JP3880361B2

JP3880361B2 - 蛍光シグナル処理方法及びハイブリダイゼーション反応結果表示方法

Info

Publication number: JP3880361B2
Application number: JP2001318885A
Authority: JP
Inventors: 康行野崎; 俊子松本; 亮中重
Original assignee: Hitachi Software Engineering Co Ltd
Current assignee: Hitachi Software Engineering Co Ltd
Priority date: 2001-10-17
Filing date: 2001-10-17
Publication date: 2007-02-14
Anticipated expiration: 2021-10-17
Also published as: JP2003121441A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サンプル中に含まれる複数種類のDNA等の生体高分子の特徴を精密に観測することを可能とするバイオチップ、及び検出結果の精度評価の方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ゲノム配列が決定された種の増加に伴い、進化に対応すると見られる遺伝子を見つけ出し、どの生物も共通に持っていると考えられる遺伝子の集合を探索する、また、逆に種に個別な特徴を推測するため、種間の遺伝子の違いから何かを見出そうとする、いわゆるゲノム比較法が盛んに行われてきた。しかし近年、DNAマイクロアレイやＤＮＡチップ（以下、総称してバイオチップという）に代表されるインフラストラクチャの発達によって、分子生物学の興味は、種間の情報から種内の情報へ、すなわち同時発現解析へと移りつつあり、これまでの種間の比較と合わせて、情報の抽出から関連付けの場が大きく広がりを持ち始めている。
【０００３】
例えば、既知の遺伝子と同一の発現パターンを示す未知の遺伝子が見つかれば、その遺伝子には既知の遺伝子と同様の機能があると類推できる。これら遺伝子や蛋白質そのものの機能的な意味付けは、機能ユニットや機能グループといった形で研究されている。またそれらの間の相互作用も、既知の酵素反応データや物質代謝データとの対応付けによって、あるいはより直接的に、ある遺伝子を破壊あるいは過剰反応させ、その遺伝子の発現をなくすか、あるいは多量に発現させ、その遺伝子の直接的及び間接的影響を、全遺伝子の発現パターンを調べることによって解析している。
【０００４】
遺伝子の発現パターンを調べるとき、バイオチップを用いた実験では、まず調べたい生体組織に関するエレメントを用意しておく。ここで、エレメントとは実験対象の生体組織に関係するＤＮＡを一本鎖の状態で断片化したものであり、このエレメントを、スライドガラスやシリコンなどの基板上に、複数の同じ種類のエレメントをまとめて、１平方センチメートル当たり数百から数千の密度でスポッティングし固定化したものがバイオチップである。このスポッティングしたエレメントの集合体をスポットとよぶ。図１５に、バイオチップ１５００上のエレメント１５０２とスポット１５０１の関係を示す。図１５には、１つのスポット１５０１の拡大模式図も示す。また、ターゲットとは実験対象の生体組織から抽出したＤＮＡを一本鎖の状態で断片化したもの又はＲＮＡであり、バイオチップ上のエレメントと反応させるものを指す。細胞中の遺伝子が発現するときＤＮＡはＲＮＡに転写される。このＲＮＡを抽出し、蛍光標識してターゲットとする。ターゲットとエレメントとを反応させると、相補的な関係にある一本鎖同士が互いに結合されハイブリダイゼーションする。バイオチップでは、ハイブリダイゼーションを用い、生体組織での遺伝子の発現状態を観測することができる。
【０００５】
この分野において成功した事例として、Tsunodaらの薬の有効性に関する実験結果の報告がある（T. Tsunoda et al.: Discrimination of Drug Sensitivity of Cancer Using cDNA Microarray and Multivariate Statistical Analysis: Genome Informatics 1999 (1999, Dec.) pp.227-228, Universal Academy Press Inc.）。この実験の過程を図１に示す。実験では、正常細胞から抽出したＲＮＡと癌細胞から抽出したＲＮＡを各々異なる色の蛍光色素で標識し、それぞれを等量で混合し、バイオチップ上でエレメント（遺伝子）とハイブリダイズさせた後、双方の蛍光色素から発生される蛍光シグナルの強度を測定している。
