CN103215346A - 一种用于转基因水稻筛查的重组标准质粒及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于转基因水稻筛查的重组标准质粒，由如下方法获得：利用重叠PCR技术将SEQ ID No.1所示的CaMV35S基因、SEQ ID No.2所示的SPS基因、SEQ ID No.3所示的Bt基因、SEQ IDNo.4所示的NPTⅡ基因、SEQ ID No.5所示的Htp基因、SEQ ID No.6所示的Bar基因和SEQ ID No.7所示的NOS基因依次连接获得融合片段，再利用分子克隆技术将所得融合片段克隆到载体pUC-19中，获得所述重组标准质粒，记为pUC-RS。该重组标准质粒可以替代转基因水稻筛查检测中的阳性标准品，用于对转基因水稻定性PCR筛查检测，很好地解决了转基因水稻筛查检测过程中阳性标准品匮乏的问题。
Description
（一）技术领域
本发明涉及一种用于转基因水稻筛查的重组标准质粒，以及含有该重组标准质粒的试剂盒。
（二）背景技术
自首例转基因番茄“FLAVR SAVR”于1994年在美国批准商业化生产以来，随着转基因技术迅速发展，许多有价值的外源基因导入了植物中，越来越多的转基因作物被批准在不同国家和地区商业化种植。对水稻而言，目前有许多抗虫、抗病、耐除草剂及营养成分改良的转基因水稻研发成功，转基因水稻品系：KF6、TT51和KMD1为我国拥有自主知识产权的抗虫Bt水稻，其中转基因抗虫水稻华恢1号（TT51）在2009年，我国农业部颁发了其在湖北省生产应用的安全证书。
为保障在农产品进出口贸易中的利益,各国相继建立转基因标识制度,对转基因检测技术的准确度和灵敏度提出了严格的要求，目前对转基因作物及其产品的检测主要有蛋白质水平检测和核酸水平检测，而由于核酸的提取、保存及稳定性等方面的优势，使得基于核酸检测的转基因检测技术得到快速发展,其中以聚合酶链式反应(PCR)技术发展得最快，转基因作物PCR检测方法又分为4个层次，分别为筛查检测、基因检测、构建特异性检测和转化体特异性检测，在日常的检测工作中，由于转基因样品量较大，转基因的筛查工作显得尤为重要，而阳性标准品的缺乏无法满足转基因***中筛查工作的需求，因此开发一种针对转基因水稻筛查检测用质粒标准分子具有重要的意义。
阳性质粒分子的概念由日本科学家Kuribara H等于2002年提出，它是指一种含有转基因作物检测的目的外源基因和内标准基因的特异性扩增片段的线性化的重组质粒分子。阳性质粒分子的优点主要是可以通过微生物进行大量培养，且操作容易，同一个阳性质粒分子可以同时包含多个外源目的基因，质粒DNA提取容易且纯度较高。转基因作物阳性质粒分子是转基因标准物质的一种。开发阳性质粒分子可以有效的解决检测工作中缺乏有证标准物质和阳性材料的难题。
（三）发明内容
本发明的目的是提供一种为转基因水稻筛查检测用重组标准质粒及其应用，满足转基因水稻***筛查检测工作中的需求。
本发明采用的技术方案是：
一种用于转基因水稻筛查的重组标准质粒，由如下方法获得：利用重叠PCR技术将SEQ ID No.1所示的CaMV35S基因、SEQ ID No.2所示的SPS基因、SEQ ID No.3所示的Bt基因、SEQ ID No.4所示的NPTⅡ基因、SEQ ID No.5所示的Htp基因、SEQ ID No.6所示的Bar基因和SEQ IDNo.7所示的NOS基因依次连接获得融合片段，再利用分子克隆技术将所得融合片段克隆到载体pUC-19中，获得所述重组标准质粒，记为pUC-RS。
CaMV35S基因序列如下（195bp）：
Gctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatc
SPS基因序列如下（290bp）：
Atctgtttactcgtcaagtgtcatctcctgaagtggactggagctatggggagcctactgaaatgttaacctccgg ttccactgacggagagggaagcggtgagagtgctggtgcgtacattgtgcgcattccgtgcggtccaagggacaagtacttccgtaaagaggccctgtggccttacctccaagagtttgtcgacggagctctcgcgcatatcctgaacatgtccaaggctctgggggaacaggttagcaatgggaagctggtcttgccatatgtaatcctaggc
Bt基因序列如下（301bp）：
