CN106581776A - 定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架及其制备方法 - Google Patents

定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架及其制备方法，将胶原、壳聚糖和丝素蛋白按质量比为1:1:1~7的比例混合，制备胶原/壳聚糖/丝素蛋白悬浊液，然后将悬浊液进行注模和固型，并对制得的定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架进行交联和灭菌处理。本发明的定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架具有纵贯材料内部的多微孔结构，有利于软骨组织原位再生修复时骨髓间充质干细胞向损伤处的移行以及营养物质的获取和代谢废物的排出，同时具有良好的生物相容性、可降解性和低免疫原性，是一种较理想的组织再生修复材料。

Description

定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用领域，具体涉及一种定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架及其制备方法。
背景技术
因肿瘤和运动损伤等多种原因引起关节软骨缺损发病率的逐年增加对人类健康造成了极大的威胁。组织工程的出现为软骨缺损治疗带来了新技术和新方法，具有良好生物活性和生物相容性的可降解生物材料的研究使关节软骨缺损的再生修复成为可能，其中三维多孔生物材料的构建是重要的研究方向之一。
组织工程支架多用天然生物材料或人工合成高分子材料制备而成，具有结构仿生的三维空间结构，有利于细胞代谢产物的排出以及营养物质、生长因子等交流，从而促进细胞的粘附、生长和分化。
在用于软骨组织工程的天然材料中，丝素蛋白（Silk fibroin, SF）具有良好的生物相容性，可维持软骨细胞正常生长状态和性能，可用于软骨及骨重建和再生。此外，作为动物体内含量最丰富、分布最广泛的蛋白质，胶原(Collagen, COL)具有独特的三螺旋结构、低抗原性、无毒性、良好的生物相容性和生物可降解性等特点，已被广泛应用于组织工程支架材料、药物控缓释***、基因传递载体、美容外科等生物医用领域。
壳聚糖（Chitosan，CS）是一种天然高分子生物材料，为线性多糖，是细胞外基质成分—氨基多糖(GAG) 的异构物，在自然界中广泛存在，主要存在于海洋生物的甲壳以及真菌细胞壁中，是一种来源广泛、容易获得并具有良好生物相容性的可降解生物材料。它具有良好的生物相容性、可降解性、易于改性以及无毒性、无刺激性等优良特点，是一种应用较广泛的组织工程支架材料，在骨、软骨和皮肤组织工程等方面具有良好的应用前景。
本发明结合天然胶原、壳聚糖和丝素蛋白的优点，制备一种可用于软骨缺损修复的复合支架。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架及其制备方法。本发明的定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架解决了软骨原位再生修复中内源性骨髓间质干细胞向损伤处移行问题，并利于营养物质、氧气和代谢产物的运输，同时具有良好是生物相容性、可降解性和无免疫原性的特点，是一种较好的组织工程医用材料。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架，以胶原、壳聚糖和丝素蛋白为主要原料制得，所述胶原、壳聚糖和丝素蛋白的质量比为1:1:1~7；所述复合支架本体为圆柱体，其横截面为圆形，横截面的直径为5 mm。
所述胶原来源于鱼皮、猪皮、牛皮或牛腱；丝素蛋白为蚕茧中提取。
如上所述定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架的制备方法，包括如下步骤：
（1）提取丝素蛋白并配制成丝素蛋白悬浊液；
（2）分别将胶原、壳聚糖溶于冰醋酸中制备成胶原悬浊液和壳聚糖悬浊液；
（3）将步骤（2）所得胶原悬浊液与壳聚糖悬浊液漩涡搅拌混合均匀；
（4）将步骤（1）所得的丝素蛋白悬浊液缓慢加入步骤（3）的混合漩涡悬浊液中，混合均匀；随后进行抽真空处理，之后再静置6 h，得到胶原/壳聚糖/丝素蛋白凝胶状悬浊液；
（5）将步骤（4）配制的胶原/壳聚糖/丝素蛋白凝胶状悬浊液注入复合支架成型模具中，进行注模和冷淋固型处理后，再进行冻干成型处理制得定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架；
（6）采用京尼平和乙醇混合溶液对步骤（5）制得的定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架进行交联及灭菌处理。
步骤（1）中所述丝素蛋白悬浊液浓度为2.4wt%；步骤（2）所述胶原悬浊液浓度为0.6wt%，壳聚糖悬浊液浓度为2wt%，冰醋酸浓度为1vt%；
步骤（1）所述丝素蛋白悬浊液的制备方法如下：
