CN106555010A - 人类***瘤病毒检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

人类***瘤病毒检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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CN106555010A
CN106555010A CN201510643113.8A CN201510643113A CN106555010A CN 106555010 A CN106555010 A CN 106555010A CN 201510643113 A CN201510643113 A CN 201510643113A CN 106555010 A CN106555010 A CN 106555010A
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曹汀
彼特·佛利伯
李佩珊
苏资茜
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Jiangsu Bo Fu Biotechnology Medical Technology Co Ltd
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
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Abstract

本发明涉及一种人类***瘤病毒检测试剂盒及检测方法。该检测试剂盒包括微载体以及多种bDNA寡核苷酸探针。微载体至少有一种，且每种微载体的编码信息与HPV的亚型一一对应。该bDNA寡核苷酸探针包括捕获探针、检测探针、延长探针、阻断探针、预放大探针、放大探针及标记探针。该人类***瘤病毒检测试剂盒及检测方法使用bDNA检测原理，无需经核酸扩增反应，bDNA信号放大具有灵敏度高、检测范围大和准确定量等优点。

Description

人类***瘤病毒检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及检测试剂领域，尤其是涉及一种人类***瘤病毒检测试剂盒及检测方法。
背景技术
人类***瘤病毒(Human Papillomavirus，简称HPV)是一种DNA病毒，属于***瘤病毒科***瘤病毒属。该类病毒感染人体的表皮与黏膜组织。目前约有170种类型的HPV被判别出来。若反复感染某些高危险性，且又没有疣等症状的HPV类型，可能发展成为癌前病变，甚至是侵袭性癌症，且经研究得知目前高达99.7％的子***，为感染HPV所造成。
致癌型的人类乳突病毒又分为高危险型和低危险型，其中高危险型为第16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型，而低危险型为第6、11、42、43、44型，其中感染人类乳突病毒的患者，约有四分之一会形成人类乳突病毒的持续性感染者，若是感染高危险型的患者，则约有三分之一会形成子***前病变，如未治疗或未被发现，则将来会演变成子***。
HPV是环状之双股DNA病毒，Genome大小约7900bp，依基因功能可分为三大主要部份：
(1)上游具基因调控区域LCR(long control region)，具调控和转录的功能。
(2)早期调控基因包含E1、E2、E4、E5、E6、E7等基因，其具有复制和致癌性蛋白的产生，其中E6、E7的基因产物会结合RB及P53等抑癌蛋白，因而降解抑癌功能而影响细胞正常的生长调控功能并增加基因不稳定性，终将引发癌症。
(3)晚期调控基因则包括L1、L2，主要是用来制造结构蛋白。
其中E6和E7两个早期基因被认为和导致子***最有关系，其能抑制p53以及Rb两个肿瘤抑制基因。
目前传统的HPV检测试剂及检测方法有荧光定量PCR、杂交捕获法、流式荧光杂交法、基因芯片等，但大多数都需要经过核酸扩增反应等过程，检测步骤多，效率低，且检测灵敏度有待提高。
发明内容
基于此，有必要提供一种能提高检测效率和检测灵敏度的人类***瘤病毒检测试剂盒及检测方法。
一种人类***瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，包括微载体及bDNA寡核苷酸探针组；所述微载体上的编码信息与人类***瘤病毒的亚型一一对应；所述bDNA寡核苷酸探针组包括预放大探针、放大探针、标记探针，以及与所述亚型专一性对应的至少一组捕获探针、检测探针、延长探针和阻断探针；其中，
所述捕获探针用于包覆所述微载体，且所述捕获探针从其5’端至3’端依次为间隔臂序列以及与所述检测探针的一段互补配对的序列；