Gaaggtttgagcaatctctaccaaatctatgcagagagcttcagagagtgggaagccgatcctactaacccagctctccgcgaggaaatgcgtattcaattcaacgacatgaacagcgccttgaccacagctatcccattgttcgcagtccagaactaccaagttcctctcttgtccgtgtacgttcaagcagctaatcttcacctcagcgtgcttcgagacgttagcgtgtttgggcaaaggtggggattcgatgctgcaaccatcaatagccgttacaacgaccttactaggctgatcg
NPTⅡ基因序列如下（325bp）：
Actgggcacaacagacaatcgttactaggctgatcgactgggcacaacagacaatcagctgctctgatgccgcygtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcgggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgc
Htp基因序列如下（472bp）：
Gaagtgcttgacattggggagttcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatct
Bar基因序列如下（430bp）：
Accatcgtcaaccactacatcgagacaagcacggtcaacttccgtaccgagccgcaggaaccgcaggagtggacggacgacctcgtccgtctgcgggagcgctatccctggctcgtcgccgaggtggacggcgaggtcgccggcatcgcctacgcgggcccctggaaggcatgcaacgcctacgactggacggccgagtcgaccgtgtacgtctccccccgccaccagcggacgggactgggctccacgctctacacccacctgctgaagtccctggaggcacagggcttcaagagcgtggtcgctgtcatcgggctgcccaacgacccgagcgtgcgcatgcacgaggcgctcggatatgccccccgcggcatgctgcgggcggccggcttcaagcacgggaactggcatgacgtgggtttctggcagc
NOS基因序列如下（180bp）：
Gaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataa
本发明根据目前转基因水稻中常用的外源元件：CaMV35S，Bt，NPTⅡ，Htp，Bar，NOS及水稻内标基因SPS的序列，设计相应的引物，利用重叠PCR技术将七个序列片段融合在一起，再利用分子克隆技术将融合片段克隆到pUC19载体中，获得重组标准质粒pUC-RS。
具体的，所述融合片段核苷酸序列如SEQ ID No.8所示（2193bp）：
gctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatcatctgtttactcgtcaagtgtcatctcctgaagtggactggagctatggggagcctactgaaatgttaacctccggttccactgacggagagggaagcggtgagagtgctggtgcgtacattgtgcgcattccgtgcggtccaagggacaagtacttccgtaaagaggccctgtggccttacctccaagagtttgtcgacggagctctcgcgcatatcctgaacatgtccaaggctctgggggaacaggttagcaatgggaagctggtcttgccatatgtaatcctaggcgaaggtttgagcaatctctaccaaatctatg cagagagcttcagagagtgggaagccgatcctactaacccagctctccgcgaggaaatgcgtattcaattcaacgacatgaacagcgccttgaccacagctatcccattgttcgcagtccagaactaccaagttcctctcttgtccgtgtacgttcaagcagctaatcttcacctcagcgtgcttcgagacgttagcgtgtttgggcaaaggtggggattcgatgctgcaaccatcaatagccgttacaacgaccttactaggctgatcgactgggcacaacagacaatcgttactaggctgatcgactgggcacaacagacaatcagctgctctgatgccgcygtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcgggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcgaagtgcttgacattggggagttcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatctaccatcgtcaaccactacatcgagacaagcacggtcaacttccgtaccgagccgcaggaaccgcaggagtggacggacgacctcgtccgtctgcgggagcgctatccctggctcgtcgccgaggtggacggcgaggtcgccggcatcgcctacgcgggcccctggaaggcatgcaacgcctacgactggacggccgagtcgaccgtgtacgtctccccccgccaccagcggacgggactgggctccacgctctacacccacctgctgaagtccctggaggcacagggcttcaagagcgtggtcgctgtcatcgggctgcccaacgacccgagcgtgcgcatgcacgaggcgctcggatatgccccccgcggcatgctgcgggcggccggcttcaagcacgggaactggcatgacgtgggtttctggcagcgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataa。
本发明所述重组标准质粒pUC-RS具体可按如下方法构建：
（1）利用GenBank数据库和相关文献检索，获得水稻内标准基因SPS及转基因水稻中常用到的外源元件；CaMV35S，Bt，NPTⅡ，Htp，Bar，NOS的序列。
所述的水稻内标准基因SPS，是指蔗糖磷酸合酶基因（GeneBankNo.U33175），在水稻基因组中高度保守，具有种间特异性、种内非特异性和单拷贝数等特点。
所述的转基因水稻中常用到的外源元件是指以下基因中的部分序列：CaMV35S：花椰菜花叶病毒35S启动子；Bt：Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ab/Cry1Ac融合基因的同源序列；NPTⅡ：新霉素磷酸转移酶基因；Htp：潮霉素磷酸转移酶基因；Bar：抗除草剂基因；NOS：胭脂碱合酶终止子。
（2）根据SPS基因序列及转基因水稻中常用到的外源元件；CaMV35S，Bt，NPTⅡ，Htp，Bar，NOS的序列，设计重叠PCR引物。
所述的重叠PCR引物，是指SPS基因序列及转基因水稻中常用到的外源元件；CaMV35S，Bt，NPTⅡ，Htp，Bar，NOS的序列完全相同或者互补的引物，使各目的片段达到无缝连接。
所述的重叠PCR引物序列如下：
35S-F：GCTCCTACAAATGCCATCATTGC
35S-R-add：gacgagtaaacagatGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC
SPS-F-add：acaatcccactatcATCTGTTTACTCGTCAAGTGTCATCTC
SPS-R-add：gctcaaaccttcGCCTAGGATTACATATGGCAAGA
Bt-F-add：atgtaatcctaggcGAAGGTTTGAGCAATCTCTAC
Bt-R-add：tgttgtgcccagtCGATCAGCCTAGTAAGGTCGT
Npt-F-add：ctaggctgatcgACTGGGCACAACAGACAATCG
Npt-R-add：aatgtcaagcacttcGCATCAGCCATGATGGATACTTT
Hpt-F-add：tcatggctgatgcGAAGTGCTTGACATTGGGGAGT
Hpt-R-add：tggttgacgatggtAGATGTTGGCGACCTCGTATT
Bar-F-add：tcgccaacatctACCATCGTCAACCACTACATCG
Bar-R-add：ggcaacaggattcGCTGCCAGAAACCCACGTCAT
Nos-F-add：ggtttctggcagcGAATCCTGTTGCCGGTCTTG
Nos-R：TTATCCTAGTTTGCGCGCTA。
（3）新的重组DNA片段的质粒分子克隆。
所述的分子克隆，指的是将上述得到的重组特异性DNA片段连接到质粒载体pUC19上，获得转基因标准阳性质粒分子pUC-RS，获得的质粒分子的外源全序列见图2。
（4）构建的重组标准质粒在转基因水稻筛查定性PCR中的验证。