（A）将剪碎的蚕茧放入质量分数为0.5% Na2CO3溶液中，在98±2℃水浴中放置30 min，去除蚕茧上胶质，反复操作3次后烘干，得到丝素；
（B）称取步骤（A）所述的丝素，在78℃下，在CaCl2/H2O/C2H5OH混合溶液中溶解，纱布过滤，得到粗滤液；所述CaCl2/H2O/C2H5OH混合溶液的中CaCl2、H2O和C2H5OH的摩尔比为1:8:2；所述丝素与CaCl2/H2O/C2H5OH混合溶液的质量比为1:25；
（C）将步骤（B）所得粗滤液倒入透析袋中透析3 d，除去氯化钙和乙醇；再过滤，得到丝素蛋白悬浊液；所述透析袋的截留分子量为8000-14000；
所述步骤（5）具体按照以下步骤实施：
（D）将胶原/壳聚糖/丝素蛋白凝胶状悬浊液注入复合支架成型模具中，以铁棒封闭复合支架成型模具的两端；
（E）以垂钓的方式将复合支架成型模具顺轴向缓慢并匀速浸入液氮中，对注入复合支架成型模具中的胶原/壳聚糖/丝素蛋白凝胶状悬浊液进行冷淋固型处理，待复合支架成型模具完全侵入液氮后，继续在液氮中保留10 h～14 h；
（F）将复合支架成型模具连同内部注入的胶原/壳聚糖/丝素蛋白凝胶状悬浊液一同转入-90℃～-70℃的冰箱中冷藏；
（G）将复合支架成型模具从-90℃～-70℃的冰箱中取出，迅速去除复合支架成型模具两端的铁棒；
（H）随后将复合支架成型模具放置于预冷好的冷冻干燥机冻干3 d；
（I）将经步骤（2）冻干后的复合支架成型模具放置于真空状态下并升温至室温，保持6h后，解除真空状态；
（J）将复合支架从复合支架模具中取出，按不同的要求，裁剪成不同长度的复合支架，即制备得到定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架。
所述的复合支架成型模具，包括有中空的硅胶管（1），所述的中空的硅胶管（1）的两端各链接有一个大小相同的铁棒（2），所述硅胶管（1）中填充有胶原/壳聚糖/丝素蛋白凝胶状悬浊液；所述硅胶管（1）的尺寸为：长为10 cm，横截面外径为7 mm，内径为5 mm；所述铁棒（2）的尺寸为：长为2 cm，横截面直径为5 mm。
所述步骤（6）具体按照以下步骤实施：
（K）分别称取京尼平和无水乙醇，将称取的京尼平与无水乙醇混合，配制成质量百分比浓度为0.5%～1.5%的京尼平和乙醇混合溶液；
（L）将定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架放入步骤（K）配制的京尼平和乙醇混合溶液中进行交联处理，交联时间为46 h～50 h；
（M）经步骤（L）交联处理后，将定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架用去离子水和质量百分比浓度为95%的酒精反复清洗，直到京尼平被完全洗出；
（N）经步骤（M）清洗后的定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架迅速再次放入-90℃～-70℃的冰箱中冷冻，接着再次置于冷冻干燥机里冻干，最后用Co60照射定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架进行灭菌处理。
本发明的有益效果在于：本发明制备的定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架具有促进营养物质、氧气和代谢产物运输的微管样结构，骨髓间充质干细胞能够通过复合支架中空结构向软骨受损处移行和增殖，有效的促进软骨再生。
附图说明
图1是本发明的制备方法中采用的复合支架成型模具的结构图（图中1为中空的硅胶管，2为铁棒）；
图2是一种定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架的横切面扫描电镜照片；
图3是一种定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架的纵切面扫描电镜照片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明。
实施例一
1提取丝素蛋白：
（1）将剪碎的蚕茧放入质量分数为0.5%Na2CO3溶液，在98±2℃水浴中放置30min，去除蚕茧上胶质，反复操作3次后烘干，得到丝素；
（2）在78℃下，称取丝素，以质量比为1:25在CaCl2/H2O/C2H5OH混合溶液中溶解，纱布过滤，得到粗滤液；混合溶液的中CaCl2/H2O/C2H5OH的摩尔比为1:8:2；
（3）将粗滤液倒入透析袋中透析3d，除去氯化钙和乙醇；再过滤，得到丝素蛋白溶液；所述透析袋的截留分子量为8000-14000。
（4）取5个干净玻璃皿，称重（M0），每个培养皿中加入适量的丝素蛋白称重（M1），置于80℃烘箱8h后称重，然后每隔30min称重，直到重量不在变化（M2）。用以下公式计算浓度，取平均值：
1)丝素蛋白的浓度（%）=[(M2-M1)/(M1-M0)]×100%，
2)提取的丝素蛋白质量百分比为2.4wt%；
2分别称取胶原、壳聚糖和丝素蛋白，按胶原/壳聚糖/丝素蛋白的质量比为1:1:1进行混合，配制出胶原/壳聚糖/丝素蛋白凝胶状悬浊液：
