CN105603055B - 多重聚合酶链式反应方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种多重聚合酶链式反应方法。该方法包括步骤：(A)提供一聚合酶链式反应体系，所述反应体系含有待扩增的模板、用于扩增的引物对、聚合酶、氧化石墨烯和用于进行聚合酶链式反应所需的试剂；(B)进行聚合酶链式反应，从而获得含扩增产物的反应混合物，其中扩增产物包括分别对应于所述引物对的各扩增产物；和(C)对上一步骤中的反应混合物进行电泳和/或测序检测。本发明方法可在含低拷贝量复杂模板的、极易产生非特异性扩增的多重PCR反应体系中，非常高效而准确地扩增出全部特异性扩增产物。本发明方法可广泛用于各种不同的检测领域。

Description

多重聚合酶链式反应方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种多重聚合酶链式反应方法，具体地涉及该多重聚合酶链式反应方法在低拷贝数量、高度复杂模板中高效及精准扩增目的核酸序列的应用。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)能够以少量DNA为模板，并将目标DNA片段在短时间(几小时)内以指数扩增的方式大量富集。多重PCR可以在一个反应中对多个基因同时进行扩增，与常规PCR技术相比具有高效、省时、省样本等优势，因此该技术已成为临床和基础研究中一种快捷简便的基因检测方法。然而，由于在多重PCR反应体系中，高浓度的多种引物间会发生相互作用，严重影响了扩增的特异性和均一性，并导致扩增灵敏度和产量的降低。这些问题大大限制了多重PCR的应用。

目前，解决这个问题的传统方法有：使用特殊的软件来设计多重PCR的引物(如MPprimer等)、优化反应组分和热循环条件(Markoulatos,P.,Siafakas,N.,Moncany,M.Multiplex polymerase chain reaction:A practical approach.[J].Journal ofClinical Laboratory Analysis.,2002,16:47-51；Henegariu,O.,Heerema,N.A.,Dlouhy,S.R.,et al.Multiplex PCR:Critical parameters and step-by-step protocol[J].Biotechniques,1997,23:504-511)。传统方法主要依赖大量的条件摸索和经验的积累。除了基于经验的传统方法外，已有几种巧妙的策略来提高多重PCR的特异性。例如：利用复合引物(compositied primers)与巢式PCR相结合的策略也能较好的改善多重PCR的特异性和产量的问题(US2009/0253183 A1、US 2010/0291668 A1)。这一策略在引物设计时，将一段序列完全相同的引物加入到每一个特异性引物的5'端(通用序列)，从而组成复合引物。这一序列完全相同的引物称为通用引物(common primer)，它的序列与待扩增的模板不具有同源性。每一个复合引物由两部分组成：靠近5'端的通用引物和靠近3'的特异引物。在第一轮扩增中，复合引物中只有特异性序列的能与模板配对并扩增，因此第一轮扩增能将各DNA目标片段扩增出来；此外，由于每个特异引物的末端都附加有一段通用引物的序列，因此在每一个扩增的产物的两端都具有相同的序列。在第二轮扩增中，只需加入一种序列(通用引物)即可完成所有目标产物的扩增。此外，在引物合成是加入非天然的人工碱基也能明显改善多重PCR的特异性。也有人报道称在多重PCR中引入一种单链结合蛋白RecA也能改善多重PCR的特异性。

然而，上述对多重PCR的改进方法都有一定缺点。传统的优化方法依赖大量的实验来优化反应条件，且在不同的扩增体系下最佳的优化条件需要重新优化，需要耗费大量的时间和试剂。利用通用引物和巢式PCR的策略的实验较简单且效果较好，但这一策略需要保证通用引物的序列与DNA模板无同源性，这增加了实验设计的难度；巢式PCR需要将第一轮产物进行第二轮扩增，这增大了实验室交叉污染的风险。此外，在第一轮扩增中引物仍然可能因相互作用而产生非特异扩增，特异性的降低和扩增非均一性的问题仍然难以避免。综上所述，上述多重PCR的优化策略会有优化过程复杂、需要特殊仪器、费用昂贵等问题。

本质上，多重PCR的问题主要是因大量不同序列的引物之间的相互干扰和竞争引起。这些相互作用会导致引物二聚体、引物与模板错配等，进而导致非特异产物。由于在PCR过程中，这些非特异扩增与特异性扩增竞争PCR反应底物，减少了特异性产物的产量，导致灵敏度低的问题。这些问题极大的降低了基于多重PCR的检测方法的特异性和灵敏度。因此，从引物的相互作用角度出发对PCR体系进行改进，使得PCR具有一种能选择性抑制非特异扩增、增强特异性扩增的能力就可以有效提高多重PCR的特异性和灵敏度；此外，从实际应用的角度出发，建立一种操作简单、廉价且具有广泛适用性的多重PCR改进方法是十分重要的。