所述的定性PCR验证，是指用定性PCR方法验证构建的重组标准质粒pUC-RS中能扩增出水稻内标准基因SPS特异序列以及转基因水稻中常用的元件（CaMV35S，Bt，NPTⅡ，Htp，Bar，NOS）序列，且pUC-RS中各特异性序列的检测灵敏度能满足定性PCR检测的要求。
本发明还涉及所述的重组标准质粒在转基因水稻筛查中的应用。
本发明还涉及一种用于转基因水稻筛查的检测试剂盒，主要包括所述的重组标准质粒（标准品）和特异性引物；所述特异性引物序列如下：
CaMV35S基因特异性引物：
35S-F：GCTCCTACAAATGCCATCATTGC
35S-R：GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC
SPS基因特异性引物：
SP S-F：ATCTGTTTACTCGTCAAGTGTCATCTC
SPS-R：GCCTAGGATTACATATGGCAAGA
Bt基因特异性引物：
Bt-F：GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC
Bt-R：CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT
NPTⅡ基因特异性引物：
Npt-F：ACTGGGCACAACAGACAATCG
Npt-R：GCATCAGCCATGATGGATACTTT
Htp基因特异性引物：
Hpt-F：GAAGTGCTTGACATTGGGGAGT
Hpt-R：AGATGTTGGCGACCTCGTATT
Bar基因特异性引物：
Bar-F：ACCATCGTCAACCACTACATCG
Bar-R：GCTGCCAGAAACCCACGTCAT
NOS基因特异性引物：
Nos-F：GAATCCTGTTGCCGGTCTTG
Nos-R：TTATCCTAGTTTGCGCGCTA。
该试剂盒的关键在于重组标准质粒和特异性引物的设计，试剂盒中其他组成，例如PCR反应试剂，可按本领域常规进行选择。PCR反应试剂包括PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶等，其中PCR缓冲液可采用市购商品，也可自行配制，例如将Tris-HCl、KCl、MgCl2 等按比例混合进行配制，进行检测时，将PCR反应试剂和扩增引物混合，再加入待测样品或标准品，即可进行PCR扩增反应，PCR扩增产物用2%的琼脂糖跑胶，若样品的PCR扩增产物出现290bp条带，表示待测样品中含有水稻成分（否则不含有水稻成分）；进一步，若还出现有195bp、301bp、325bp、472bp、430bp或180bp的条带，则可判断含有相应的转基因元件。
本发明利用重叠PCR和分子克隆技术首次构建了含有水稻内标准基因SPS以及同时含有六个转基因水稻中常用的元件（CaMV35S，Bt，NPTⅡ，Htp，Bar，NOS）序列的重组标准质粒pUC-RS。该重组标准质粒可以替代转基因水稻筛查检测中的阳性标准品，用于对转基因水稻定性PCR筛查检测，很好地解决了转基因水稻筛查检测过程中阳性标准品匮乏的问题。
（四）附图说明
图1为本发明构建的标准质粒分子的过程与示意图
图2为本发明构建的标准质粒分子pUC-RS的全部外源序列，其中SPS代表水稻内标准基因SPS的特异序列，35S、Bt、NPTII、Htp、Bar、NOS分别代表转基因水稻中常用的一些元件的特异序列；阴影部分序列为重叠PCR引物中的重叠部分；实线尖头序列为定性PCR引物。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：重组标准质粒pUC-RS的构建
一、实验材料
转基因水稻LL RICE62和KMD1。
二、实验试剂
pUC19载体、ExTaq DNA聚合酶及其缓冲液、dNTPs、Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；基因组提取试剂盒及定量PCR试剂盒购自上海英俊生物工程技术服务有限公司；PCR产物回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DH5α感受态菌株购自北京全式金生物技术有限公司；生化试剂购自上海生工生物技术有限公司；引物由上海英俊生物工程技术服务有限公司合成。
三、主要仪器设备
PCR仪（德国Biometra）、凝胶成像***（美国GE）、Ultrospec1100pro紫外分光光度计（美国GE）、其他仪器包括：恒温水浴锅，离心机，
恒温培养箱，电子天平，微量移液器等。
四、实验方法和过程
1、重叠PCR引物设计