所述检测探针从其5’端至3’端依次为与人类***瘤病毒的核酸的一段互补配对的序列、间隔臂序列以及与所述捕获探针的一段互补配对的序列，针对每种所述亚型的所述检测探针有多种，且每种所述检测探针与所述核酸互补配对的序列不同；
所述延长探针从其5’端至3’端依次为与所述核酸的一段互补配对的序列、间隔臂序列以及与所述预放大探针的一段互补配对的序列，且针对每种所述亚型的所述延长探针有多种，每种所述延长探针与所述核酸互补配对的序列不同，且所述延长探针中与所述核酸互补配对的序列与所述检测探针中与所述核酸互补配对的序列也均不同；
针对每种所述亚型的阻断探针有多种，多种所述阻断探针的序列与所述核酸上未结合所述检测探针和所述延长探针的部分分别互补配对；
所述预放大探针从其从其5’端至3’端依次为与所述放大探针的一段互补配对的序列以及与所述延长探针的一段互补配对的序列；
所述放大探针从其5’端至3’端依次为与所述标记探针互补配对的序列以及与所述预放大探针的一段互补配对的序列；
所述标记探针的序列与所述放大探针的序列互补配对，且所述标记探针的5’端连接有标记物。
一种人类***瘤病毒的检测方法，使用上述任一实施例所述的人类***瘤病毒检测试剂盒，所述检测方法包括如下步骤：
于多孔板的微孔中加入微载体试剂，所述微载体试剂中含有包覆有所述捕获探针的所述微载体，且对应每种所述亚型，所述微载体的编码信息与所述捕获探针一一对应；
将待测样本加入样本采集液中，配置实验组溶液，并加入至所述微孔中；
向所述微孔中加入含有检测探针、延长探针及阻断探针的处理液以及蛋白激酶K试剂，于45-75℃、500-2000rpm震荡混匀，再于40-60℃、500-1500rpm震荡混匀；
向所述微孔中加入含有预放大探针的处理液，于40-60℃、500-2000rpm震荡混匀；
向所述微孔中加入含有放大探针的处理液，于40-60℃、500-2000rpm震荡混匀；
向所述微孔中加入含有标记探针的处理液，于40-60℃、500-2000rpm震荡混匀；
向所述微孔中加入荧光标记物，于30-50℃、500-2000rpm震荡混匀；
清洗所述多孔板后，再使用影像识别***辨识所述微载体的编码信息，并检测对应的标记信号，经分析处理得到检测结果。
本发明的人类***瘤病毒检测试剂盒及检测方法使用bDNA检测原理，无需经核酸扩增反应，bDNA信号放大具有灵敏度高、检测范围大和准确定量等优点。该人类***瘤病毒检测试剂盒及检测方法可一次性针对样本进行检测，从而可以减少所需的样本量，并有效提高检测效率。该检测试剂盒及检测方法可结合多元检测以多重筛检技术及结合多元化生医检测***，从而可以增加临床精准度与简便性。
附图说明
图1为微载体、样本RNA、bDNA寡核苷酸探针及标记物的结合示意图，图中，Hybridization表示杂交；
图2为实施例1中人类***瘤病毒的检测方法的实验流程图。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的人类***瘤检测试剂盒及检测方法作进一步详细的说明。
如图1所示，一实施方式的人类***瘤病毒检测试剂盒，包括微载体试剂以及bDNA(分支DNA)寡核苷酸探针组。
微载体试剂中含有微载体(Microcarrier)。微载体上设有用于供影像识别***辨识的编码信息，并且其表面设有修饰层，如物理修饰层或化学修饰层。其中化学修饰层可以但不限于经由羧化作用处理形成的修饰层。对于经羧化作用处理的微载体可藉EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)活化羧基进行反应，将带有氨基的专一性探针结合于微载体表面，形成探针包覆的微载体。微载体容量高，可作为多元载体。当检测样本有多种时，微载体可以针对性的设计为多种。在本实施方式中，微载体试剂中至少含有一种微载体且微载体上的编码信息与人类***瘤病毒的亚型一一对应。
bDNA寡核苷酸探针组包括捕获探针(Capture Probe，CP)、检测探针(CaptureExtender，CE)、延长探针(Label Extender，LE)、阻断探针(Blocking Probe，BP)、预放大探针(Pre-Amplifier)、放大探针(Amplifier)及标记探针(Label Probe，LP)。其中，捕获探针与微载体对应用于包覆微载体。检测探针部分用于与捕获探针相配对结合、部分用于与人类***瘤病毒的核酸相配对结合。延长探针部分用于与核酸相配对结合、部分用于与预放大探针相配对结合。阻断探针用于与核酸上未结合检测探针和延长探针的部分相配对结合。预放大探针部分用于与延长探针相配对结合，部分用于与放大探针相配对结合。放大探针部分用于与预放大探针配对结合，部分用于与标记探针相配对结合。标记探针用于与放大探针配对结合，且标记探针连接有标记物。