近年来，随着纳米技术的发展，许多纳米材料已被用于PCR的优化，如纳米金、纳米银、量子点、纳米多聚物和纳米碳材料等。这些材料可不能程度的改善PCR中出现的各种问题，但各类材料优化效果各有不同，且只是对常规PCR(单重PCR)的优化。氧化的石墨烯材料是种新型的二维碳材料，具有比表面积大、导热性良好等性质。目前，人们已发现氧化石墨烯能吸附DNA(单链DNA和双链)；此外，氧化石墨烯能有效降低含有错配的单链DNA的配对效率。因此氧化石墨烯的特异性能很好的选择性抑制非特异配对和扩增，从而提高多重PCR的特异性和灵敏度。这种方法不需要对各个引物对进行特殊的设计，也无需进行容易导致污染的二次扩增，可以大大简化实验流程和降低交叉污染的风险。此外，大规模生产分散均匀的氧化石墨烯水溶液的制备方法成熟，成本低廉。因此，利用氧化石墨烯作为添加剂优化多重PCR可建立一种操作简单、低成本且具有广泛适用性的多重PCR优化策略。目前，未见报道将氧化石墨烯用于多重PCR技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种氧化石墨烯在多聚合酶链式反应中作为优化剂和增强特性剂的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种多重聚合酶链式反应方法，包括步骤：

(A)提供一聚合酶链式反应体系，所述反应体系含有待扩增的模板、用于扩增的引物对、聚合酶、氧化石墨烯和用于进行聚合酶链式反应所需的试剂；

(B)对上一步骤的聚合酶链式反应体系进行聚合酶链式反应，从而获得含扩增产物的反应混合物，其中扩增产物包括分别对应于所述引物对的各扩增产物；和

(C)任选地，对上一步骤中的反应混合物进行电泳和/或测序检测，

其中，所述的用于扩增的引物对包括3-30个引物对。

在另一优选例中，所述聚合酶链式反应体系中，氧化石墨烯的含量为100－500ng/25微升；较佳地150－400ng/25微升；较佳地200－300ng/25微升。

在另一优选例中，各引物对中上游引物与下游引物之比为约0.8-1.2：0.8-1.2，较佳地为约1：1。

在另一优选例中，所述聚合酶链式反应体系中，氧化石墨烯的含量与所述代扩增模板的含量之比为：100-500ng：5-25ng；较佳地150-400ng：5-25ng；更佳地200-300ng：5-25ng。

在另一优选例中，所述聚合酶链式反应体系中，所述模板的浓度为0.1-10ng/微升，较佳地为0.5-5ng/微升，更佳地为0.8-2ng/微升(如约1ng/微升)。

在另一优选例中，所述的模板为哺乳动物的总DNA。

在另一优选例中，步骤(B)中，聚合酶链式反应的退火温度为T_平均±5℃，较佳地为T_平均±3℃，其中T_平均为所有引物的Tm的算术平均值。

在另一优选例中，步骤(B)中，聚合酶链式反应的退火温度为45-70℃，较佳地为约50℃。

在另一优选例中，在适量氧化石墨烯存在下，所述的多重聚合酶链式反应中以同样的退火温度或氧化石墨烯浓度在低拷贝模板的条件下能扩增出全部特异性扩增产物。

在另一优选例中，所述的“低拷贝模板”指反应体系中模板的总含量≤5ng,较佳地≤2ng，更佳地≤1ng。

在另一优选例中，所述的模板包括抽提的基因组DNA模板、抽提的RNA模板、或cDNA模板。更佳地，所述的模板包括抽提的全基因组DNA模板。

在另一优选例中，所述的多重聚合酶链式反应中引物对不需要特殊设计。

在另一优选例中，所述的多重聚合酶链式反应中不含氧化石墨烯时(作为对照)，在任意退火温度下,以人类基因组为模板不能扩增出全部特异性产物。

在另一优选例中，所述的模板为人基因组DNA，且引物对包括7或8个引物对，并且在一定的退火温度下，所述方法扩增出全部(即7或8个)特异性产物。

在另一优选例中，所述的多重聚合酶链式反应中用于扩增的引物对包括3-15个引物对，较佳地5-10对，更佳地6-9个引物对。

在另一优选例中，所述的多重聚合酶链式反应不仅扩增出全部特异性产物并且抑制了引物二聚体和其它非特异性产物的形成。

在另一优选例中，在扩增后的反应混合物中，所述的引物二聚体的数量少于总扩增产物量的5％-10％

在另一优选例中，所述的氧化石墨烯能抑制引物对中只含有一个错配碱基的非特异扩增产物。

在另一优选例中，在所述反应体系中，待扩增的模板的总量为0.5-100ng，较佳地1-50ng。

在另一优选例中，待扩增的模板的总量为1-5ng或20-40ng。

在另一优选例中，所述模板的总量为1ng或5ng时，且所述引物对为8个引物对。

在另一优选例中，所述的氧化石墨烯选自下组：通过Hummer法制备的水溶性氧化石墨烯，其表面带有羧基、羟基、氨基等基团。

在本发明的第二方面，提供一种用于多重聚合酶链式反应试剂盒，所述试剂盒包含：

一容器A以及位于所述容器内的用于在多重聚合酶链式反应进行特异性扩增多种靶序列的3-20引物对；以及

一容器B以及位于所述容器内的氧化石墨烯；和

使用说明书。

在另一优选例中，所述的容器A和容器B为同一容器。

在另一优选例中，所述的容器B包括多个反应管，并且每个反应管中放置了用于一次多重聚合酶链式反应所需用量的氧化石墨烯。

在另一优选例中，所述的容器B的体积为50、100、150、200、250、500或1000微升，而所需用量的氧化石墨烯为100-500微克。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有：

