CN106591287A - 一种聚合酶链式反应增强的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种聚合酶链式反应增强的方法，所述方法包括如下步骤：在所述PCR扩增体系中加入PCR增强剂，得到增强后的PCR扩增体系,所述PCR增强剂为己六醇和海藻糖的混合物；设置所述增强后的PCR扩增体系的程序参数，并进行扩增实验，得到扩增产物；将所述扩增产物放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。本发明提供聚合酶链式反应增强的方法，采用己六醇和海藻糖的混合物作为PCR增强剂能显著提高核酸扩增反应的效率和/或产率，从而提高利用核酸扩增反应检测核酸的灵敏度。

Description

一种聚合酶链式反应增强的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域技术领域，特别涉及一种聚合酶链式反应增强的方法。
背景技术
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction；PCR)是一种用于扩增放大特定的核酸片段(DNA/RNA)的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的核酸大幅增加。一般PCR主要为采用结合所选核酸模板(如DNA或RNA)的至少上游、下游两种寡核苷酸引物，在DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶)的作用下对目的核酸模板片段进行扩增。可利用常规方法从限制性消化物中纯化得到上述两种寡核苷酸引物，或者可通过合成方法生产上述引物。引物优选为在扩增中效率最高的单链，但引物也可以是双链。双链引物首先被变性(如采用加热方法使其变性)，即处理以分离各链。
PCR实验采用的核酸模板不需要纯化，可通过如专利CN101665785B所述的技术从样本中提取核酸。核酸可获自各种来源，如质粒或天然来源，包括细菌、酵母、病毒、细胞器或高级生物。如果核酸模板是单链RNA，则需要在用作PCR模板之前使单链RNA逆转录为DNA，即RNA指导下的DNA合成。可通过任何合适的复制方法，包括化学或酶学方法完成RNA指导下的DNA合成，随后DNA经过加热变性(变性温度一般范围约为90-105℃，时间一般进行约30秒或更久)成为cDNA。如果核酸模板是双链，则需要在用作PCR模板之前使两条链分离开。可通过任何合适的变性方法，包括物理、化学或酶学方法使链分离。
自PCR方法被建立以来，在30年的时间里，发展很快，已有一系列PCR方法被设计出来，并广泛应用于遗传疾病的诊断、肿瘤研究、病原体检测、基因分型、法医等各领域，具有很强的实用性。
PCR扩增过程受很多因素的制约，如DNA聚合酶的性能、PCR缓冲溶液组成、引物的碱基序列及长度、采用的退火温度等条件。对某些特定核酸片段区域的扩增，引物设计位置受限；或者在多重的PCR反应中，PCR缓冲溶液组成、退火温度等条件的优化受限等各种情况，都会导致PCR扩增的不完完善。
发明内容
本发明的发明目的在于提供一种聚合酶链式反应增强的方法，以提高PCR反应的效率和扩增产率。
根据本发明的实施例，提供了一种聚合酶链式反应增强的方法，所述方法包括：
在PCR扩增体系中加入PCR增强剂，得到增强后的PCR扩增体系,所述PCR增强剂为己六醇和海藻糖的混合物；
设置所述增强后的PCR扩增体系的程序参数，并进行扩增实验，得到扩增产物；
将所述扩增产物放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。
进一步，所述PCR增强剂为山梨糖醇和海藻糖的混合物。
进一步，所述PCR增强剂为甘露醇和海藻糖的混合物。
进一步，所述PCR增强剂为甘露醇，山梨糖醇和海藻糖的混合物。
进一步，所述PCR扩增体系，包括：PCR缓冲溶液，dNTPs，H-Taq酶，上游引物，下游引物，标记物，和碱基模板，所述碱基模板为DNA模板或RNA模板，所述标记物为荧光探针或SYBR Green Ⅰ染料。
进一步，所述PCR扩增体系还包括：Tth酶和醋酸锰。
进一步，所述设置增强后的PCR扩增体系的程序参数，并进行扩增实验，得到扩增产物的步骤包括：
如果所述碱基模板为DNA模板则：
对所述DNA模板进行预处理，加热温度94摄氏度，加热时间5分钟，得到预处理后的DNA模板；
对所述预处理后的DNA模板进行变性处理，变性温度为94摄氏度，变性时间为15秒，得到变性后的DNA模板；
对所述变性后的DNA模板进行退火及延伸处理，退火的温度为57摄氏度；退火的时间为10秒，得到扩增产物。
进一步,所述设置增强后的PCR扩增体系的程序参数，并进行扩增实验得到扩增产物的步骤包括：