具体在本实施方式中，捕获探针从其5’端至3’端依次为间隔臂序列以及与检测探针的一段互补配对的序列。捕获探针可以与微载体通过物理作用或化学作用连接。对于化学作用连接的，可以在捕获探针的5’端连接捕获基团。捕获基团与微载体表面的化学修饰层对应，可以与微载体共价结合。在一实施方式中，捕获基团如可以为氨基等，氨基可以与微载体表面的活化羧基反应结合。在本实施方式的检测试剂盒中，捕获探针直接包覆在微载体的表面，也即微载体预先包覆有捕获探针。且对应每种HPV亚型，捕获探针与微载体一一对应。采用直接包覆的方式，无需在检测时进行包覆，从而可以简化检测过程，提高检测效率。
检测探针从其5’端至3’端依次为与人类***瘤病毒的核酸的一段互补配对的序列、间隔臂序列以及与捕获探针的一段互补配对的序列，且针对每种亚型，每种检测探针有多条，多条检测探针中与核酸互补配对的序列不同。延长探针从其5’端至3’端依次为与核酸的一段互补配对的序列、间隔臂序列以及与预放大探针的一段互补配对的序列，且针对每种亚型，每种延长探针有多条，多条延长探针中与核酸互补配对的序列不同，且延长探针中与核酸互补配对的序列与检测探针中与核酸互补配对的序列也均不同。针对每种亚型，阻断探针有多条，多条阻断探针的序列与核酸上未结合检测探针和延长探针的部分分别互补配对。预放大探针从其从其5’端至3’端依次为与放大探针的一段互补配对的序列以及与延长探针的一段互补配对的序列。放大探针从其5’端至3’端依次为与标记探针互补配对的序列以及与预放大探针的一段互补配对的序列。标记探针的序列与放大探针的序列互补配对，且标记物连接在标记探针的5’端。
上述间隔臂序列用于增加与目标物结合的空间。间隔臂序列可以但不限于为poly T序列，并且其中胸下嘧啶的数量不定，如捕获探针的间隔臂序列中胸腺嘧啶的数量可以为7～11个，优选9个；检测探针的间隔臂序列中胸腺嘧啶的数量为3～7个，优选5个；延长探针的间隔臂序列中胸腺嘧啶的数量为3～7个，优选5个。
进一步，在本实施方式中，人类***瘤病毒检测试剂盒还可以包括本领域技术人员常用的样本采集液、清洗试剂、蛋白激酶K试剂(Proteinase K)、人类***瘤病毒阳性RNA标准品、人类***瘤病毒阴性RNA标准品及链霉亲和素标记的藻红荧光蛋白(SA-PE)试剂中的至少一种。
在本实施方式中，针对多种人类***瘤病毒亚型，捕获探针、检测探针、延长探针及阻断探针均对应设有多种，且每种与一种人类***瘤病毒亚型相对应，也即具有亚型专一性，如在一实施方式中，针对20种常见的人类***瘤病毒亚型进行检测，包括高风险的16亚型、18亚型、31亚型、33亚型、35亚型、39亚型、45亚型、51亚型、52亚型、56亚型、58亚型、59亚型、66亚型和68亚型以及低风险的6亚型、11亚型、40亚型、42亚型、43亚型和44亚型。探针设计以人类***瘤病毒的核酸为标准，如其表达的mRNA上E6及E7区域等。
针对上述20种常见的人类***瘤病毒亚型，对其中每一种亚型，捕获探针都对应有型别专一单股核酸探针，用以包覆(coating)于微载体。如针对20种上述常见的亚型，在本实施方式中，捕获探针的序列设计如下表1所示，对应序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.24所示的序列，其中SEQ ID No.1～SEQ ID No.3为对照组探针。
表1捕获探针(CP)的核苷酸序列
注：“HPV-CP-G-1”与“HPV-CP-G-2”的“G”表示：GADPH；
“HPV-CP-B”的“B”表示：Blank；
“HPV-CP-”后数字代表不同的人类***瘤病毒亚型；
以下同理。
对每一种亚型，检测探针都对应有型别专一性之单股核酸探针，一部分可结合于捕获探针，另一部分则结合于HPV E6/E7mRNA区域上。如针对20种上述常见的亚型，在本实施方式中，检测探针的序列设计如下表2所示，对应序列表中SEQ ID No.25～SEQ ID No.175所示的序列，其中SEQ ID No.25～SEQ ID No.34为对应的对照组探针。
表2检测探针(CE)的核苷酸序列
对每一种亚型，延长探针都对应有型别专一性之单股核酸探针，一部分可结合于预放大探针，另一部分则结合于HPV E6/E7mRNA区域上。延长探针的序列设计如下表3所示，对应序列表中SEQ ID No.176～SEQ ID No.448所示的序列，其中，No.176～SEQ ID No.185为对应的对照组探针。
表3检测探针(LE)的核苷酸序列
对每一种亚型，阻断探针都对应有型别专一性之单股核酸探针，结合于未被CE与LE所包覆的HPV E6/E7mRNA剩余区。如针对20种上述常见的亚型，在本实施方式中，阻断探针的序列设计如下表4所示，对应序列表中SEQ IDNo.449～SEQ ID No.608所示的序列，其中，SEQ ID No.449～SEQ ID No.455为对应的对照组探针。