【０００６】
図２は、この実験によって得られる各遺伝子の発現状態の表示方法を模式的に示した図である。この表示はバイオチップ上の遺伝子にハイブリダイズした正常細胞由来ターゲットの蛍光シグナルと癌細胞由来ターゲットの蛍光シグナルのデータをプロットしたもので、片方の軸（Y軸）に正常細胞、他方の軸（X軸）に癌細胞の蛍光シグナルをとっている。図中の一つのプロットが一つの遺伝子に対応する。データの分析においては、このXY平面において、直線X＝ｋの右側かあるいは直線Y＝ｋの上側の領域、かつ、Y軸と直線Y＝ｍXで挟まれる領域かあるいはX軸とY＝（１／ｍ）Xで挟まれる領域に着目する。前者はノイズによる微小な蛍光シグナルを排除するためのもので、後者は正常細胞中で働いているが癌細胞中では働かなくなる遺伝子、あるいは逆に癌細胞中で働くが正常細胞中では働かなくなる遺伝子を見つけるためのものである。ｍは通常、癌細胞または正常細胞に有意な度合いに応じて２〜数十を選択する。従って、図２の領域Ａに入る遺伝子と領域Ｂに入る遺伝子が特に注目したい遺伝子である。このような表示方法をとることで、特定の疾病に特異的に働く遺伝子の候補を絞り込むことが可能となっている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
バイオチップの性質として、実験から得られる蛍光シグナルの強弱は、実際のサンプルに含まれるRNA量に必ずしも対応していない。例えば、バイオチップ上のスポットAの蛍光シグナルがスポットBの蛍光シグナルの倍を観測したとき、サンプル中に含まれるスポットAに対応する遺伝子とスポットBに対応する遺伝子の量が倍の関係になっているとは限らない。なぜなら、バイオチップにスポッティングする分量が一定でないこと、スポット中に存在するエレメントの量が均一でないこと、スポットの粘度が一定でないこと、エレメントとターゲットの結合力がエレメント毎に異なること、温度や湿度などの環境の変化に技術が対応しきれていないこと、バイオチップ上でハイブリダイゼーションの反応効率を一定に維持する技術や、ハイブリダイゼーション後の蛍光の読み取り精度等が実験技術的に完全に確立されていないこと、などの様々な要因があるからである。
【０００８】
それ故、通常、研究者は、得られた蛍光シグナルのデータに対して正規化を施し、データの質的な部分に着目する。すなわち、正常細胞と癌細胞の各遺伝子の発現状態を観測する場合はエレメント（遺伝子）がどちらに特異的であったかとか、細胞***周期で各遺伝子の発現の変遷を観測する場合は細胞***の前期から後期にかけてどのエレメント（遺伝子）が次第に発現が強くなる傾向があるのかなどを蛍光シグナルデータから読み取っていく。したがって、バイオチップの実験では、質的な意味において再現性がなくてはならない。ところが実際の実験では、各スポットからの蛍光シグナルのレンジの幅が大きく、蛍光シグナルを画像データとして読み取りそれを数値化する際、シグナルの強さを正確に測定することができない。以下例をあげて説明する。
【０００９】
まず、サンプルに含まれるターゲットの量が多かったり、スポット中に含まれるエレメントが多かったりなどの理由で、スポットから非常に強く蛍光シグナルが発せられ、読み取った画像を数値化する際に、読み取り可能な数値の上限を超えてしまって計測ができないことがある。この場合、通常、蛍光シグナルの計測値は、読み取り可能な数値の上限で置き換えられてしまう。図３は、図１に示したように２つのサンプル間で遺伝子の振る舞いを計測したが、読み取り限界を超えたスポットを計測したときを表す図である。図３で点線の丸で囲んだスポット３０１が、読み取り限界を超えたスポットである。このスポット３０１は癌細胞のサンプルで強く発現が観測されたが、それが読み取り限界を超えて観測されたため、シグナルの最大値で置き換えられてしまった。読み取り限界のレンジが更に広ければ、このスポットは領域Bに含まれていた可能性もある。このように、強く発せられた蛍光シグナルを有効に利用することができなかったため、有用な情報を逃す恐れがあった。
【００１０】