一容器C以及位于所述容器内的测定所述多种靶序列的试剂或芯片。

在另一优选例中，所述的靶序列包括DNA序列和RNA序列。

在另一优选例中，所述的容器C中的试剂包括特异性与扩增产物结合的探针。

在另一优选例中，所述试剂盒还含有用于检测扩增产物的试剂，所述的试剂包括探针、和/或核酸芯片。

在本发明的第三方面，提供了一种氧化石墨烯的用途，该用途用于制备或用作提高多重聚合酶链式反应的灵敏度和特异性的增强剂。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了不同浓度的氧化石墨烯对多重PCR特异性的影响。其中，以人类基因组为模板扩增8个癌症基因，M表示DNA marker，N表示不加模板、不加氧化石墨烯的阴性对照，C表示不加氧化石墨烯、加入模板的阳性对照。泳道1-9分别表示加入氧化石墨烯30、60、90、120、150、180、210、240和270ng的多重PCR结果。图中从下向上产物长度依次为：52bp、74bp、90bp、131bp、152bp、176bp、336bp和552bp。

图2显示了氧化石墨烯对多重PCR灵敏度的影响。其中，以人类基因组为模板同时对8个癌症基因进行多重扩增；M表示DNA marker，N1表示不加模板、不加氧化石墨烯的阴性对照；A组表示不加氧化石墨烯的多重扩增结果，其中A1-A4分别表示加入模板175ng、25ng、5ng和1ng的扩增结果；N2表示加入氧化石墨烯、不加模板的阴性对照；B组表示加人250ng的多重扩增结果，其中B1-B4分别表示加入模板175ng、25ng、5ng和1ng的扩增结果。图中从下向上产物长度依次为：52bp、74bp、90bp、131bp、152bp、176bp、336bp和552bp。

图3分别显示了不加和加入了适量氧化石墨烯后，在不同退火温度下的多重PCR结果。其中M表示DNA marker(DL 2000)，A组表示不加氧化石墨烯的多重扩增结果，B组表示加氧化石墨烯(50ng)的多重扩增结果。N1表示不加模板、不加氧化石墨烯的阴性对照；其中A1-A6表示不加入GO情况下在不同退火温度下的多重扩增结果；N2表示加入GO(50ng)但不加模板的阴性对照；B1-B6组表示加入50ng氧化石墨烯时在不同退火温度下的多重扩增结果。图中从下向上产物长度依次为：101bp、202bp、323bp、524bp、630bp、754bp、1045bp和1674bp。

图4显示了氧化石墨烯对多重PCR均一性的提高效果。其中，以人类基因组DNA为模板DNA。其中，M表示DNA marker，A组表示不加氧化石墨烯的多重扩增结果，B组表示加氧化石墨烯(50ng)的多重扩增结果。N1表示不加模板、不加氧化石墨烯的阴性对照；其中A1、A2表示不加入GO的3重扩增结果；N2表示加入GO(50ng)但不加模板的阴性对照；B1、B2组表示加入50ng氧化石墨烯的3重扩增结果。图中从下向上产物长度依次为：176bp、203bp和258bp。

图5显示了不同浓度的氧化石墨烯对Lambda DNA多重扩增的影响；对多重PCR后的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示。M表示DNA marker，N表示不加模板、不加氧化石墨烯的阴性对照，C表示不加氧化石墨烯、加入模板的阳性对照。泳道1-9分别表示加入氧化石墨烯50、100、150、200、250、300、350、400和450ng的多重PCR结果。图中从下向上产物长度依次为：101bp、162bp、202bp、323bp、524bp、630bp、754bp和1045bp。

图6显示了不同浓度的氧化石墨烯对含有错配的引物的扩增优化。图6A为不含错配的引物的扩增结果，图6B为正向引物中含有一个错配碱基(红色G)的扩增结果。M表示DNAmarker，N1和N2表示不加模板、不加氧化石墨烯的阴性对照。每组1-4分别表示加入0、50、100、150ng氧化石墨烯(GO)。

图7显示了短引物(15个碱基)的单重PCR结果以及不同浓度的氧化石墨烯对短引物单重PCR的扩增优化效果。其中，A、B、C组分别表示使用15个碱基的引物对基因TSHR、PDGFRA和EGFR的扩增结果。扩增产物长度分别为：111bp、132bp和156bp。其中图A1、B1、C1表示无氧化石墨烯优化的PCR在不同退火温度(30、35、40、45、50、55℃)的扩增结果。图A2、B2、C2分别表示在不同氧化石墨烯浓度下PCR的扩增结果，图下方的数字表示每个PCR反应对应的氧化石墨烯用量。

