偏差。本发明针对这一问题，选择一种新型联合沉淀剂，即磷钨酸、氯化镁和聚乙二醇20000。该联合沉淀剂具有只与LDL反应的特异性，因而可以不用去除杂蛋白，使检测简单、准确。其中，磷钨酸为多聚阴离子，而氯化镁中的镁离子为二价阳离子，聚乙二醇20000具有协同沉淀的作用。同时，本发明在检测时还加入琼脂胶，琼脂胶为溶胶性长链大分子物质，能够促使反应生成的沉淀颗粒均匀分散于溶液中，防止产生大颗粒沉淀，使检测更加准确。
由于低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)是结合在LDL上的，所以LDL反应产生的悬浊液吸光度与LDL-C的浓度呈正比，只要通过与标准溶液比浊即可检测出LDL-C的浓度。本发明所述标准溶液为低密度脂蛋白胆固醇浓度为2.6mmol/L的灭活人血清或猪血清。
本发明还提供了一种检测低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，包括：
2-4g/L的氯化镁、6-10g/L的聚乙二醇20000、4-5g/L的磷钨酸和0.2-0.4g/L的琼脂胶。
作为优选，本发明所述试剂盒还包括：7-9g/L的氢氧化钠、0.5-1.0g/L的叠氮钠和标准溶液。其中，氢氧化钠用于调节检测时试剂的pH值，而叠氮钠作为防腐剂保证试剂稳定性，所述标准溶液为低密度脂蛋白胆固醇浓度为2.6mmol/L的灭活人血清或猪血清。
本发明所述试剂盒可以配制成双试剂，也可以配制成单试剂。配制成双试剂时，由4-5g/L的磷钨酸、7-9g/L的氢氧化钠、0.2-0.4g/L的琼脂胶和0.5-1.0g/L的叠氮钠组成试剂1；由2-4g/L的氯化镁、6-10g/L的聚乙二醇20000和0.5-1.0g/L的叠氮钠组成试剂2；由低密度脂蛋白胆固醇浓度为2.6mmol/L的灭活人血清或猪血清组成标准溶液。
当配制成单试剂时，由4-5g/L的磷钨酸、7-9g/L的氢氧化钠、0.2-0.4g/L的琼脂胶、2-4g/L的氯化镁、6-10g/L的聚乙二醇20000和0.5-1.0g/L的叠氮钠组成单一试剂；由低密度脂蛋白胆固醇浓度为2.6mmol/L的灭活人血清或猪血清组成标准溶液。
本发明所述方法检测LDL-C浓度具有较高准确度和精密度，试验结果显示，本发明所述方法检测的结果与采用日本和光进口LDL-C液体双试剂试剂盒(抑制法)检测结果无明显差异。此外，本发明对同一样品进行重复性检测，各结果之间的标准差率(变异系数)为1.46％，小于标准的3％。上述试验结果表明本发明具有很高的准确度和精密度。
由以上技术方案可知，本发明所述方法能够不用去除杂蛋白，特异性的与LDL反应，使LDL-C的检测简单、快速、准确，能够广泛应用于LDL-C的检测中。
具体实施方式
本发明公开了一种检测低密度脂蛋白胆固醇的方法和试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法及试剂盒已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的一种检测低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒和方法做进一步说明。
实施例1：本发明所述方法
将磷钨酸与琼脂胶组成混合液(磷钨酸浓度为4.4g/L，琼脂胶浓度为0.25g/L、pH 6.1)，在浓度为3g/L的氯化镁溶液中，待测样品与混合液和聚乙二醇20000(8g/L)按体积比，待测样品∶混合液∶聚乙二醇20000＝1∶48∶12的比例混合，得到的悬浊液在630nm波长下检测吸光度A样，然后与经上述相同处理的标准溶液(低密度脂蛋白胆固醇浓度为2.6mmol/L的灭活人血清)的A标比浊，计算待测样品的LDL-C浓度，公式为样品LDL-C浓度(mmol/L)＝标准溶液浓度(2.6mmol/L)×A样/A标。
实施例2：本发明所述方法
将磷钨酸与琼脂胶组成混合液(磷钨酸浓度为4g/L，琼脂胶浓度为0.3g/L、pH 6.2)，在浓度为2g/L的氯化镁溶液中，待测样品与混合液和聚乙二醇20000(6g/L)按体积比，待测样品∶混合液∶聚乙二醇20000＝1∶48∶12的比例混合，得到的悬浊液在630nm波长下检测吸光度A样，然后与经上述相同处理的标准溶液(低密度脂蛋白胆固醇浓度为2.6mmol/L的灭活人血清)的A标比浊，计算待测样品的LDL-C浓度，公式为样品LDL-C浓度(mmol/L)＝标准溶液浓度(2.6mmol/L)×A样/A标。
实施例3：本发明所述方法
将磷钨酸与琼脂胶组成混合液(磷钨酸浓度为5g/L，琼脂胶浓度为0.4g/L、pH 6.1)，在浓度为4g/L的氯化镁溶液中，待测样品与混合液和聚乙二醇20000(10g/L)按体积比，待测样品∶混合液∶聚乙二醇20000＝1∶48∶12的比例混合，得到的悬浊液在630nm波长下检测吸光度A样，然后与经上述相同处理的标准溶液(低密度脂蛋白胆固醇浓度为2.6mmol/L的灭活人血清)的A标比浊，计算待测样品的LDL-C浓度，公式为样品LDL-C浓度(mmol/L)＝标准溶液浓度(2.6mmol/L)×A样/A标。
实施例4：本发明所述方法的准确度(符合度)分析