また逆に、小さな蛍光シグナルであったため、有用な情報を見逃す恐れもある。図４の点線の丸４０１で囲んだ四角形の領域は、小さな蛍光シグナルであるため、データ解析の対象としない部分である。これは、そのスポットからの蛍光シグナルが、ノイズからくるものなのか、あるいは本当に小さく発現したのを観測したのか、判別できないためである。小さな発現でも、他の遺伝子の働きを誘導するといった重要な遺伝子もあるので、このような情報を見逃すのは避けたい。本発明は、このようなバイオチップ及び蛍光測定機器の特性と、蛍光測定機器から得られるデータの性質を鑑み、バイオチップを用いた実験からできるだけ多くの情報を取得するのに有効なバイオチップ及びデータ解析方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明では、１つのエレメントに対して、エレメントの濃度が異なるものを複数個チップ上にスポッティングする。ここでエレメントの濃度の違いとは、スポット中に含まれるエレメントの量の違いを意味する。これを模式的に表したのが図１６である。スポット１６０１が、スポット１６０２に含まれるエレメントの倍量のエレメントを含んでいたのならば、スポット１６０１はスポット１６０２の倍の濃度であるとする。
【００１２】
例えば、図５に示すように、濃度が２０％、４０％、６０％、８０％、１００％のものを５種類用意しておく。ここで濃度が１００％であるすべてのスポットは、エレメントの量が同じでなくてもよい。濃度は、エレメントの種類毎にあるスポットのエレメント量を１００％とし、そのスポットに対して相対的に２０％、４０％、６０％、８０％と決めればよい。
【００１３】
このバイオチップから蛍光シグナルを読み取って平面上にプロットした一例を図６に示す。このとき、エレメント１に対し、スポットD1、スポットE1のように濃い濃度のスポットで読み取り限界を超えたとき、スポットA1、スポットB1、スポットC1のような、読み取り限界を超えない濃度の薄いスポットでデータ解析を行えばよい。また逆に、エレメント２に対し、スポットA2、スポットB2、スポットC２のように濃度の薄いスポットで蛍光シグナルが弱くデータ解析の対象外になった場合、スポットD2、スポットE2のようなデータの対象外に入らないような濃度の濃いスポットでデータ解析を行えばよい。またエレメント３に対する、スポットA3、スポットB3、スポットC3、スポットD3、スポットE３のように、全ての濃度のスポットが読み取り限界を超える場合や、これとは逆に全ての濃度のスポットで蛍光シグナルが小さすぎてデータ解析の対象外の領域に含まれるときは、これらの蛍光シグナルのデータはデータ解析に使わないようにする。このような場合、濃度の種類を更に増やすことで、データ解析の対象領域に入るスポットをみつけるようにすればよい。このように、同じエレメントに対して複数の濃度のスポットを用意することで、従来見逃していた恐れのある有用な遺伝子を見逃さずにすむ。
【００１４】
すなわち、本発明は、基板上に複数種類のエレメントのスポットを整列して配置したバイオチップにおいて、各エレメント毎にエレメント濃度の異なる複数のスポットを配置したことを特徴とする。同じエレメントを含有する複数のスポットは、必ずしも基板上で空間的に一箇所にまとまって配置されている必要はない。基板上のどの位置に、どの濃度のどのエレメントのスポットが配置されているかが既知であればよい。
【００１５】
本発明による蛍光シグナル処理方法は、複数種類のエレメントを、各エレメント毎にエレメント濃度の異なる複数のスポットを配置した基板を用い、試料中に含有される蛍光標識されたターゲットと基板上に配置されたスポットのエレメントとのハイブリダイゼーション反応を行うステップと、基板上の各スポットから発せられる蛍光シグナルを検出するステップと、検出された蛍光シグナル強度をデジタル化するステップと、同じエレメントを含むエレメント濃度の異なる複数のスポットから検出された蛍光シグナルのうち、デジタル化されたシグナル強度がデジタル化の最大値を示す蛍光シグナル及びシグナル強度が予め設定した閾値レベルより小さな蛍光シグナルを除外してデータ解析を行うステップとを備えることを特徴とする。
【００１６】
本発明による蛍光シグナル処理方法は、また、複数種類のエレメントを、各エレメント毎にエレメント濃度の異なる複数のスポットを配置した基板を用い、２種類の検体に由来するそれぞれ異なる蛍光色素で標識されたターゲットと基板上に配置されたスポットのエレメントとのハイブリダイゼーション反応を行うステップと、基板上の各スポットから発せられる２種類の蛍光シグナルを検出するステップと、検出された蛍光シグナル強度をデジタル化するステップと、同じエレメントを含むエレメント濃度の異なる複数のスポットから検出された蛍光シグナルのうち、デジタル化されたシグナル強度がデジタル化の最大値を示す蛍光シグナル及びシグナル強度が予め設定した閾値レベルより小さな蛍光シグナルを除外するステップと、同じエレメントを含むエレメント濃度の異なる複数のスポットについて、各スポット毎に検出された２種類の蛍光シグナルの比を算出し、比の平均と分散を演算するステップと、比の平均と分散を予め設定した値と比較して、各エレメントごとに実験がうまくいっているか否かを判定するステップとを備えることを特徴とする。