图8显示了切胶回收产物的二次扩增电泳检测结果。图8A-图8H分别表示产物为552、336、176、152、131、90、74、52bp(分别编为样品1至样品8)的二次扩增电泳结果。每组中N表示不加DNA模板的阴性对照；P1-P8表示各组的阳性对照，模板为人类基因组(25ng)；A-H组中1、2泳道(如A1、A2)分别表示各组二次扩增的结果。表1显示了各产物对应基因名称、待扩增基因所在的染色体编号和扩增产物的理论长度；实际测序的一致区域和测序产物长度。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，通过对试验条件的大量筛选，首次开发了一种优化的多重聚合酶链式反应方法。通过本发明方法，可在含低拷贝量复杂模板(如1或5ng人类基因组模板)的、极其产生非特异性扩增的多重PCR反应体系(如8个或更多个引物对)中，非常高效而准确地扩增出全部特异性扩增产物。在此基础上完成了本发明。

术语

在本发明中，术语“多重聚合酶链式反应(多重PCR)”指在一个PCR反应中，使用多对特异性引物对多个基因进行同时扩增。在本发明中，所述的多重通常指3-20重，较佳地3-15重，更佳地5-10重。

氧化石墨烯

在本发明中，所述的多重PCR反应体系中含有一定量的氧化石墨烯。

在本发明中，适用的氧化石墨烯没有特别限制，可以采用市售的或用常规方法制备的氧化石墨烯。通常，可将石墨用强酸氧化而制得氧化石墨烯。

通常，氧化石墨烯的表面具有羧基、羟基、和/或氨基等基团。此外，氧化石墨烯还可含有其他任选的官能团，例如羰基等。可用于本发明的氧化石墨烯没有特别限制，通常包括(但并不限于)：利用改进的Hummer法制备的水溶性氧化石墨烯。一类优选的氧化石墨烯是表面含有羧基或羟基基团的氧化石墨烯。

本发明的试验表明，对于低模板量的高复杂度的多重PCR反应体系，氧化石墨烯可显著提高PCR的特异性、灵敏度和扩增产量，并可消除扩增中形成的引物二聚体。

在本发明的多重PCR反应体系中，氧化石墨烯的用量通常为为100－500ng/25微升；较佳地150－400ng/25微升；较佳地200－300ng/25微升。

多重引物对

在本发明中，所使用的多重引物对包括3个或更多个引物对。

在本发明中，用于扩增的多重引物对可包括3-50个引物对或3-30个引物对。通常，本发明多重PCR反应体系中含有3-15个引物对，较佳地5-10对，更佳地6-9个引物对。

在另一优选例中，所述的用于扩增的引物对中至少一个或多个或全部引物(优选全部引物)的长度为15-25bp，较佳地15-20bp，更佳地为15-18bp，最佳地为15-17bp。

在另一优选例中，所述的用于扩增的引物对包括多个引物对，且所有引物中各引物的Tm的最大值Tmax与各引物的Tm的最小值Tmin之间差值Δ＝0-5℃，较佳地Δ＝0-1℃。

在另一优选例中，所述的引物对中，至少有2个引物对共用同一引物(作为通用的上游引物或下游引物)，并且所述至少2个引物对的另一侧引物仅相差1－2个碱基。

在另一优选例中，所述引物对中只含有一个错配碱基。如本文所用，所述“引物对中只含有一个错配碱基”指第一引物对与第二引物对的序列除了一个引物相差1个碱基之外，完全相同。较佳地，所述的错配碱基位于3'端或位于引物的中间区域。

多重PCR反应体系

在本发明中，多重PCR反应体系含有待扩增的模板、用于扩增的引物对、聚合酶、氧化石墨烯和用于进行聚合酶链式反应所需的试剂。

通常，所述的待扩增的模板是来源于各种不同生物体(包括病原体、细菌、哺乳动物如人)的总核酸提取物，例如基因组模板。

典型地，在多重PCR反应体系中，模板的浓度通常为0.1-10ng/微升，较佳地为0.5-5ng/微升，更佳地为0.8-2ng/微升(如约1ng/微升)。

在本发明的多重PCR反应体系中，所述引物对中各引物浓度没有特别限制。典型地，各引物的终浓度为0.05-0.5μM，较佳地为0.1-0.4μM，更佳地为0.1-0.3μM(约0.2μM)。

应理解，在本发明多重PCR反应体系中，可含有其他有助于进行聚合酶链式反应其他试剂或成分，例如包括(但并不限于)一种或多种选自下组的试剂：

(i)PCR缓冲液(含镁离子等)

(ii)dNTP

(iii)ddH₂O。

在本发明中，所述聚合酶链式反应体系的总体积没有特别限制，通常可以为10-200微升，较佳地20-100微升，更佳地25-50微升。

扩增方法及扩增产物

采用本发明的多重PCR反应体系，可在常规的PCR反应条件下进行扩增。

典型地，该扩增方法包括变性、退火和延伸步骤，并且包括20-50个循环。

在另一优选例中，聚合酶链式反应的退火温度为T_平均±5℃，较佳地为T_平均±3℃，其中T_平均为所有引物的Tm的算术平均值。

在另一优选例中，聚合酶链式反应的退火温度为45-70℃，较佳地为约50℃。

在本发明中，由于采用了特别优化的反应条件，因此，即使采用高达8个或更多个引物对，仍可高效准确地扩增出全部所需的扩增产物，且可有效抑制了引物二聚体和其它非特异性产物的形成。