试验仪器：Olympus400全自动生化分析仪；
检测样品：20名体检者血样；
对比方法试剂盒：日本和光进口LDL-C液体双试剂试剂盒(抑制法)；
Olympus400全自动生化分析仪参数设置见表1。
表1 Olympus400全自动生化分析仪参数
| 方法 | 波长 | 反应方向 | 温度 | 测量时间 | 标准液浓度 | 样品量 | 线性 |
| 终点法 | 630nm | + | 37℃ | 300s | 2.6mmol/L | 5μL | 1.3-5.2mmol/L |
采用实施例1的检测方法以及日本和光进口LDL-C液体双试剂试剂盒对上述20名体检者血样分别进行检测。具体结果见表2。
表2 分析结果(mmol/L)
结果显示，根据检测结果计算出的R值为0.993，实施例2、3检测方法的R值同样大于0.99，表明本发明所述方法检测结果与日本和光试剂盒检测结果无明显差异，具有较高准确度(符合度)。
实施例5：本发明所述方法的精密度分析
试验仪器：日立7080全自动生化分析仪；
检测样品：任意一血清样品；
日立7080全自动生化分析仪设定：温度为37℃，反应方法为终点法，测定波长为630nm，反应方向为正反应，孵育180s。
采用实施例1至实施例3的检测方法分别对同一待测样品重复检测10次，其中，实施例1检测方法的检测结果见表3。
表3 检测样品LDL-C浓度(10次)及标准差率(变异系数)
结果显示，标准差率为1.46％，小于标准的3％，实施例2、3检测方法的检测结果的标准差率同样小于3％，表明本发明所述方法具有高精密度。
实施例6：本发明所述方法的线性分析
试验仪器：日立7080全自动生化分析仪；
检测样品：高LDL-C血清样品(5.2mmol/L)；
日立7080全自动生化分析仪设定：温度为37℃，反应方法为终点法，测定波长为630nm，反应方向为正反应，孵育180s。
将高LDL-C血清样品稀释成4个不同的浓度，依次为1.30mmol/L、2.60mmol/L、3.90mmol/L、5.20mmol/L，采用实施例1至实施例3的检测方法对上述样品的每个浓度进行2次检测，根据Excel中的公式计算R值，其中，实施例1检测方法的检测结果见表4。
表4 线性试验结果
结果显示，根据检测结果计算出的R值为0.998，接近于1，实施例2、3检测方法的R值同样大于0.99，表明本发明所述方法在1.30-5.20mmol/L的范围内具有良好的线性度。
实施例7：本发明所述试剂盒
试剂1：4.4g/L的磷钨酸、8g/L的氢氧化钠、0.25g/L的琼脂胶和0.75g/L的叠氮钠；
试剂2：3g/L的氯化镁、8g/L的聚乙二醇20000和0.75g/L的叠氮钠；
标准液：低密度脂蛋白胆固醇浓度为2.6mmol/L的人血清。
实施例8：本发明所述试剂盒
单试剂：4g/L的磷钨酸、7g/L的氢氧化钠、0.3g/L的琼脂胶、0.5g/L的叠氮钠、2g/L的氯化镁和6g/L的聚乙二醇20000；
标准液：低密度脂蛋白胆固醇浓度为2.6mmol/L的猪血清。
实施例9：本发明所述试剂盒
试剂1：5g/L的磷钨酸、9g/L的氢氧化钠、0.4g/L的琼脂胶和1.0g/L的叠氮钠；
试剂2：4g/L的氯化镁、10g/L的聚乙二醇20000和1.0g/L的叠氮钠；
标准液：低密度脂蛋白胆固醇浓度为2.6mmol/L的人血清。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种检测低密度脂蛋白胆固醇的方法，其特征在于，将磷钨酸与琼脂胶组成pH值为6.1-6.2的混合液，所述混合液中琼脂胶的浓度为0.2-0.4g/L，磷钨酸的浓度为4-5g/L，待测样品在镁离子的作用下与混合液和聚乙二醇20000混合，得到悬浊液，然后在630nm波长下检测吸光度，与经上述相同处理的标准溶液比浊，计算待测样品的低密度脂蛋白胆固醇浓度；
其中，所述镁离子浓度为2-4g/L，所述聚乙二醇20000浓度为6-10g/L。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述待测样品、混合液和聚乙二醇20000的体积比为1:48:12。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述标准溶液为低密度脂蛋白胆固醇浓度为2.6mmol/L的灭活人血清或猪血清。
4.一种检测低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，其特征在于，包括：
2-4g/L的氯化镁、6-10g/L的聚乙二醇20000、4-5g/L的磷钨酸和0.2-0.4g/L的琼脂胶。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，还包括：
7-9g/L的氢氧化钠、0.5-1.0g/L的叠氮钠和标准溶液。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述标准溶液为低密度脂蛋白胆固醇浓度为2.6mmol/L的灭活人血清或猪血清。
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