（1）称取干湿比为1.03%的胶原悬浊液，用体积百分数为1%的冰醋酸配成质量百分比为0.6wt%的胶原悬浊液，所用胶原为鱼皮胶原；
（2）称取壳聚糖溶于体积百分数为1%的冰醋酸中，配成质量百分比为2wt%的壳聚糖悬浊液；
（3）将步骤（1）得到的胶原悬浊液与步骤（2）得到的冰醋酸悬浊液在漩涡搅拌器作用下混合，漩涡2～3分钟后得到胶原/壳聚糖凝胶状悬浊液；
（4）再将步骤1得到的丝素蛋白悬浊液在漩涡搅拌器作用下缓慢加入步骤（3）得到的胶原/壳聚糖凝胶状悬浊液中，并持续搅拌3～5分钟，得到混合悬浊液；
（5）将步骤（4）得到的混合悬浊液，先进行抽真空处理，再静置6h，即得到胶原/壳聚糖/丝素蛋白凝胶状悬浊液。
3将步骤2配制的胶原/壳聚糖/丝素蛋白凝胶状悬浊液注入成型磨具中，进行注模和冷淋固型处理：
（1）将经步骤2得到的胶原/壳聚糖/丝素蛋白凝胶状悬浊液注入复合支架成型模具中，该模具如图1所示，以铁棒封闭复合支架成型模具的两端，防止胶原/壳聚糖/丝素蛋白凝胶状悬浊液流出；
（2）以垂钓的方式将复合支架成型模具顺轴向缓慢并匀速侵入液氮中，对注入复合支架成型模具中的胶原/壳聚糖/丝素蛋白凝胶状悬浊液进行冷淋固型处理，待复合支架成型模具完全侵入液氮后，继续在液氮中保留10～14 h；
（3）经步骤（2），将成型模具连同内部注入的胶原/壳聚糖/丝素蛋白凝胶状悬浊液一同转入-90℃～-70℃的冰箱中冷藏。
4制备出定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架；
（1）将复合支架成型磨具从-90℃～-70℃的冰箱中取出，迅速去除复合支架成型模具两端的铁棒；
（2）经步骤（1），将复合支架成型模具置于预冷的冷冻干燥机冻干3d；
（3）将经步骤（2）冻干后的复合支架成型模具置于真空状态下并升温至室温，保持6h，解除真空状态；
（4）将复合支架从复合支架模具中取出，按不同的要求，裁剪成不同长度的复合支架，即得到制备的定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架。
5采用京尼平和乙醇混合溶液对步骤4制得的定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架进行交联及灭菌处理：
（1）分别称取京尼平和无水乙醇，将称取的京尼平与无水乙醇混合，配制成质量百分比浓度为0.5%～1.5%的京尼平和乙醇混合溶液；
（2）将经步骤4制备出的定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架放入步骤（1）中配制的京尼平和乙醇混合溶液中进行交联处理，交联时间为46～50 h；
（3）经交联处理后，将定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架用去离子水和质量百分比浓度为95%的酒精反复清洗，直到京尼平被完全洗出；
（4）将清洗后的定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架立即再次冻干，最后用Co60辐照定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架进行灭菌处理。
制备本发明的定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架成型模具，如图1所示，包括中空硅胶管1，中空硅胶管1的两端各连接有一个大小相同的铁棒，中空硅胶管中填充有胶原/壳聚糖/丝素蛋白凝胶状悬浊液，其中中空硅胶管1的尺寸为：长10 cm，横截面外径为7 mm，横截面内径为5 mm；实心的钢管2的尺寸为：长2 cm，横截面直接为5 mm。
用SEM对定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架的横切面和纵切面分别进行表征。结果发现：整个复合支架的表面有大量的微孔（图2），且纵面显示成均匀的管状（图3）。
实施例二
改变实施例1中的鱼皮胶原为猪皮胶原，且胶原/壳聚糖/丝素蛋白的质量比为1:1:3，其他步骤与实施例一相同，制备定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架。
实施例三
改变实施例一中的鱼皮胶原为为牛腱胶原，且胶原/壳聚糖/丝素蛋白的质量比为1:1:7，其他步骤与实施例一相同，制备定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (8)

1.一种定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架，其特征在于：以胶原、壳聚糖和丝素蛋白为主要原料制得，所述胶原、壳聚糖和丝素蛋白的质量比为1:1:1~7；所述复合支架本体为圆柱体，其横截面为圆形，横截面的直径为5 mm。
2.根据权利要求1所述一种定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架，其特征在于：所述胶原来源于鱼皮、猪皮、牛皮或牛腱；丝素蛋白为蚕茧中提取。