在本发明中，所述扩增产物包括分别对应于所述引物对的n种扩增产物。通常，在本发明的反应混合物中，所述n扩增产物中扩增量最大的扩增产物A与所述n扩增物中扩增产量最小的扩增产物的扩增量之比为2-20:1，较佳地3-10：1，更佳地为4-6：1(如约5:1)。

在另一优选例中，所述扩增产物包括分别对应于所述引物对的n种扩增产物，且任意两个扩增产物的长度相差一定长度，例如长度之差≥30bp，较佳地≥50bp(如50-200bp，较佳地50-100bp)。

在另一优选例中，所述各扩增产物的长度为50-2000bp，较佳地为100-1500bp，更佳地为100-1000bp,最佳地为200-500bp。

试剂盒及其应用

本发明还提供了一种用于多重聚合酶链式反应试剂盒，所述试剂盒包含：

一容器A以及位于所述容器内的用于在多重聚合酶链式反应进行特异性扩增多种靶序列的3-20引物对；以及

一容器B以及位于所述容器内的氧化石墨烯；和

使用说明书。

在另一优选例中，所述的容器A和容器B为同一容器。

在另一优选例中，所述的容器B包括多个反应管，并且每个反应管中放置了用于一次多重聚合酶链式反应所需用量的氧化石墨烯。

在另一优选例中，所述的容器B的体积为50、100、150、200、250、500或1000微升，而所需用量的氧化石墨烯为100-500微克。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有：

一容器C以及位于所述容器内的测定所述多种靶序列的试剂或芯片。

在另一优选例中，所述的靶序列包括DNA序列和RNA序列。

在另一优选例中，所述的容器C中的试剂包括特异性与扩增产物结合的探针。

在另一优选例中，所述试剂盒还含有用于检测扩增产物的试剂，所述的试剂包括探针、和/或核酸芯片。

用所述试剂盒进行多重聚合酶链式反应，不需要个引物对进行特殊的设计，也无需进行容易导致污染的二次扩增，可以大大简化实验流程和降低交叉污染的风险。从而，建立一种操作简单、廉价且具有广泛适用性的多重PCR。所述试剂盒还可进行多重聚合酶链式反应检测针对某些病原微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个好发部位。

本发明的主要优点在于：

(1)首次在多重PCR反应中提供氧化石墨烯作为优化剂和增强特性剂应用。

(2)在多重PCR反应中对于复杂模板只需低浓度即可扩增特异性产物。

(3)在多重PCR反应中引物对不需特殊设计。

(4)在多重PCR中只需优化一个条件就能同时得到特异性扩增产物。

(5)不需要特殊仪器、显著降低了成本。

(6)显著节省时间并提高产量。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

材料和方法

下列实施例中试剂来源为：人类基因组模板购自Promega公司；Lambda DNA购自大连宝生物公司；DNA聚合酶(ExTaq Hotstart DNA聚合酶和Probest高保真DNA聚合酶)购自大连宝生物公司；引物在Invetrogen公司合成；凝胶电泳图中的DNA marker(DL 2000和DNAladder 50bp)购自大连宝生物公司；氧化氧化石墨烯购自南京先丰纳米材料科技有限公司。

实施例1：不同浓度的氧化石墨烯对人类基因组癌症基因多重扩增的影响

1.实验目的

以人类基因组为模板，对8个与癌症相关的基因(Shuichi Hoshika,Fei Chen,Nicole A.Leal,et al.Artificial Genetic Systems:Self-Avoiding DNA in PCR andMultiplexd PCR[J].Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,5554–5557)在一个PCR反应中进行多重扩增。比较添加不同浓度的氧化石墨烯对多重PCR的影响。

2.实验材料和方法

待扩增的癌症基因名称、引物序列及产物长度

PCR溶液体系组成(25μL)：

PCR步骤和条件：(1)95℃预变性5分钟；(2)95℃预变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸1分钟30秒；重复40个循环；(3)68℃延伸10分钟。

电泳分析条件：琼脂糖凝胶电泳(3％),电压：80V，电泳时间3-4h。

3.实验结果

对多重PCR后的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。M表示DNAmarker，N表示不加模板、不加氧化石墨烯的阴性对照，C表示不加氧化石墨烯、加入模板的阳性对照。泳道1-9分别表示加入氧化石墨烯30、60、90、120、150、180、210、240和270ng的多重PCR结果。图中从下向上产物长度依次为：52bp、74bp、90bp、131bp、152bp、176bp、336bp和552bp。从图1可见，在不添加氧化石墨烯的情况下，只有4个特异的目标条带可以被检测到，同时存在其它非特异条带；随着氧化石墨烯的加入，多重PCR的特异性产物被逐渐增强，且非特异产物逐渐被抑制，最终在加入240-270ng的石墨烯时结果最佳，得到8条单一明亮的特异条带。

这一结果说明，在多重PCR反应体系中添加适量的氧化石墨烯，有助于提高目标产物的特异性和产量，同时有助于抑制非特异性的扩增。

实施例2：氧化石墨烯对多重PCR灵敏度的提高

1.实验目的

以人类基因组为模板，对8个与癌症相关的基因在一个PCR反应中进行多重扩增。分别用不同浓度的模板进行扩增，比较未添加GO和添加了适量的(250ng)氧化石墨烯的多重PCR灵敏度。

2.实验材料和方法

待扩增的癌症基因名称、引物序列及产物长度，同实施例1.