【００１７】
本発明は、また、複数種類のエレメントを、各エレメント毎にエレメント濃度の異なる複数のスポットを配置した基板と、第１の検体と第２の検体に由来するそれぞれ異なる蛍光色素で標識されたターゲットを含有する試料とを用いて行った、複数種類のエレメントと第１検体に由来するターゲット及び第２の検体に由来するターゲットとのハイブリダイゼーション反応の結果を表示する方法において、一方の軸を第１の検体に由来するターゲットを標識した蛍光色素から発せられる蛍光シグナル強度とし、他方の軸を第２の検体に由来するターゲットを標識した蛍光色素から発せられる蛍光シグナル強度とした２次元座標上に前記各スポットに対応する複数のマークを表示するステップと、２次元座標上に表示されたマークの一つを指定するステップと、指定されたマークと同じエレメントに関する全てのマークを強調表示するステップとを含むことを特徴とする。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施する場合の一形態を図面を参照して具体的に説明する。
図７は、バイオチップ作製、蛍光シグナルの検出、シグナルデータの解析を行うバイオチップシステムの構成例を示すブロック図である。
このバイオチップシステムは、スポット情報の入力及び実験データの解析等を行う中央処理装置７００、キャラクタ及びグラフィック画面を表示する表示装置７０１、システムへの値の入力や選択の操作を行うためのキーボード７０２及びマウス７０３、スポットのエレメントやバイオチップ上の位置情報、シグナルの計測値などが格納されているバイオチップ情報データベース７０４を備える。中央処理装置７００は、バイオチップ情報データベースから読み込んでエレメントを所定の位置に配置するようスポッタに指示するエレメント配置部７１０と、読み取った蛍光シグナルを解析するシグナル解析部７１１を有し、コンピュータとそのプログラムによって具体化されるものである。
【００１９】
ウェル７０５に入れられたエレメントは、スポッタ７０６によって取り出されてバイオチップ７０７上の所定の位置にスポッティングされる。バイオチップ７０７上のエレメントは、ハイブリダイゼーション実験装置７０８によってサンプル中のターゲットとハイブリダイゼーションされ、ハイブリダイゼーション後のバイオチップのスポットからの蛍光シグナルは検出器７０９で読み取られる。検出器７０９で読み取られた蛍光シグナルは中央処理装置７００に入力され、シグナル解析部７１１で解析される。
【００２０】
図８は、本システムが管理するエレメントデータの例を示す図で、バイオチップ情報データベース７０４に格納されているものである。エレメントデータは、element[i](i = 1,2,…,eNum)という長さeNum個の構造体の配列に格納する。ただしeNumはこのデータベースに格納されているエレメントの種類の総数である。配列element[]は、エレメントをこのデータベース内で一意に決めるエレメントID８００、配列名８０１、DNA配列８０２、DNA配列の配列長８０３、そしてこの配列がどのような性質をもっているかが書き込まれているアノテーション８０４からなる。この他にも、配列を取り出した生体組織（器官）の名前、生物名、EST、GENBANKのaccession number、プライマー配列などの情報をelement[]の属性として加えてもよい。
【００２１】
図９は、本システムが管理するチップ情報データの例を示す図で、バイオチップ情報データベース７０４に格納されているものである。バイオチップ情報データは、chip[i](i = 1,2,…,cNum)という長さcNum個の構造体の配列に格納する。ただしcNumはこのデータベースに格納されている対象とするバイオチップの総数である。配列chip[]は、バイオチップをこのデータベース内で一意に決めるチップID９００、チップ名９０１、実験日時９０２、このバイオチップの実験で用いた実験機器や温度設定などが記されている実験環境情報９０３、このバイオチップで用いたサンプルの情報９０４からなる。これ以外にもバイオチップに関する様々な情報を、chip[]の属性として加えてもよい。