表4阻断探针(BP)的核苷酸序列
预放大探针可以为通用的单股核酸探针，同一序列包含两部分，一部分可结合于LE，另一部分结合于放大探针上。针对上述设计的检测探针、延长探针，本实施方式的预放大探针的序列设计为5’-(AGGAATCCATTAACGAGACTGAGAT)nAGGAATCCATTAACGAGACTGAAAAACGGTAACTTCATGCTTTGACTCAG-3’，对应序列表中SEQ ID No.609所示的序列，其中n为放大倍数，n为2～30的整数。
放大探针可以为通用的单股核酸探针，同一序列包含两部分，一部分可结合于预放大探针，另一部分结合于标记探针上。针对上述设计的预放大探针，本实施方式的放大探针的序列设计为5’-ATCTCAGTCTCGTTAATGGATTCCT(GATGTGGTTGTCGTACTT)nAAGCTTGGATCC-3’，对应序列表中SEQ ID No.610所示的序列，其中n为放大倍数，n为2～30的整数。
标记探针可以为通用的单股核酸探针，结合于放大探针上。标记探针的5’端连接有标记物，如生物素(Biotin)、链霉亲和素等，若为生物素，则可选用链霉亲和素标记的荧光蛋白作为荧光物质，如链霉亲和素标记的藻红荧光蛋白的等，其可高度特异性地和生物素结合使检测标记物发出萤光。针对上述设计的放大探针，本实施方式的标记探针的序列设计为5’-AAGTACGACAACCACATC-3’，对应序列表中SEQ ID No.611所示的序列。
在本实施方式中，根据各探针的功能，将相应的探针配置处理液，如可以包括第一处理液、第二处理液、第三处理液及第四处理液。其中，第一处理液含有检测探针、延长探针及阻断探针。第二处理液含有预放大探针。第三处理液含有放大探针。第四处理液含有标记探针。
本实施例提供的试剂盒可以用于同时检测上述20种常见的人类***瘤病毒的亚型，相应的，捕获探针、检测探针、延长探针及阻断探针需要对应设计至少有20组；也可以用于检测上述20种常见的人类***瘤病毒的亚型中的至少一种，相应的，捕获探针、检测探针、延长探针及阻断探针对应设计其中的一组或多组。
本实施方式还提供了一种人类***瘤病毒的检测方法，其使用上述人类***瘤病毒检测试剂盒，该检测方法包括如下步骤：
步骤一：于多孔板的微孔中加入微载体试剂，所述微载体试剂中含有包覆有所述捕获探针的所述微载体，且对应每种所述亚型，所述微载体的编码信息与所述捕获探针一一对应。
其中，多孔板可以为常用的96微孔板等。
步骤二：将待测样本、人类***瘤病毒阳性RNA标准品和阴性RNA标准品分别加入样本采集液中，配置实验组溶液、阳性对照组溶液和阴性对照组溶液，并分别加入至微孔中。
待测样本、人类***瘤病毒阳性RNA标准品和阴性RNA标准品处理过程一致。可理解，在其他实施例中，也可以不用配置标准品溶液，相应的根据操作指南，给出标准品的检测参数，用于对照即可。
步骤三：向微孔中加入含有检测探针、延长探针及阻断探针的处理液以及蛋白激酶K试剂，于45-75℃、500-2000rpm震荡混匀，再于40-60℃、1500-2000rpm震荡混匀。
步骤四：向微孔中加入含有预放大探针的处理液，于40-60℃、500-2000rpm震荡混匀。
步骤五：向微孔中加入含有放大探针的处理液，于40-60℃、500-2000rpm震荡混匀。
步骤六：向微孔中加入含有标记探针的处理液，于40-60℃、500-2000rpm震荡混匀。
步骤七：向微孔中加入标记物，于30-50℃、500-2000rpm震荡混匀。
步骤八：清洗多孔板后，再使用影像识别***辨识微载体的编码信息，并检测对应的标记信号，经分析处理得到检测结果。
本实施方式所用的标记物为链霉亲和素标记的藻红荧光蛋白试剂，检测对应的标记信号是使用荧光亮度检测组件检测并量化微载体上的荧光信号，包括影像辨识***与萤光亮度检测组件，结合CCD相机与萤光显微镜之产品。本实施方式所用的影像识别***为PlexBio100，包括影像辨识***与萤光亮度检测元件，反应完成后使用者可将多孔板置于PlexBio100中进行读取与分析，该仪器会于所选择区域拍照，并藉影像辨识***辨识出影像中各微载体上的编码信息。分析处理是使用PlexBio100的软件***DeXipher进行分析处理，因各亚型的捕获探针于包覆时与微载体上的编码信息对应，该条件也预先写入软体***，所以***可成功辨识出每个微载体对应的信号。经软件分析计算后输出相关信息，包括:试剂名称、试剂批号、操作者、微载体对应之HPV型等信息及检测结果。
以下为实施例部分
实施例1
实施例1的检测试剂盒可同时检测20种常见的HPV亚型，包括高风险的16亚型、18亚型、31亚型、33亚型、35亚型、39亚型、45亚型、51亚型、52亚型、56亚型、58亚型、59亚型、66亚型和68亚型以及低风险的6亚型、11亚型、40亚型、42亚型、43亚型和44亚型。探针设计以人类***瘤病毒表达的mRNA上E6及E7区域为标准。