PCR溶液体系组成(25μL)：

PCR步骤和条件：同实施例1；

电泳分析条件：同实施例1。

3.实验结果

对多重PCR后的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。M表示DNAmarker，N1表示不加模板、不加氧化石墨烯的阴性对照；A组表示不加氧化石墨烯的多重扩增结果，其中A1-A4分别表示加入模板175ng、25ng、5ng和1ng的扩增结果；N2表示加入氧化石墨烯、不加模板的阴性对照；B组表示加人250ng的多重扩增结果，其中B1-B4分别表示加入模板175ng、25ng、5ng和1ng的扩增结果。图中从下向上产物长度依次为：52bp、74bp、90bp、131bp、152bp、176bp、336bp和552bp。当不加入氧化石墨烯时，仅在模板量为175ng时可以同时检测到8个目标条带，随着模板浓度的降低，多重PCR的特异性显著降低。而在添加了250ng的氧化石墨烯的多重反应体系中，当模板量仅为5ng时，各特异产物的条带依然单一、明亮；甚至在模板量为1ng时，各目标产物的条带也可以在电泳中检测到，说明在此例中多重PCR的灵敏度至少被提高了25倍。此外，从图2可见，添加了氧化石墨烯后，多重PCR的特异性和产量都有了明显的提高。

实施例3：氧化石墨烯对多重PCR中非特异扩增的抑制以及多重PCR在不同退火温度下的特异性

1实验目的

以Lambda DNA为模板，以Lambda DNA为模板，用8个引物对同时对Lambda DNA上8个不同的区域进行扩增。比较氧化石墨烯在各退火温度下对多重PCR特异性的增强效果。

2实验材料和方法

用于扩增的引物序列、产物长度及被扩增区域

PCR溶液体系组成(25μL)：

PCR步骤和条件：(1)95℃预变性5分钟；(2)95℃预变性30秒分钟，在不同温度下(52、60、68、72℃)退火1分钟30秒，72℃延伸1分钟30秒；重复40个循环；(3)68℃延伸10分钟。

3.实验结果

对多重PCR后的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。其中A、B两组分别表示不加入氧化石墨烯和加入氧化石墨烯的多重PCR结果。当不加入氧化石墨烯的多重PCR结果中(A组)，各退火温度条件下均存在严重的非特异产物；当加入适量(50ng)氧化石墨烯后，在各退火温度下多重PCR的非特异产物都被明显抑制，在退火温度为68度时，8个目标产物都能成功扩增出来，且无任何非特异产物。此外，值得注意的是，两组阴性对照(不加入模板DNA)的结果也有明显差别。当不加氧化石墨烯时(N1)，阴性对照的结果中有明显的引物二聚体和一系列非特异产物的条带；当加入氧化石墨烯后(N2)，引物二聚体和非特异产物被明显抑制。说明氧化石墨烯能很好的抑制非特异扩增的进行。

实施例4：氧化石墨烯对多重PCR扩增均一性的提高

1.实验目的

以人类基因组为模板，对3个与癌症相关的基因在一个PCR反应中进行多重扩增。分别用不同浓度的模板进行扩增，比较未添加GO和添加了50ng氧化石墨烯的多重PCR灵敏度。

2.实验材料和方法

待扩增的癌症基因名称、引物序列及产物长度

PCR溶液体系组成(25μL)：

组分	用量
		10×PCR缓冲液	2.5μL
dNTP混合液(各2.5mM)	2μL
		3个引物对(10mM/引物)	各0.5μL，共3μL
人类基因组模板	25ng
		Taq DNA热启动聚合酶(5U/μL)	1U；0.2μL
氧化氧化石墨烯	用量：50ng；终浓度：2ng/μL

		H<sub>2</sub>O	补足25μL

PCR步骤和条件：(1)95℃预变性5分钟；(2)95℃预变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸1分钟30秒；重复40个循环；(3)68℃延伸10分钟；

电泳分析条件：同实施例1。

3.实验结果

对多重PCR后的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。

M表示DNA marker，A组表示不加氧化石墨烯的多重扩增结果，B组表示加氧化石墨烯(50ng)的多重扩增结果。N1表示不加模板、不加氧化石墨烯的阴性对照；其中A1、A2表示不加入GO的3重扩增结果；N2表示加入GO(50ng)但不加模板的阴性对照；B1、B2组表示加入50ng氧化石墨烯的3重扩增结果。图中从下向上产物长度依次为：176bp、203bp和258bp。由图4A可见，在不加入氧化石墨烯的条件下进行多重PCR，引物间相互作用会抑制特异产物的扩增，同时会产生非特异产物，导致扩增特异性降低、产量低；当加入氧化石墨烯材料时(图4B)，特异性显著提高，3个特异产物在电泳图中均清晰可见，同时非特异扩增被抑制。说明氧化石墨烯材料的加入有助于提高多重PCR的均衡性。