【００２２】
図１０は、本システムが管理するスポットデータの例を示す図で、バイオチップ情報データベース７０４に格納されているものである。スポットデータは、spot[i](i = 1,2,…,sNum)という長さsNum個の構造体の配列に格納する。ただしsNumはこのデータベースに格納されている対象とするバイオチップに乗っているスポットの総数である。配列spot[]は、どのチップ上に配置されているスポットかを示すチップID１０００、チップ上の座標位置１００１、このスポットがどのようなエレメントかを示すエレメントID１００２、このスポットが原希釈から何％の割合で希釈されたものなのか（原希釈に含まれるエレメントの何％のエレメントをもつスポットなのか）を示す希釈度合１００３、そしてこのスポットから得られる蛍光シグナルの強さを示すシグナル１（１００４）、シグナル２（１００５）、シグナル１とシグナル２の比１００６、同一エレメントを持つスポット間での比の平均１００７と分散１００８からなる。この構造体では２つのサンプル間の実験を想定しているが、単一サンプルでの実験の場合はシグナル１だけ用いればよいし、３つ以上のサンプルで比較することを想定しているならば、その分だけシグナルの強さに関するメンバを増やせばよい。
【００２３】
図１１は、本発明によるバイオチップ作製と、そのバイオチップから得られる蛍光シグナルデータの解析処理の概略を示したフローチャートである。
まず、エレメント配置部７１０がバイオチップ情報データベース７０４からエレメントデータ、チップ情報データ、スポットデータを読み込み、スポッタ７０６に指定されたエレメントを所定の位置にスポッティングすることを指示する。スポッタ７０６はウェル７０５からエレメントを吸出し、バイオチップ７０７に配置する（ステップ１１００）。濃度（希釈度合）の異なるスポットをスポッティングするときは、予め異なる濃度のものをウェル７０５に用意しておいてもよいし、あるいは一旦スポッティングした後にチップを乾燥させてスポット内の水分を蒸発させてから再び同じ位置にスポッティングをすることを繰り返すことで濃度を濃くしていく方法もある。
【００２４】
作ったバイオチップをハイブリ実験装置７０８でサンプルとハイブリダイゼーションさせる（ステップ１１０１）。ハイブリダイゼーション後、チップ上のプローブからの蛍光シグナルを検出器７０９で読み取る（ステップ１１０２）。最後にデータ解析の対象範囲に含まれるデータのみを洗い出し、シグナルの比などを計算し（ステップ１１０３）、結果を表示することで処理を終了する（ステップ１１０４）。
【００２５】
図１２は、図１１においてシグナルデータを解析して、データ解析の対象範囲に含まれるデータのみを洗い出してシグナルの比などを計算するステップ１１０３の処理の詳細フローである。
まず、ステップ１１０２において検出器７０９が読み取ったシグナル（画像データ）から個々のスポットのシグナル強度を算出して、シグナルが強すぎて読み取り限界を超えてしまったスポット、すなわち、蛍光シグナルのデータが読み取り限界で置き換わったシグナルに対応するスポットを無効化する（ステップ１２００）。
【００２６】
次に、無効化されたスポット以外のスポットのシグナルデータに対して、正規化を施す。正規化には二つの考え方があって、一つは非常に近い二つのサンプルをみた場合（同じ細胞の違ったコンディションの経時変化など）、多くのスポットの蛍光シグナルは変化しないものと考え、全体のスポットからの蛍光シグナルの総和をこのバイオチップのシグナルの基準値とみなし、そこからの相対的な値を各スポットのシグナル強度とする方法である。例えば３つのスポットA,B,Cの癌細胞における蛍光シグナルから蛍光シグナルがそれぞれ１００，２００，５００と計測されたとき、正規化後のスポットAの癌細胞における蛍光シグナルは０．１２５（＝１００／（１００＋２００＋５００））、スポットBの癌細胞における蛍光シグナルは０．２５、スポットCの癌細胞における蛍光シグナルは０．６２５となる。同様に、スポットA,B,Cの正常細胞における蛍光シグナルからも正規化した値を求める。
【００２７】