如图2所示，具体检测步骤如下：
将待测样本置于样本采集液中。HPV bDNA阳性标准品与HPV bDNA阴性标准品的处理方式同待测样本。
于96微孔板中加入HPV bDNA微载体试剂，该微载体试剂中含有包覆有捕获探针的微载体，且对应每种亚型，微载体的编码信息与捕获探针一一对应；
分别加入待测样本、HPV bDNA阳性标准品及HPV bDNA阴性标准品。
于96微孔板中加入HPV bDNA的第一处理液与蛋白激酶K试剂进行反应，其中第一处理液内含检测探针、延长探针及阻断探针，反应条件为温育60℃、1200rpm震荡1小时，然后改变反应条件为53℃、1200rpm震荡过夜。
于96微孔板中加入HPV bDNA第二处理液进行反应，其内含预放大探针，反应条件为温育50℃、1200rpm震荡1小时。
于96微孔板中加入HPV bDNA第三处理液进行反应，其内含放大探针，反应条件为温育50℃、1200rpm震荡1小时。
于96微孔板中加入HPV bDNA第四处理液进行反应，其内含标记探针，反应条件为温育50℃、1200rpm震荡1小时。
于96微孔板中加入链霉亲和素标记的藻红萤光蛋白试剂(SA-PE)进行反应，反应条件为温育37℃、1200rpm震荡10分钟。
清洗操作完成的96微孔板，再放入影像辨识***PlexBio100辨识磁珠条码，以及萤光亮度检测组件分析并量化磁珠上之萤光讯号，最后经由PlexBio100之软体***DeXipher进行分析计算后即会带出检验试剂组资讯之报告与检测结果。
可理解，在其他实施例中，各步骤的操作参数不限于上面具体的数值，操作参数的数值以前述数值范围为准。
检测结果如表8所示。
表8检测结果
由上述表8可以看出，本发明的人类***瘤病毒检测试剂盒及检测方法使用bDNA检测原理，无需经核酸扩增反应，bDNA信号放大具有灵敏度高、检测范围大和准确定量等优点。该人类***瘤病毒检测试剂盒及检测方法可一次性针对样本进行检测，从而可以减少所需的样本量，并有效提高检测效率。该检测试剂盒及检测方法可结合多元检测以多重筛检技术及结合多元化生医检测***，从而可以增加临床精准度与简便性。并可结合影像辨识***及相应的软体分析，可取得大量且完整的检测结果，检测效率进一步提高。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (18)

1.一种人类***瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，包括微载体及bDNA寡核苷酸探针组；所述微载体具有与人类***瘤病毒的亚型一一对应的编码信息；所述bDNA寡核苷酸探针组包括预放大探针、放大探针、标记探针，以及与所述亚型专一性对应的至少一组捕获探针、检测探针、延长探针和阻断探针；其中，
所述捕获探针用于包覆所述微载体，且所述捕获探针从其5’端至3’端依次为间隔臂序列以及与所述检测探针的一段互补配对的序列；
所述检测探针从其5’端至3’端依次为与人类***瘤病毒的核酸的一段互补配对的序列、间隔臂序列以及与所述捕获探针的一段互补配对的序列，针对每种所述亚型的所述检测探针有多种，且每种所述检测探针与所述核酸互补配对的序列不同；
所述延长探针从其5’端至3’端依次为与所述核酸的一段互补配对的序列、间隔臂序列以及与所述预放大探针的一段互补配对的序列，且针对每种所述亚型的所述延长探针有多种，每种所述延长探针与所述核酸互补配对的序列不同，且所述延长探针中与所述核酸互补配对的序列与所述检测探针中与所述核酸互补配对的序列也均不同；
针对每种所述亚型的阻断探针有多种，多种所述阻断探针的序列与所述核酸上未结合所述检测探针和所述延长探针的部分分别互补配对；
所述预放大探针从其从其5’端至3’端依次为与所述放大探针的一段互补配对的序列以及与所述延长探针的一段互补配对的序列；
所述放大探针从其5’端至3’端依次为与所述标记探针互补配对的序列以及与所述预放大探针的一段互补配对的序列；
所述标记探针的序列与所述放大探针的序列互补配对，且所述标记探针的5’端连接有标记物。
2.如权利要求1所述的人类***瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，所述微载体表面包覆有所述捕获探针，且对应每种所述亚型，所述微载体的编码信息与所述捕获探针一一对应。
3.如权利要求1所述的人类***瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，所述预放大探针中与所述放大探针互补配对的序列包括2～30段相同且依次连接的序列单元。