实施例5：不同浓度的氧化石墨烯(GO)对Lambda DNA多重扩增的影响

1.实验目的

以Lambda DNA为模板，对8个DNA片段在一个PCR反应中进行多重扩增。比较未添加氧化石墨烯以及添加不同量氧化石墨烯的多重PCR效果。

2.实验材料和方法

用于扩增的引物序列及产物长度

PCR溶液体系组成(25μL)：

PCR步骤和条件：(1)95℃预变性5分钟；(2)95℃预变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸1分钟30秒；重复40个循环；(3)68℃延伸10分钟；

电泳分析条件：同实施例1。

3.实验结果

对多重PCR后的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示。M表示DNAmarker，N表示不加模板、不加氧化石墨烯的阴性对照，C表示不加氧化石墨烯、加入模板的阳性对照。泳道1-9分别表示加入氧化石墨烯50、100、150、200、250、300、350、400和450ng的多重PCR结果。图中从下向上产物长度依次为：101bp、162bp、202bp、323bp、524bp、630bp、754bp和1046bp。从图5可见，在不添加氧化石墨烯的情况下，只有少数特异的目标条带可以被检测到，同时存在其它非特异条带；随着氧化石墨烯的加入，多重PCR的特异性逐渐增强，且非特异产物被逐渐抑制，最终在加入250-300ng的氧化石墨烯时达到最佳结果。得到8条单一明亮的特异条带。

实施例6：氧化石墨烯对含有错配的引物的扩增优化

实验目的：利用含有错配碱基的引物进行PCR，利用氧化石墨烯提高PCR的特异性，说明氧化石墨烯对PCR特异性的增强作用。

实验材料与方法：

引物序列：正向引物分别含有0、1个错配，反向引物无错配

实验材料

PCR溶液体系组成(25μL)：

PCR步骤和条件：(1)95℃预变性5分钟；(2)95℃预变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒；重复40个循环；(3)72℃延伸5分钟；

图6A为不含错配的引物的扩增结果，图6B为正向引物中含有一个错配碱基(红色G)的扩增结果。每组1-4分别表示加入0、50、100、150ng氧化石墨烯(GO)。对于与模板完全互补的引物的情况(图6A)，可以扩增出单一明亮的336bp条带；对于正向引物含有一个错配的情况下(图6B)，在扩增产物中有明显的非特异条带(1kb-2kb处)，随着氧化石墨烯浓度的增加，非特异产物逐渐被抑制，当加入100-150ng的氧化石墨烯后，非特异产物被完全抑制，同时目标产物(336bp)的扩增不受影响。

实施例7：氧化石墨烯对短引物的扩增的优化

实验目的：用于PCR的引物长度通常为18-25个碱基。理论上，引物的碱基数越少，引物与模板DNA之间发生非特异配对的几率越高，PCR的特异性越差。当待扩增模板较复杂时(如人类基因组DNA)，这种错配导致的非特异扩增更加明显。根据已有的实验结果以文献报道，氧化石墨烯(GO)和还原的氧化石墨烯(RGO)可以提高PCR的特异性，但使用短引物(15个碱基)的进行扩增依然是个难题。本实验的思路是，利用较短的引物(15个碱基)进行单重PCR，并利用氧化石墨烯增强这种PCR的特异性，以说明氧化石墨烯能抑制非特异扩增，增强特异性扩增和产量。

实验材料和方法：

引物序列：

PCR步骤和条件：(1)95℃预变性5分钟；(2)95℃预变性30秒，30～55℃退火30秒，72℃延伸30秒；重复40个循环；(3)72℃延伸5分钟；

PCR步骤和条件：(1)95℃预变性5分钟；(2)95℃预变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒；重复40个循环；(3)72℃延伸5分钟；

实验结果：

从图7中A1、B1、C1可以看出，在不加入氧化石墨烯的条件下，使用短引物(15个碱基)的PCR在各退火温度下的扩增结果中均出现多个非特异条带，而特异性条带几乎不可见。这是因为引物缩短会导致引物与模板DNA发生非特异配对的几率增大，产生多个非目标产物，导致PCR表现出极低的特异性。此外，图A1、B1、C1表明，仅通过调节退火温度均不能有效提高PCR的特异性。为说明氧化石墨烯对PCR的特异性有显著增强的作用，我们选择在退火温度为50℃条件下进行氧化石墨烯优化的PCR实验(图A2、B2、C2)。从图中可以看出氧化石墨烯浓度的增加对PCR特异性增强的明显趋势：随着PCR反应中氧化石墨烯浓度的增加，非特异产物被逐渐抑制，同时目标产物亮度逐渐增强(图中白色箭头所示)。这说明氧化石墨烯可以有效抑制引物与模板DNA之间的非特异配对、抑制非特异扩增，同时增强对目标产物扩增的特异性和产量。