3.一种如权利要求1所述定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）提取丝素蛋白并配制成丝素蛋白悬浊液；
（2）分别将胶原、壳聚糖溶于冰醋酸中制备成胶原悬浊液和壳聚糖悬浊液；
（3）将步骤（2）所得胶原悬浊液与壳聚糖悬浊液漩涡搅拌混合均匀；
（4）将步骤（1）所得的丝素蛋白悬浊液缓慢加入步骤（3）的混合漩涡悬浊液中，混合均匀；随后进行抽真空处理，之后再静置6 h，得到胶原/壳聚糖/丝素蛋白凝胶状悬浊液；
（5）将步骤（4）配制的胶原/壳聚糖/丝素蛋白凝胶状悬浊液注入复合支架成型模具中，进行注模和冷淋固型处理后，再进行冻干成型处理制得定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架；
（6）采用京尼平和乙醇混合溶液对步骤（5）制得的定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架进行交联及灭菌处理。
4.根据权利要求3所述一种定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述丝素蛋白悬浊液浓度为2.4wt%；步骤（2）所述胶原悬浊液浓度为0.6wt%，壳聚糖悬浊液浓度为2wt%，冰醋酸浓度为1vt%。
5.根据权利要求3所述一种定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述丝素蛋白悬浊液的制备方法如下：
（A）将剪碎的蚕茧放入质量分数为0.5% Na2CO3溶液中，在98±2℃水浴中放置30 min，去除蚕茧上胶质，反复操作3次后烘干，得到丝素；
（B）称取步骤（A）所述的丝素，在78℃下，在CaCl2/H2O/C2H5OH混合溶液中溶解，纱布过滤，得到粗滤液；所述CaCl2/H2O/C2H5OH混合溶液的中CaCl2、H2O和C2H5OH的摩尔比为1:8:2；所述丝素与CaCl2/H2O/C2H5OH混合溶液的质量比为1:25；
（C）将步骤（B）所得粗滤液倒入透析袋中透析3 d，除去氯化钙和乙醇；再过滤，得到丝素蛋白悬浊液；所述透析袋的截留分子量为8000-14000。
6.根据权利要求3所述定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）具体按照以下步骤实施：
（D）将胶原/壳聚糖/丝素蛋白凝胶状悬浊液注入复合支架成型模具中，以铁棒封闭复合支架成型模具的两端；
（E）以垂钓的方式将复合支架成型模具顺轴向缓慢并匀速浸入液氮中，对注入复合支架成型模具中的胶原/壳聚糖/丝素蛋白凝胶状悬浊液进行冷淋固型处理，待复合支架成型模具完全侵入液氮后，继续在液氮中保留10 h～14 h；
（F）将复合支架成型模具连同内部注入的胶原/壳聚糖/丝素蛋白凝胶状悬浊液一同转入-90℃～-70℃的冰箱中冷藏；
（G）将复合支架成型模具从-90℃～-70℃的冰箱中取出，迅速去除复合支架成型模具两端的铁棒；
（H）随后将复合支架成型模具放置于预冷好的冷冻干燥机冻干3 d；
（I）将经步骤（2）冻干后的复合支架成型模具放置于真空状态下并升温至室温，保持6h后，解除真空状态；
（J）将复合支架从复合支架模具中取出，按不同的要求，裁剪成不同长度的复合支架，即制备得到定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架。
7.根据权利要求3或6所述定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架的制备方法，其特征在于：所述的复合支架成型模具，包括有中空的硅胶管（1），所述的中空的硅胶管（1）的两端各链接有一个大小相同的铁棒（2），所述硅胶管（1）中填充有胶原/壳聚糖/丝素蛋白凝胶状悬浊液；所述硅胶管（1）的尺寸为：长为10 cm，横截面外径为7 mm，内径为5 mm；所述铁棒（2）的尺寸为：长为2 cm，横截面直径为5 mm。
8.根据权利要求3所述定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤（6）具体按照以下步骤实施：
（K）分别称取京尼平和无水乙醇，将称取的京尼平与无水乙醇混合，配制成质量百分比浓度为0.5%～1.5%的京尼平和乙醇混合溶液；
（L）将定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架放入步骤（K）配制的京尼平和乙醇混合溶液中进行交联处理，交联时间为46 h～50 h；
（M）经步骤（L）交联处理后，将定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架用去离子水和质量百分比浓度为95%的酒精反复清洗，直到京尼平被完全洗出；
（N）经步骤（M）清洗后的定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架迅速再次放入-90℃～-70℃的冰箱中冷冻，接着再次置于冷冻干燥机里冻干，最后用Co60照射定向微孔胶原/壳聚糖/丝素蛋白复合支架进行灭菌处理。
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