CN106591340B - 一种转基因生物及其产品基因定性检测的标准质粒分子 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转基因生物及其产品基因定性检测的标准质粒分子，属于转基因生物检测技术领域。本发明将17个基因按照特定顺序拼接得到质粒标准分子的核心序列。将质粒标准分子的核心序列与骨架载体连接后，得到质粒标准分子，所得质粒标准分子作为阳性对照用于检测带有不同参数的转基因作物时，质粒标准分子均能正确检测出每个转化事件对应的外源基因及内标准基因。
Description
技术领域
本发明涉及一种转基因生物及其产品基因定性检测的标准质粒分子，尤其是一种同时适用于5种转基因作物17个基因定性检测的标准质粒分子及其构建，属于转基因生物检测技术领域。
背景技术
目前，越来越多的转基因作物已进行大规模商业化种植及应用。世界各国都在完善对转基因产品的生物***，转基因生物检测是***的重要组成部分，而核酸检测是进行转基因成分检测的最有效、常规方法。为防止假阳性的出现，现行检测标准要求必须在核酸检测过程中设置阳性标准物质对照(简称阳性对照)，以进行对检测过程和结果的监控。
目前通常使用的阳性标准物质是由未加工的原材料制备而成的基体标准物质，然而，由于其制备复杂，价格昂贵，且不利于长期储存。因此，基体标准物质已成为限制转基因产品检测的瓶颈，急需研制基体标准物质的替代品。
标准分子是一种含有转基因检测外源***基因和/或内标准基因的特异性片段的线性化重组质粒分子，因此在一个标准分子中可以检测到多个目的基因。质粒标准分子在转基因成分检测中作为标准物质替代物已得到国际公认并被广泛研究和使用。目前已报道一些用于转基因检测的质粒标准分子，但这些质粒标准分子只是针对某个或少数几个外源基因或通用元件序列进行检测，因此需要构建包含大部分检测参数的质粒标准分子。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时适用于5种转基因作物17个基因定性检测的标准质粒分子，满足转基因作物检测要求。在转基因筛选检测时，用其作为阳性对照可检测多种转基因作物，达到使用单个阳性对照检测多个外源基因的目的。
所述质粒标准分子的核心序列如SEQ ID NO.1所示。
所述质粒标准分子的构建方法，是将P-CaMV35S、P-FMV35S、P-NOS、T-NOS、T-CaMV35S、NPTII、HPT、PMI、bar、pat、CP4-epsps、Bt、Lectin、zSSIIb、SPS、HMG I/Y、Sad1这17个序列按照顺序拼接组成。
本发明通过分析目前国际商业化转基因作物的转化事件中的外源基因、通用元件、标记基因，筛选出检测覆盖率可达95％的12个检测参数(通用元件P-CaMV35S、P-FMV35S、P-NOS、T-NOS、T-CaMV35S，标记基因NPTII、HPT、PMI、bar、pat片段，抗除草剂基因CP4-epsps，抗虫基因Bt，5个内标准基因Lectin、zSSIIb、SPS、HMG I/Y、Sad1)，按照特定顺序，将上述片段拼接得到质粒标准分子的核心序列。将质粒标准分子的核心序列与骨架载体连接后，得到质粒标准分子，利用现行转基因成分检测标准中的17个参数的检测引物对所得质粒标准分子进行PCR扩增时，所有引物均能扩增出特异性的PCR条带；PCR扩增灵敏度为50拷贝，并具有很好的重现性、稳定性，完全可以作为阳性对照用于实际样品的定性PCR分析。将所得质粒标准分子作为阳性对照用于检测带有不同参数的转基因作物(A2704-12、GTS40-3-2、MON89788、BT11、BT176、MIR162、MON863、MON89034、NK603、T25、TT51-1、科丰6、克螟稻、GT73、MS1、TOPAS19/2、LL25、MON1445、MON15985)时，质粒标准分子均能正确检测出每个转化事件对应的外源基因及内标准基因。
附图说明
图1标准分子候选序列的拼接顺序示意图。
图2检测标准中17对引物对候选序列1、2、3PCR扩增结果。
图3 PSM17质粒标准分子基因结构示意图。
图4 PSM17的检测灵敏度分析；1，DL2000DNA marker；2-8，PSM17拷贝数为1000、500、100、50、10、5、1拷贝的模板的PCR结果。
图5 PSM17的检测重现性分析；1，DL2000DNA marker；2-4，1.32×106拷贝模板扩增的3个平行；5-7，1.32×108拷贝模板扩增的3个平行；8-10，1.32×1010拷贝模板扩增的3个平行。
图6 PSM17在实际检测中的适用性分析；1，DL2000DNA marker；2-21的模板分别为PSM17、A2704-12、GTS40-3-2、MON89788、BT11、BT176、MIR162、MON863、MON89034、NK603、T25、TT51-1、科丰6、克螟稻、GT73、MS1、TOPAS19/2、LL25、MON1445、MON15985。
具体实施方式
实施例1.质粒标准分子构建
利用已公布的转基因植物相关检测国家标准，结合GenBank数据库查找并获得P-CaMV35S、P-FMV35S、P-NOS、T-NOS、T-CaMV35S、NPTII、HPT、PMI、bar、pat、CP4-epsps、Bt、Lectin、zSSIIb、SPS、HMG I/Y、Sad1片段。由于将上述17个序列拼接组成的新序列有可能产生影响PCR扩增的高GC含量序列或发卡结构等，所以将17个目的片段按照不同顺序拼接成3个标准分子候选序列，分别命名为候选序列1、2、3，拼接顺序见图1，得到的组合序列长度均为4208bp，并通过基因合成方式获得此3条序列，将其与克隆载体pMD18T(2692bp)相连，获得3个长度均为6900bp的候选质粒标准分子，并测序验证序列正确性后，转化入大肠杆菌感受态增殖提取相应质粒，以此3个质粒标准分子为模板进行PCR扩增，选择出适合所有17个检测参数扩增的模板质粒。
实施例2.质粒标准分子PCR扩增验证