实施例8：氧化石墨烯优化的多重PCR产物测序

1.实验目的

利用氧化石墨烯优化多重PCR，并将多重PCR的产物分别回收并测序，以检验被扩增的条带为目标产物。

2.实验材料和方法

多重PCR实验条件同实施例1；

TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Ki t Ver.4.0

TaKaRa ExTaq HotStart DNA聚合酶

3.实验结果

将氧化石墨烯作为优化剂添加到多重PCR体系中，扩增产物在琼脂糖凝胶电泳下分别切胶回收。切胶回收后的产物分别用其特异性的引物对进行二次扩增。二次扩增产物在2％的琼脂糖凝胶电泳下检测(图8)。

图8.切胶回收产物的二次扩增电泳检测图。从图8中可以看到，以切胶回收的各产物为模板，使用特异的引物对都能扩增出单一的条带，这些条带的位置与以人类基因组DNA为模板的阳性对照产物的位置抑制，说明二次扩增都得到了目标产物。此外，各组阴性对照中都没有观察到污染条带，说明由二次扩增的产物来自于对回收产物的扩增。

表1

从表1中可以进一步证明，将多重PCR产物分别切胶回收并二次扩增后的PCR产物的序列与目标区域的序列一致。说明利用氧化石墨烯优化的多重PCR得到的产物均为目标产物。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种多重聚合酶链式反应方法，其特征在于，包括步骤：

(A)提供一聚合酶链式反应体系，所述反应体系含有待扩增的模板、用于扩增的引物对、聚合酶、氧化石墨烯和用于进行聚合酶链式反应所需的试剂；

(B)对上一步骤的聚合酶链式反应体系进行聚合酶链式反应，从而获得含扩增产物的反应混合物，其中扩增产物包括分别对应于所述引物对的各扩增产物；和

(C)任选地，对上一步骤中的反应混合物进行电泳和/或测序检测，

其中，所述的用于扩增的引物对包括5-20个引物对；

并且，所述氧化石墨烯的含量为150－400ng/25微升；

并且，所述氧化石墨烯的含量与所述待扩增模板的含量之比为：200-300ng：5-25ng；

并且，步骤(B)中，聚合酶链式反应的退火温度为T_平均±5℃，其中T_平均为所有引物的Tm的算术平均值；

并且，所述方法在低拷贝模板的条件下能扩增出全部特异性扩增产物；其中，所述的“低拷贝模板”指反应体系中模板的总含量≤5ng；

并且，所述的模板包括抽提的全基因组DNA模板。

2.如权利要求1所述的多重聚合酶链式反应方法，其特征在于，氧化石墨烯的含量为200－300ng/25微升。

3.如权利要求1所述的多重聚合酶链式反应方法，其特征在于，所述聚合酶链式反应体系中，氧化石墨烯的含量与所述待扩增模板的含量之比为：200-300ng：5-25ng。

4.如权利要求1所述的多重聚合酶链式反应方法，其特征在于，所述的模板为人基因组DNA，且引物对包括7或8个引物对，并且在一定的退火温度下，所述方法扩增出全部特异性产物。

5.如权利要求1所述的多重聚合酶链式反应方法，其特征在于，所述的氧化石墨烯抑制引物对中只含有一个错配碱基的非特异扩增产物。

6.如权利要求1所述的多重聚合酶链式反应方法，其特征在于，用于扩增的引物对包括6-9个引物对。

7.如权利要求1所述的多重聚合酶链式反应方法，其特征在于，在所述反应体系中，待扩增的模板的总量为1-50ng。

8.如权利要求1所述的多重聚合酶链式反应方法，其特征在于，所述的氧化石墨烯选自下组：通过Hummer法制备的水溶性氧化石墨烯，其表面带有羧基、羟基、氨基基团。

9.如权利要求1所述的多重聚合酶链式反应方法，其特征在于，在步骤(B)中，聚合酶链式反应的退火温度为T_平均±3℃，其中T_平均为所有引物的Tm的算术平均值。

10.一种用于如权利要求1所述的多重聚合酶链式反应方法的多重聚合酶链式反应试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：

一容器A以及位于所述容器内的用于在多重聚合酶链式反应进行特异性扩增多种靶序列的5-20引物对；以及

一容器B以及位于所述容器内的氧化石墨烯；和

使用说明书。

11.如权利要求10所述的多重聚合酶链式反应试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有：

一容器C以及位于所述容器内的测定所述多种靶序列的试剂或芯片。

12.一种氧化石墨烯的用途，其特征在于，用于制备或用作提高多重聚合酶链式反应的灵敏度和特异性的增强剂；

其中，所述的多重聚合酶链式反应中包括一聚合酶链式反应体系，所述反应体系含有待扩增的模板、用于扩增的引物对、聚合酶、氧化石墨烯和用于进行聚合酶链式反应所需的试剂；

其中，所述的用于扩增的引物对包括5-20个引物对；

并且，所述氧化石墨烯的含量为150－400ng/25微升；

并且，所述氧化石墨烯的含量与所述待扩增模板的含量之比为：200-300ng：5-25ng；

并且，步骤(B)中，聚合酶链式反应的退火温度为T_平均±5℃，其中T_平均为所有引物的Tm的算术平均值；

并且，所述反应在低拷贝模板的条件下能扩增出全部特异性扩增产物；其中，所述的“低拷贝模板”指反应体系中模板的总含量≤5ng；

并且，所述的模板包括抽提的全基因组DNA模板。

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