利用GenBank及相关文献资料查询获得水稻内标准基因SPS、转基因水稻常用的元件（CaMV35S,Bt,NPTⅡ,Htp,Bar,NOS）序列；利用PrimerPremier5软件，设计重叠PCR引物，分别用于扩增水稻内标准基因SPS、常用元件（CaMV35S，Bt，NPTⅡ，Htp，Bar，NOS）序列（SEQ ID No.1~7）。引物序列见表1。
表1：构建标准质粒分子pMD-KTK的重叠PCR引物
2、转基因水稻中常用元件及水稻内标准基因SPS的扩增
利用表1中的引物对相应的转基因水稻进行扩增，PCR体系为：10×PCR缓冲液（Mg2+Plus），200mmol dNTPs，0.5mmol正向引物，0.5mmol反向引物，1.25U的Taq DNA聚合酶和DNA模板。
PCR程序为95℃5min预变性；94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃延伸7min。
PCR产物用2%的琼脂糖跑胶并拍照。得到转基因水稻常用元件特异序列及水稻内标准基因SPS的特异序列。
3、利用重叠PCR将上述获得的多个片段进行拼接
利用重叠PCR将多个片段拼接，拼接过程见示意图1，具体操作过程如下：
将35S和SPS的扩增产物分别取1μL加入反应体系中作为扩增模板，扩增条件如上，利用引物对35S-F/SPS-R-add进行重叠PCR扩增，将35S和SPS两个片段连接在一起（35S+SPS）。
将Bt和NptII的扩增产物分别取1μL加入反应体系中作为扩增模板， 扩增条件如上，利用引物对Bt-F-add/NptII-R-add进行重叠PCR扩增，将Bt和NptII两个片段连接在一起（Bt+NptII）。
将上述两次重叠PCR的扩增产物分别取1μL加入反应体系中作为扩增模板，扩增条件如上，利用引物对35S-F/NptII-R-add进行重叠PCR扩增，将上述重叠PCR获得的两个片段连接在一起（35S+SPS+Bt+NptII）。
将Bar和Nos的扩增产物分别取1μL加入反应体系中作为扩增模板，扩增条件如上，利用引物对Bar-F-add/Nos-R进行重叠PCR扩增，将Bar和Nos两个片段连接在一起（Bar+Nos）。
将Hpt和Bar+Nos的扩增产物分别取1μL加入反应体系中作为扩增模板，扩增条件如上，利用引物对Hpt-F-add/Nos-R进行重叠PCR扩增，将Hpt和Bar+Nos两个片段连接在一起（Hpt+Bar+Nos）。
将35S+SPS+Bt+NptII和Hpt+Bar+Nos的扩增产物分别取1μL加入反应体系中作为扩增模板，扩增条件如上，利用引物对35S-F/Nos-R进行重叠PCR扩增，将35S+SPS+Bt+NptII和Hpt+Bar+Nos两个片段连接在一起（35S+SPS+Bt+NptII+Hpt+Bar+Nos）。对获得的连接片段进行回收测序，结果表明获得的序列（SEQ ID No.8）与设计的扩增片段一致。
4、重组片段克隆
利用分子克隆方法将上述重叠PCR扩增获得的重组片段连接到质粒载体pUC19上，连接体系见表2。将连接产物转化DH5α感受态菌株。利用菌落PCR对重组菌株进行鉴定，按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒pUC-RS。通过测序分析确定重组标准质粒中的外源序列与预期一致。
表2:连接体系
实施例2：重组标准质粒pUC-RS在实际检测中的应用
一、实验材料
转基因水稻KF6、TT51、KMD1；转基因大豆GTS40-3-2、MON89788；转基因玉米MON810、Bt11、Bt176；转基因棉花MON15985、MON88913，转基因油菜MS1、GT73；及非转基因水稻、大豆、玉米和棉花等其它作物。
二、试剂
Taq DNA聚合酶及其缓冲液、dNTPs、Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；
三、主要仪器设备
PCR仪（德国Biometra）、凝胶成像***（美国GE）、Ultrospec1100pro紫外分光光度计（美国GE）、其他仪器包括：恒温水浴锅，离心机，恒温培养箱，电子天平，微量移液器等。
四、实验方法和过程
1、植物基因组DNA提取
取适量植物样品，在液氮中充分研磨，称取100mg研磨好的样品（不需研磨的可直接称取），按照植物基因组提取试剂盒说明书提取植物样品的基因组DNA。DNA样品的质量用琼脂糖凝胶电泳和核酸定量检测的方法进行评价。
2、重组标准质粒pUC-RS的提取与检测