4.如权利要求3所述的人类***瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，所述放大探针中与所述标记探针互补配对的序列包括2～30段相同且依次连接的序列单元。
5.如权利要求1～4中任一项所述的人类***瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，所述核酸为人类***瘤病毒表达的mRNA上E6及E7区域。
6.如权利要求5所述的人类***瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，所述捕获探针包括针对6亚型设计的序列为SEQ ID No.4的寡核苷酸探针、针对11亚型设计的序列为SEQ ID No.5的寡核苷酸探针、针对16亚型设计的序列为SEQID No.6的寡核苷酸探针、针对18亚型设计的序列为SEQ ID No.7的寡核苷酸探针、针对31亚型设计的序列为SEQ ID No.8的寡核苷酸探针、针对33亚型设计的序列为SEQ ID No.9的寡核苷酸探针、针对35亚型设计的序列为SEQ IDNo.10的寡核苷酸探针、针对39亚型设计的序列为SEQ ID No.11的寡核苷酸探针、针对40亚型设计的序列为SEQ ID No.12的寡核苷酸探针、针对42亚型设计的序列为SEQ ID No.13的寡核苷酸探针、针对43亚型设计的序列为SEQ IDNo.14的寡核苷酸探针、针对44亚型设计的序列为SEQ ID No.15的寡核苷酸探针、针对45亚型设计的序列为SEQ ID No.16的寡核苷酸探针、针对51亚型设计的序列为SEQ ID No.17的寡核苷酸探针、针对52亚型设计的序列为SEQ IDNo.18的寡核苷酸探针、针对56亚型设计的序列为SEQ ID No.19的寡核苷酸探针、针对58亚型设计的序列为SEQ ID No.20的寡核苷酸探针、针对59亚型设计的序列为SEQ ID No.21的寡核苷酸探针、针对66亚型设计的序列为SEQ IDNo.22的寡核苷酸探针、针对68亚型设计的序列为SEQ ID No.23的寡核苷酸探针、以及针对68亚型设计的序列为SEQ ID No.24的寡核苷酸探针共21组寡核苷酸探针中的至少一组。
7.如权利要求6所述的人类***瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，所述检测探针包括针对6亚型设计的序列为SEQ ID No.35～SEQ ID No.41的7种寡核苷酸探针构成的探针组、针对11亚型设计的序列为SEQ ID No.42～SEQ ID No.48的7种寡核苷酸探针构成的探针组、针对16亚型设计的序列为SEQ IDNo.49～SEQ ID No.56的8种寡核苷酸探针构成的探针组、针对18亚型设计的序列为SEQ ID No.57～SEQ ID No.64的8种寡核苷酸探针构成的探针组、针对31亚型设计的序列为SEQ ID No.65～SEQ ID No.71的7种寡核苷酸探针构成的探针组、针对33亚型设计的序列为SEQ ID No.72～SEQ ID No.77的6种寡核苷酸探针构成的探针组、针对35亚型设计的序列为SEQ ID No.78～SEQ ID No.83的6种寡核苷酸探针构成的探针组、针对39亚型设计的序列为SEQ ID No.84～SEQID No.90的7种寡核苷酸探针构成的探针组、针对40亚型设计的序列为SEQ IDNo.91～SEQ ID No.97的7种寡核苷酸探针构成的探针组、针对42亚型设计的序列为SEQ ID No.98～SEQ ID No.104的7种寡核苷酸探针构成的探针组、针对43亚型设计的序列为SEQ ID No.105～SEQ ID No.110的6种寡核苷酸探针构成的探针组、针对44亚型设计的序列为SEQ ID No.111～SEQ ID No.116的6种寡核苷酸探针构成的探针组、针对45亚型设计的序列为SEQ ID No.117～SEQ ID No.122的6种寡核苷酸探针构成的探针组、针对51亚型设计的序列为SEQ IDNo.123～SEQ ID No.129的7种寡核苷酸探针构成的探针组、针对52亚型设计的序列为SEQ ID No.130～SEQ ID No.135的6种寡核苷酸探针构成的探针组、针对56亚型设计的序列为SEQ ID No.136～SEQ ID No.142的7种寡核苷酸探针构成的探针组、针对58亚型设计的序列为SEQ ID No.143～SEQ ID No.149的7种寡核苷酸探针构成的探针组、针对59亚型设计的序列为SEQ ID No.150～SEQ IDNo.155的6种寡核苷酸探针构成的探针组、针对66亚型设计的序列为SEQ IDNo.156～SEQ ID No.161的6种寡核苷酸探针构成的探针组、针对68亚型设计的序列为SEQ ID No.162～SEQ ID No.168的7种寡核苷酸探针构成的探针组、以及针对68亚型设计的序列为SEQ ID No.169～SEQ ID No.175的7种寡核苷酸探针构成的探针组共21组探针组中的至少一组，且针对每种所述亚型，所述检测探针与所述捕获探针对应设置。