由于本发明质粒标准分子最终目的是将其作为阳性对照应用于转基因成分定性PCR检测中，所以应当选取我国现行的转基因成分检测标准对其进行效果验证。因此利用引自现行转基因成分检测标准中的17个参数的检测引物(表1)，分别对实施例1所得3个标准质粒分子为模板进行PCR扩增，反应体系为：总体积为25μL，其中10倍Taq缓冲液5μL，dNTPs(2.5mM)2.5μL，上下游引物(10μM)各0.5μL，模板50ng，用ddH2O补足至50μL；反应程序为：95℃5min，35个循环(95℃30s，56-63℃30s，72℃30s)，72℃5min，各引物的具体退火温度见表1。结果如图2所示：对候选序列1分别以17对引物扩增时，所有引物均能扩增出特异性的PCR条带；对候选序列2分别以17对引物扩增时，引物P-CaMV35S-F/R和NPTII-F/R的扩增产物出现非特异扩增条带；对候选序列3分别以17对引物扩增时，引物P-CaMV35S-F/R和NPTII-F/R的扩增产物出现非特异扩增条带，而引物Bt-F/R的扩增产物出现弥散条带。
因此，将候选序列1确定为“质粒标准分子核心序列”，具体序列见SEQ ID NO.1，其与pMD18T载体连接后，命名为“PSM17”，其完整的载体结构见图3，对应菌种-70℃保存。
表1质粒标准分子PCR扩增验证所用引物
实施例3.质粒标准分子PSM17的检测灵敏度的确定
为了验证PSM17定性PCR检测过程中的灵敏度，制备了7个不同浓度的DNA模板样品(1000、500、100、50、10、5、1拷贝)，并利用17对引物分别对“PSM17”进行PCR扩增。结果显示，PSM17针对不同引物的灵敏度可以达到50或10拷贝(图4)，综合结果确定其灵敏度为50拷贝。
实施例4.质粒标准分子PSM17的检测重现性确定
为了验证检测体系的重现性，分别以不同拷贝数(1.32×106拷贝、1.32×108拷贝、1.32×1010拷贝)的标准质粒分子DNA作为模板，每个模板设3个平行，进行3次PCR重复性测试(PCR体系参见实施例2)。3个平行反应体系间和3次重复间PCR均能检测到目的条带(图5)，显示PSM17的PCR检测具有很好的重现性，具有很高的稳定性，完全可以作为阳性对照用于实际样品的定性PCR分析。
实施例5.质粒标准分子在实际检测中的适用情况
考察标准物质的适用性，是用研制的标准物质作为阳性对照检测已知结果的实际样品，以验证该标准物质的可行性和有效性。根据我国现行转基因成分检测标准，以本发明所得PSM16质粒标准分子为阳性对照样品，验证其在转基因成分PCR检测过程中的适用性。
本实验中，选取带有不同参数的转基因作物(A2704-12、GTS40-3-2、MON89788、BT11、BT176、MIR162、MON863、MON89034、NK603、T25、TT51-1、科丰6、克螟稻、GT73、MS1、TOPAS19/2、LL25、MON1445、MON15985)作为模板，以PSM17为阳性对照，利用检测标准中的17对引物，进行定性PCR检测(PCR体系参见实施例2)，所用检测样品及检测结果汇总见表2，PCR检测电泳结果见图6，结果表明：PSM17质粒标准分子均能正确检测出每个转化事件对应的外源基因及内标准基因。
表2
注：表2中，“+”代表PCR结果为阳性；“-”代表PCR结果为阴性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 东北农业大学
<120> 一种转基因生物及其产品基因定性检测的标准质粒分子
<160> 35
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 4208
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat cattcaagat gcctctgccg 60
acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc 120
caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgatacttc cactgacgta agggatgacg 180
cacaatccca ctatcaagac atccaccgaa gacttaaagt tagtgggcat ctttgaaata 240
atctttgtca acatcgagca gctggcttgt ggggaccaga caaaaaagga atggtgcaga 300
attgttaggc gcacctacca aaagcatctt tgcatttatt gcaaagataa agcagattcc 360
tctagtacaa gtggggaaca aaataacgtg gaaaagagct gtcctgccgt tttacgtttg 420
gaactgacag aaccgcaacg ttgaaggagc cactcagccg cgggtttctg gagtttaatg 480
agctaagcac atacgtcaga aaccattatt gcgcgttcaa aagtcgccta aggtcactat 540
cagctagcaa atatttcttg tcaaaaatgc tccactgacg ttccataaga atcctgttgc 600
cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa 660
catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata 720
catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataagt ttcgctcatg 780
tgttgagcgt ataagaaacc cttagtatgt atttgtattt gtaaaatact tctatcaata 840
aaatttctaa ttcctaaaac caaaatccag tactaaaatc cagatcccca ctgggcacaa 900
cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt 960
ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg 1020
ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa 1080
gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac 1140
cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcga agtgcttgac attggggagt 1200
ttagcgagag cctgacctat tgcatctccc gccgtgcaca gggtgtcacg ttgcaagacc 1260
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gggattccca atacgaggtc gccaacatct agcaaaacgg cgttgactga actttatggt 1680
atggaaaatc cgtccagcca gccgatggcc gagctgtgga tgggcgcaca tccgaaaagc 1740
agttcacgag tgcagaatgc cgccggagat atcgtttcac tgcgtgatgt gattgagagt 1800
gataaatcga ctctgctcgg agaggccgtt gccaaacgct ttggcgaact gcctttcctg 1860
ttcaaagtat tatgcgcagc acagccactc tccattcagg ttcatccaaa cgaaggcacg 1920
caacgcctac gactggacgg ccgagtcgac cgtgtacgtc tccccccgcc accagcggac 1980
gggactgggc tccacgctct acacccacct gctgaagtcc ctggaggcac agggcttcaa 2040
gagcgtggtc gctgtcatcg ggctgcccaa cgacccgagc gtgcgcatgc acgaggcgct 2100
cggatatgcc ccccgcggca tgctgcgggc ggccggcttc aagcacggga actggcatga 2160
cgtgggtttc tgggaaggca cgcaacgcct acgactggac ggccgagtcg accgtgtacg 2220
tctccccccg ccaccagcgg acgggactgg gctccacgct ctacacccac ctgctgaagt 2280
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ggtgcgtaca ttgtgcgcat tccgtgcggt ccaagggaca agtacctccg taaagaggcc 3600
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gaagaagcag aagacggaat ccgaggcggt taaagccgat gttgaacctg cggaggctcc 3900
ggctggggag cggagagggc gtggaatggc ctctaatcat tgttatgatg agatttgaac 3960
ttttacaaat tatgatattg ttgtctttga atccttggta ataatgatga tgtatgagta 4020
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<213> 人工序列
<400> 29
tcgatttctc tcttggtgac agg 23
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
atctgtttac tcgtcaagtg tcatctc 27
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gccatggatt acatatggca aga 23
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
tccttccgtt tcctcgcc 18
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ttccacgccc tctccgct 18
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
tggcctctaa tcattgttat gatg 24
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
ttgaggtgag tcagaatgtt gttc 24
Claims (6)
1.一种质粒标准分子，其特征在于，由骨架载体和核心序列组成，核心序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种质粒标准分子，其特征在于，骨架载体为pMD18T。
3.一种构建权利要求1或2所述的质粒标准分子的方法，其特征在于，是将P-CaMV35S、P-FMV35S、P-NOS、T-NOS、T-CaMV35S、NPTII、HPT、PMI、bar、pat、CP4-epsps、Bt、Lectin、zSSIIb、SPS、HMG I/Y、Sad1片段这17个序列按照顺序拼接组成。
4.权利要求1或2所述的质粒标准分子在转基因成分检测中的应用。
5.含有权利要求1或2所述的质粒标准分子的试剂盒。
6.权利要求5所述的试剂盒在转基因成分检测中的应用。
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| 新型转基因标准物质与标记基因检测方法研究;岳运锋;《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》;20120715(第7期);摘要及第55-56页 * |
| 用于四种主要作物转基因筛查检测的标准质粒分子的构建及应用;徐俊锋等;《农业生物技术学报》;20150925;第23卷(第9期);1167-1177页 * |
| 转基因产品检测标准物质研究;张丽;《中国博士学位论文全文数据库基础科学辑》;20121015;7-8页1.2.2及93-100页4.2 * |
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