将含有标准质粒分子pUC-RS的大肠杆菌于37℃培养10h，按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒DNA。取3μLDNA样品，用1%琼脂糖凝胶电泳 检测，判断DNA完整性；用分光光度计检测DNA纯度和浓度，计算OD260nm/OD280nm的比值在1.8左右，符合定性、定量PCR检测要求；根据重组标准质粒DNA初始浓度和大小，用0.1×TE缓冲液将其依次稀释成1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×10和5copy·μL-1，4℃保存备用。
3、重组标准质粒pUC-RS在定性PCR检测中的应用
根据水稻内标准基因SPS和6个检测元件的特异性序列，使用引物进行定性PCR，检测标准质粒分子检测效果。使用的引物序列见表3。
表3：重组标准质粒定性PCR检测引物
利用表3中的引物进行扩增，PCR体系为：10×PCR缓冲液（Mg2+Plus），200mmol dNTPs，0.5mmol正向引物，0.5mmol反向引物，1.25U的Taq DNA聚合酶和DNA模板。PCR程序为95℃ 5min预变性；94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃延伸7min。PCR产物用2%的琼脂糖跑胶并拍照。
以重组标准质粒pUC-RS（1.0×104copy·μL-1）、转基因水稻KF6、TT51和KMD1、其他转基因材料及非转基因作物的DNA为模板进行定性PCR检测，判断重组标准质粒用于定性PCR检测的特异性。结果显示只有在相应的转基因元件中重组质粒才有扩增，表明重组质粒有很好的特异性，且重组标准质粒的扩增结果与相应的阳性转基因的扩增结果一致，能替代转基因水稻筛查工作中阳性转基因样品。
以不同浓度的重组标准质粒pUC-RS的DNA样品（1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×10和5copy·μL-1）为模板进行定性PCR扩增，判断重组标准质粒用于定性PCR检测的灵敏度。实验结果显示7个***片段的扩增灵敏度都能达到1.0×102copy·μL-1，满足定性PCR检测的需求。
Claims (4)
1.一种用于转基因水稻筛查的重组标准质粒，由如下方法获得：将SEQ IDNo.1所示的CaMV35S基因、SEQ ID No.2所示的SPS基因、SEQ IDNo.3所示的Bt基因、SEQ ID No.4所示的NPTⅡ基因、SEQ ID No.5所示的Htp基因、SEQ ID No.6所示的Bar基因和SEQ ID No.7所示的NOS基因依次连接获得融合片段，再将所得融合片段克隆到载体pUC-19中，获得所述重组标准质粒，记为pUC-RS。
2.如权利要求1所述的重组标准质粒，其特征在于所述融合片段核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
3.如权利要求1所述的重组标准质粒在转基因水稻筛查中的应用。
4.一种用于转基因水稻筛查的检测试剂盒，主要包括权利要求1所述的重组标准质粒和特异性引物；所述特异性引物序列如下：
CaMV35S基因特异性引物：
35S-F：GCTCCTACAAATGCCATCATTGC
35S-R：GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC
SPS基因特异性引物：
SPSF：ATCTGTTTACTCGTCAAGTGTCATCTC
SPS-R：GCCTAGGATTACATATGGCAAGA
Bt基因特异性引物：
Bt-F：GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC
Bt-R：CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT
NPTⅡ基因特异性引物：
Npt-F：ACTGGGCACAACAGACAATCG
Npt-R：GCATCAGCCATGATGGATACTTT
Htp基因特异性引物：
Hpt-F：GAAGTGCTTGACATTGGGGAGT
Hpt-R：AGATGTTGGCGACCTCGTATT
Bar基因特异性引物：
Bar-F：ACCATCGTCAACCACTACATCG
Bar-R：GCTGCCAGAAACCCACGTCAT
NOS基因特异性引物：
Nos-F：GAATCCTGTTGCCGGTCTTG
Nos-R：TTATCCTA GTTTGCGCGCTA。
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2013
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Application publication date: 20130724 |