如果所述碱基模板为RNA模板则：
激活Taq酶，同时加热法破坏所述RNA模板中部分双链结构，得到单链RNA模板，加热温度为95摄氏度，加热时间为1分钟；
对所述单链RNA模板进行逆转录处理，得到cDNA模板，所述逆转录温度为60摄氏度，逆转录时间为30分钟；
对所述cDNA模板进行加热处理，得到预处理后的碱基模板，所述加热温度为95摄氏度，加热时间为1分钟；
对所述预处理后的碱基模板进行变性处理，得到变性后的碱基模板，所述变性处理的温度为95摄氏度，所述变性处理的时间为15秒；
对所述变性后的碱基模板进行退火及延伸处理，得到扩增产物，所述退火的温度为60摄氏度，所述退火的时间为30秒。
由以上技术方案可知，本发明实施例示出一种聚合酶链式反应增强的方法，所述方法包括如下步骤：在所述PCR扩增体系中加入PCR增强剂，得到增强后的PCR扩增体系,所述PCR增强剂为己六醇和海藻糖的混合物；设置所述增强后的PCR扩增体系的程序参数，并进行扩增实验，得到扩增产物；将所述扩增产物放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。本发明提供聚合酶链式反应增强的方法，采用己六醇和海藻糖的混合物作为PCR增强剂能显著提高核酸扩增反应的效率和/或产率，从而提高利用核酸扩增反应检测核酸的灵敏度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为根据一优选实施例示出的一种聚合酶链式反应增强的方法的流程图；
图2为用8个呼吸道腺病毒(ADV)感染者的口咽拭子样本提取到的DNA作为待测样本，对照组扩增检测结果；
图3为用8个呼吸道腺病毒(ADV)感染者的口咽拭子样本提取到的DNA作为待测样本，实验组扩增检测结果；
图4为用7个人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者的血浆样本提取到的RNA作为待测样本对照组扩增检测结果；
图5为用7个人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者的血浆样本提取到的RNA作为待测样本对照组扩增检测结果；
图6为检测人外周血样本DNA的α-珠蛋白基因，通过琼脂糖凝胶电泳分析结果；
图7为检测口咽拭子中副流感3型RNA核酸，通过琼脂糖凝胶电泳分析结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例示出一种聚合酶链式反应增强的方法，如图1所示，所述方法包括如下步骤：
S101，在所述PCR扩增体系中加入PCR增强剂，得到增强后的PCR扩增体系,所述PCR增强剂为己六醇和海藻糖的混合物；
S102，设置所述增强后的PCR扩增体系的程序参数，并进行扩增实验，得到扩增产物；
S103，将所述扩增产物放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。
进一步，所述PCR增强剂为山梨糖醇和海藻糖的混合物。
进一步，所述PCR增强剂为甘露醇和海藻糖的混合物。
进一步，所述PCR增强剂为甘露醇，山梨糖醇和海藻糖的混合物。
PCR增强剂一般在PCR反应开始前加入到PCR扩增体系中，PCR增强剂使用的浓度由PCR扩增体系的组成成份、引物和/或探针的设计情况、PCR产物长度等多种因素确定，本发明的优选方案为：在模板为DNA的PCR扩增体系中，山梨糖醇和海藻糖的使用浓度分别为0.2M和0.25M；在模板为RNA的PCR扩增体系中，山梨糖醇和海藻糖的使用浓度分别为0.1M和0.25M。通过我们的实验验证，山梨糖醇的一个同分异构体甘露醇，其与海藻糖同时使用，也会改善PCR的扩增效果，在本发明中，优选山梨糖醇和海藻糖为混合组合物作为PCR的增强剂。
进一步，PCR缓冲溶液，dNTPs，H-Taq酶，上游引物，下游引物，标记物，和碱基模板，所述碱基模板为DNA模板或RNA模板，所述标记物为荧光探针或SYBR Green Ⅰ染料。
本发明实施例PCR反应的PCR扩增体系中添加一种PCR增强剂，能显著的提高PCR的效率和/或产率。PCR扩增体系组成至少含有如下组份：PCR缓冲溶液、DNA聚合酶、dNTPs、引物和/或探针以及催化DNA聚合酶所需要的金属阳离子。常见的PCR缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20-200μl，PCR缓冲溶液中加入合适浓度的DNA聚合酶、dNTPs、金属阳离子等组份，其中引物和/或探针的使用浓度可以为0.05μM-5μM不等。
对于碱基模板为DNA模板的PCR扩增体系，本发明优选的方案为：
组份 单个反应中的体积/浓度
5×PCR缓冲溶液* 10μL
dNTPs(100mM) 1.5μL
H-Taq酶(5U/μL) 1.0μL