8.如权利要求1～4中任一项所述的人类***瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，所述延长探针包括针对6亚型设计的序列为SEQ ID No.186～SEQ ID No.199的14种寡核苷酸探针构成的探针组、针对11亚型设计的序列为SEQ IDNo.200～SEQ ID No.215的16种寡核苷酸探针构成的探针组、针对16亚型设计的序列为SEQ ID No.216～SEQ ID No.231的16种寡核苷酸探针构成的探针组、针对18亚型设计的序列为SEQ ID No.232～SEQ ID No.247的16种寡核苷酸探针构成的探针组、针对31亚型设计的序列为SEQ ID No.248～SEQ ID No.259的12种寡核苷酸探针构成的探针组、针对33亚型设计的序列为SEQ ID No.260～SEQID No.273的14种寡核苷酸探针构成的探针组、针对35亚型设计的序列为SEQID No.274～SEQ ID No.285的12种寡核苷酸探针构成的探针组、针对39亚型设计的序列为SEQ ID No.286～SEQ ID No.296的11种寡核苷酸探针构成的探针组、针对40亚型设计的序列为SEQ ID No.297～SEQ ID No.310的14种寡核苷酸探针构成的探针组、针对42亚型设计的序列为SEQ ID No.311～SEQ ID No.322的12种寡核苷酸探针构成的探针组、针对43亚型设计的序列为SEQ ID No.323～SEQID No.336的14种寡核苷酸探针构成的探针组、针对44亚型设计的序列为SEQID No.337～SEQ ID No.248的12种寡核苷酸探针构成的探针组、针对45亚型设计的序列为SEQ ID No.349～SEQ ID No.360的12种寡核苷酸探针构成的探针组、针对51亚型设计的序列为SEQ ID No.361～SEQ ID No.374的14种寡核苷酸探针构成的探针组、针对52亚型设计的序列为SEQ ID No.375～SEQ ID No.386的12种寡核苷酸探针构成的探针组、针对56亚型设计的序列为SEQ ID No.387～SEQID No.398的12种寡核苷酸探针构成的探针组、针对58亚型设计的序列为SEQID No.399～SEQ ID No.410的12种寡核苷酸探针构成的探针组、针对59亚型设计的序列为SEQ ID No.411～SEQ ID No.422的12种寡核苷酸探针构成的探针组、针对66亚型设计的序列为SEQ ID No.423～SEQ ID No.434的12种寡核苷酸探针构成的探针组、以及针对68亚型设计的序列为SEQ ID No.435～SEQ ID No.448的14种寡核苷酸探针构成的探针组共20组探针组中的至少一组。
9.如权利要求8所述的人类***瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，所述阻断探针包括针对6亚型设计的序列为SEQ ID No.456～SEQ ID No.462的7种寡核苷酸探针构成的探针组、针对11亚型设计的序列为SEQ ID No.463～SEQ IDNo.467的5种寡核苷酸探针构成的探针组、针对16亚型设计的序列为SEQ IDNo.468～SEQ ID No.478的11种寡核苷酸探针构成的探针组、针对18亚型设计的序列为SEQ ID No.479～SEQ ID No.481的3种寡核苷酸探针构成的探针组、针对31亚型设计的序列为SEQ ID No.482～SEQ ID No.486的5种寡核苷酸探针构成的探针组、针对33亚型设计的序列为SEQ ID No.487～SEQ ID No.494的8种寡核苷酸探针构成的探针组、针对35亚型设计的序列为SEQ ID No.495～SEQ IDNo.504的10种寡核苷酸探针构成的探针组、针对39亚型设计的序列为SEQ IDNo.505～SEQ ID No.513的9种寡核苷酸探针构成的探针组、针对40亚型设计的序列为SEQ ID No.514～SEQ ID No.521的8种寡核苷酸探针构成的探针组、针对42亚型设计的序列为SEQ ID No.522～SEQ ID No.532的11种寡核苷酸探针构成的探针组、针对43亚型设计的序列为SEQ ID No.533～SEQ ID No.538的6种寡核苷酸探针构成的探针组、针对44亚型设计的序列为SEQ ID No.539～SEQ IDNo.542的4种寡核苷酸探针构成的探针组、针对45亚型设计的序列为SEQ IDNo.543～SEQ ID No.550的8种寡核苷酸探针构成的探针组、针对51亚型设计的序列为SEQ ID No.551～SEQ ID No.555的5种寡核苷酸探针构成的探针组、针对52亚型设计的序列为SEQ ID No.556～SEQ ID No.569的14种寡核苷酸探针构成的探针组、针对56亚型设计的序列为SEQ ID No.570～SEQ ID No.574的5种寡核苷酸探针构成的探针组、针对58亚型设计的序列为SEQ ID No.575～SEQ IDNo.579的5种寡核苷酸探针构成的探针组、针对59亚型设计的序列为SEQ IDNo.580～SEQ ID No.592的13种寡核苷酸探针构成的探针组、针对66亚型设计的序列为SEQ ID No.593～SEQ ID No.599的7种寡核苷酸探针构成的探针组、以及针对68亚型设计的序列为SEQ ID No.600～SEQ ID No.608的9种寡核苷酸探针构成的探针组共20组探针组中的至少一组，且针对每种所述亚型，所述阻断探针与所述检测探针及所述延长探针对应设置。
10.如权利要求9所述的人类***瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，所述捕获探针还包括序列为SEQ ID No.1～SEQ ID No.2的两种内参捕获探针以及序列为SEQ ID No.3的空白捕获探针；对应的，所述检测探针还包括序列为SEQ IDNo.25～SEQ ID No.34的10种内参检测探针，所述延长探针还包括序列为SEQ IDNo.176～SEQ ID No.185的10种内参延长探针，所述阻断探针还包括序列为SEQID No.449～SEQ ID No.455的7种内参阻断探针。
11.如权利要求9或10所述的人类***瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，所述预放大探针的序列为SEQ ID No.609。
12.如权利要求11所述的人类***瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，所述放大探针的序列为SEQ ID No.610。
13.如权利要求12所述的人类***瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，所述标记探针的序列为SEQ ID No.611。
14.如权利要求1所述的人类***瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，所述标记物为生物素。
15.一种人类***瘤病毒的检测方法，其特征在于，使用如权利要求1～14中任一项所述的人类***瘤病毒检测试剂盒，所述检测方法包括如下步骤：
于多孔板的微孔中加入微载体试剂，所述微载体试剂中含有包覆有所述捕获探针的所述微载体，且对应每种所述亚型，所述微载体的编码信息与所述捕获探针一一对应；
将待测样本加入样本采集液中，配置实验组溶液，并加入至所述微孔中；
向所述微孔中加入含有检测探针、延长探针及阻断探针的处理液以及蛋白激酶K试剂，于45-75℃、500-2000rpm震荡混匀，再于40-60℃、500-1500rpm震荡混匀；
向所述微孔中加入含有预放大探针的处理液，于40-60℃、500-2000rpm震荡混匀；
向所述微孔中加入含有放大探针的处理液，于40-60℃、500-2000rpm震荡混匀；
向所述微孔中加入含有标记探针的处理液，于40-60℃、500-2000rpm震荡混匀；
向所述微孔中加入荧光标记物，于30-50℃、500-2000rpm震荡混匀；
清洗所述多孔板后，再使用影像识别***辨识所述微载体的编码信息，并检测对应的标记信号，经分析处理得到检测结果。
16.如权利要求15所述的人类***瘤病毒的检测方法，其特征在于，还包括将人类***瘤病毒阳性RNA标准品和阴性RNA标准品加入至样本采集液中配置阳性对照组溶液和阴性对照组溶液，并对与所述待测样本同样操作的阳性对照实验和阴性对照实验的步骤。
17.如权利要求15所述的人类***瘤病毒的检测方法，其特征在于，所述荧光标记物为链霉亲和素标记的藻红荧光蛋白试剂；所述检测对应的标记信号是使用荧光亮度检测组件检测并量化所述微载体上的荧光信号。
18.如权利要求15所述的人类***瘤病毒的检测方法，其特征在于，所述影像识别***为PlexBio100；所述分析处理是使用PlexBio100的软件***DeXipher进行分析处理。
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