上游引物 0.5μM
下游引物 0.5μM
荧光探针 0.25μM
20×SYBR Green Ⅰ染料 2.5μL
DNA模板 10ng
灭菌纯化水 Up to 50μL
其中：5×PCR缓冲溶液由200mmol/L Tris-HCl，30mmol/L MgCl2，500mmol/L KCl，0.2％(V/V)Triton X-100，10％(V/V)formamide(甲酰胺)及灭菌的纯化水组成，-20±5℃保存。
进一步，所述PCR扩增体系还包括：Tth酶和醋酸锰。
对于碱基模板为RNA模板的PCR扩增体系，本发明优选的方案为：
组份 单个反应中的体积/浓度
5×PCR缓冲溶液* 10μL
dNTPs(100mM) 1.5μL
Tth酶(5U/μl) 1.0μL
H-Taq酶(5U/μl) 1.0μL
Mn(OAc)2(150mM) 1.0μL
上游引物 0.5μM
下游引物 0.5μM
荧光探针 0.25μM
20×SYBR Green Ⅰ染料 2.5μL
RNA模板 10ng
灭菌纯化水 Up to 50μL
其中：5×PCR缓冲溶液由0.25mol/L的N,N-二羟乙基甘氨酸/氢氧化钾(Bicine/KOH),pH 8.2；575mmol/L的乙酸钾(Potassium acetate)和40％(v/v)甘油(glycerol)组成。
进一步，所述设置增强后的PCR扩增体系的程序参数，并进行扩增实验的步骤包括：
如果所述碱基模板为DNA模板则：
对所述DNA模板进行预处理的加热温度94摄氏度，加热时间5分钟，得到预处理后的DNA模板；
所述对预处理后的DNA模板进行变性处理的变性温度为94摄氏度，变性时间为15秒，得到变性后的DNA模板；
所述对变性后的DNA模板进行退火，延伸及荧光采集处理的退火的温度为57摄氏度；退火的时间为10秒，得到扩增产物。
本发明实施例示出的PCR扩增反应过程为：
1)加热变性，变性加热的条件取决于缓冲液盐离子浓度以及变性核酸的长度和核苷酸组成，但一般的范围约为90℃-105℃，变性的时间取决于反应特征和核酸长度，但一般进行约30秒-4分钟。
2)退火，使各引物退火至模板核酸的靶序列上。退火的温度通常为35摄氏度-65摄氏度(如约40摄氏度-60摄氏度)，退火的时间可以是10秒至1分钟(如约30秒-40秒)。
3)延伸，即足以由退火引物延伸产生与模板核酸互补的产物的温度，但在该温度下，延伸产物与互补模板不变性(延伸温度一般为40摄氏度-80摄氏度，延伸时间可以是约10秒至5分钟不等)。
对于碱基模板为DNA模板，增强后的PCR扩增体系的程序参数，本发明优选的方案为：
进一步，所述设置增强后的PCR扩增体系的程序参数，并进行扩增实验的步骤包括：
如果所述碱基模板为RNA模板则：
所述激活Taq酶，同时加热法破坏所述RNA模板中部分双链结构，得到单链RNA模板的加热温度为95摄氏度，加热时间为1分钟，得到单链RNA模板；
所述对单链RNA模板进行逆转录处理的逆转录温度为60摄氏度，逆转录时间为30分钟；
所述对cDNA模板进行加热处理的加热温度为95摄氏度，加热时间为1分钟；
所述对预处理后的碱基模板进行变性处理，所述变性处理的温度为95摄氏度，所述变性处理的时间为15秒；
所述对变性后的碱基模板进行退火，延伸及荧光采集处理的退火的温度为60摄氏度，所述退火的温度为30秒。
对于碱基模板为RNA模板，增强后的PCR扩增体系的程序参数，，本发明优选的方案为：
结果分析：
实施例一
使用8个呼吸道腺病毒(ADV)感染者的口咽拭子样本提取到的DNA作为待测样本，一份用未添加增强剂的PCR反应体系检测作为对照，另一份为添加有山梨糖醇和海藻糖的PCR反应体系检测作为实验组，图2和图3所示：
对照组、实验组Ct值统计：
可见，本发明提供聚合酶链式反应增强的方法，采用添加0.2M山梨糖醇和0.25M海藻糖的混合物作为PCR增强剂能显著提高8个呼吸道腺病毒(ADV)DNA核酸扩增反应的效率和/或产率，从而提高利用核酸扩增反应检测核酸的灵敏度。
实施例二
使用7个人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者的血浆样本提取到的RNA作为待测样本，一份用未添加增强剂的PCR反应体系检测作为对照，另一份为添加有山梨糖醇和海藻糖的PCR反应体系检测作为实验组，结果图4和图5所示：对照组、实验组Ct值统计：
可见，本发明提供聚合酶链式反应增强的方法，采用0.1M山梨糖醇和0.25M海藻糖的混合物作为PCR增强剂能显著提高7个人类免疫缺陷病毒(HIV)RNA核酸扩增反应的效率和/或产率，从而提高利用核酸扩增反应检测核酸的灵敏度
实施例三：
检测人外周血样本DNA的α-珠蛋白基因，通过琼脂糖凝胶电泳分析结果如图6所示：
其中，α-地中海贫血αα/αα野生型扩增结果(1.7kb)3：DNA Markers；1：实验组(添加0.2M山梨糖醇和0.25M海藻糖)；
2对照组(未添加)；
可见，本发明提供聚合酶链式反应增强的方法，采用0.2M山梨糖醇和0.25M海藻糖的混合物作为PCR增强剂能显著提高人外周血样本DNA的α-珠蛋白核酸的扩增反应的效率和/或产率，从而提高利用核酸扩增反应检测核酸的灵敏度。
实施例四：
检测口咽拭子中副流感3型RNA核酸，通过琼脂糖凝胶电泳分析结果如图7；
其中，副流感3型目标保守片段检测(150bp)3：DNA Markers；4：实验组(添加0.1M山梨糖醇和0.25M海藻糖)；
5对照组(未添加)。
可见，本发明提供聚合酶链式反应增强的方法，采用0.2M山梨糖醇和0.25M海藻糖的混合物作为PCR增强剂能显著提高口咽拭子中副流感3型RNA核酸的扩增反应的效率和/或产率，从而提高利用核酸扩增反应检测核酸的灵敏度。
由以上技术方案可知，本发明实施例示出一种聚合酶链式反应增强的方法，所述方法包括如下步骤：在所述PCR扩增体系中加入PCR增强剂，得到增强后的PCR扩增体系,所述PCR增强剂为己六醇和海藻糖的混合物；设置所述增强后的PCR扩增体系的程序参数，并进行扩增实验，得到扩增产物；将所述扩增产物放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。本发明提供聚合酶链式反应增强的方法，采用己六醇和海藻糖的混合物作为PCR增强剂能显著提高核酸扩增反应的效率和/或产率，从而提高利用核酸扩增反应检测核酸的灵敏度。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。
应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。

Claims (8)

1.一种聚合酶链式反应增强的方法，其特征在于，所述方法包括：
在PCR扩增体系中加入PCR增强剂，得到增强后的PCR扩增体系,所述PCR增强剂为己六醇和海藻糖的混合物；
设置所述增强后的PCR扩增体系的程序参数，并进行扩增实验，得到扩增产物；
将所述扩增产物放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR增强剂为山梨糖醇和海藻糖的混合物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR增强剂为甘露醇和海藻糖的混合物。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR增强剂为甘露醇，山梨糖醇和海藻糖的混合物。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增体系，包括：PCR缓冲溶液，dNTPs，H-Taq酶，上游引物，下游引物，标记物，和碱基模板，所述碱基模板为DNA模板或RNA模板，所述标记物为荧光探针或SYBR GreenⅠ染料。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增体系还包括：Tth酶和醋酸锰。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述设置增强后的PCR扩增体系的程序参数，并进行扩增实验，得到扩增产物的步骤包括：
如果所述碱基模板为DNA模板则：
对所述DNA模板进行预处理，加热温度94摄氏度，加热时间5分钟，得到预处理后的DNA模板；
对所述预处理后的DNA模板进行变性处理，变性温度为94摄氏度，变性时间为15秒，得到变性后的DNA模板；
对所述变性后的DNA模板进行退火及延伸处理，退火的温度为57摄氏度；退火的时间为10秒，得到扩增产物。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于,所述设置增强后的PCR扩增体系的程序参数，并进行扩增实验得到扩增产物的步骤包括：
如果所述碱基模板为RNA模板则：
激活Taq酶，同时加热法破坏所述RNA模板中部分双链结构，得到单链RNA模板，加热温度为95摄氏度，加热时间为1分钟；
对所述单链RNA模板进行逆转录处理，得到cDNA模板，所述逆转录温度为60摄氏度，逆转录时间为30分钟；
对所述cDNA模板进行加热处理，得到预处理后的碱基模板，所述加热温度为95摄氏度，加热时间为1分钟；
对所述预处理后的碱基模板进行变性处理，得到变性后的碱基模板，所述变性处理的温度为95摄氏度，所述变性处理的时间为15秒；
对所述变性后的碱基模板进行退火及延伸处理，得到扩增产物，所述退火的温度为60摄氏度，所述退火的时间为30秒。
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