もうひとつの考え方は、発現がかなり違っていると考えられるサンプルを用いる場合、ハウスキーピング遺伝子など全てのサンプルで一定量の発現をしていると考えられるもの（ポジティブコントロール）を使ってこれを正のシグナルの基準とみなし、また動物の実験に対して植物にしか発現しない遺伝子など全てのサンプルでほとんど発現しないと考えられるもの（ネガティブコントロール）を使ってこれをシグナル０の基準とみなし、これらの基準からの相対的な値で各スポットのシグナル強度とする方法である。例えば３つのスポットA,B,Cの癌細胞における蛍光シグナルから蛍光シグナルがそれぞれ１００，２００，５００と計測され、更にポジティブコントロールの遺伝子とネガティブコントロールの遺伝子の癌細胞における蛍光シグナルからそれぞれ１０００，５０と計測されたとき、正規化後のスポットAの癌細胞における蛍光シグナルは０．０５３（≒（１００−５０）／（１０００−５０））、スポットBの癌細胞における蛍光シグナルは０．１５８、スポットCの癌細胞における蛍光シグナルは０．４７４となる。同様に、スポットA,B,Cの正常細胞における蛍光シグナルからも正規化した値を求める。
【００２８】
正規化した値として小数点となり、それが計算上扱いにくいときは、定数倍して整数値にする方法もある。正規化を施した後の癌細胞における蛍光シグナルと正常細胞における蛍光シグナルを、スポットデータのシグナル１（１００４）、シグナル２（１００５）に登録する（ステップ１２０１）。
次に、正規化された全てのスポットのシグナルデータについて、シグナル１とシグナル２の比を求める。すなわち、「シグナル２の値／シグナル１の値」を求め、それをスポットデータの比１００６に登録する（ステップ１２０２）。
【００２９】
また、同じエレメントで濃度の異なるスポット（配列spot[]でチップIDとエレメントIDが同じものどうし）の間における比の平均と分散を算出する。但し、シグナルデータが小さい値を示すスポットは、ノイズによるシグナルかもしれないため、計算の対象から外す。すなわち、シグナル１（１００４）・シグナル２（１００５）のいずれもが共にある閾値（ｋ）を下回るときは、計算の対象から外す。
【００３０】
例えば、スポットA1、B1、C1、D1、E１は、同じエレメントで濃度が異なるスポットとする。そして、これらのスポットの癌細胞における蛍光シグナルと、正常細胞における蛍光シグナルの正規化後の値が、スポットA1では（６３，５１）、スポットB1では（２０１，１１０）、スポットC1では（３５９，１９５）、スポットD1では（４４９，２１９）、スポットE1では（６３１，３０２）であるとする。また、ノイズのシグナルとみなす閾値ｋを１００と定める。
【００３１】
すると、ステップ１２０２で計算される各スポットの比は、スポットA1が０．８１（≒５１／６３）、スポットB1が０．５５、スポットC1が０．５４、スポットD1が０．４９、スポットE1が０．４８となる。ところがスポットA1の２つのシグナルの値（６３と５１）はともに閾値ｋを下回るので、比の平均・分散を求めるときは、スポットA1以外のスポットの比で計算する。すると平均は、０．５１（≒（０．５５＋０．５４＋０．４８＋０．４７）／４）、分散は０．００１（≒｛(０．５５−０．５１)²＋(０．５４−０．５１)²＋(０．４８−０．５１)²＋(０．４７−０．５１)²｝／４）となる。
【００３２】
このようにして求めたエレメントにおける平均・分散を、各スポットデータの比の平均１００７及び比の分散１００８に登録する。分散値が大きいエレメントは、スポットに不純物が入っているとか、ハイブリダイゼーション反応がうまくいかなかったことを示している。ある閾値を定めておき、分散値がそれを超えるようなエレメントであれば、実験がうまくいっていないと判定する（ステップ１２０３）。
【００３３】
図１３は、本システムの結果表示画面の一例を示し、正規化したデータをもとにXY平面１３００にスポットに対応するシグナルをプロット（１３０１）したものである。平面上には、ノイズによる微小な蛍光シグナルを排除するための範囲を決めるための閾値X=ｋ、Y＝ｋと、どちらのサンプルに有意であるかを表す閾値Y=ｍX、Y=（１／ｍ）Xの直線が引かれており、有用な遺伝子の情報が見やすい形になっている。また、マウス７０３でプロットされた点を選択すると、平面上で同じエレメントを持つ濃度の異なるスポットの点を強調表示し、これらの比の平均と比の分散の値が吹き出し１３０６の中に表示される。分散が小さければ小さいほど、そのスポットは実験がうまくいっているということがいえる。別のウィンドウで、バイオチップの情報としてチップ名、実験日時、サンプル情報や、マウスで選択したエレメントの名前、アノテーションなどを参照することもできる。
【００３４】
図１４は、本システムの結果表示画面の他の例を示し、各スポットから得られる蛍光シグナルのデータをテーブルで表示している。テーブルは、エレメント名、原希釈からの希釈度合、サンプル1のシグナル、サンプル２のシグナル、シグナルの比の平均と分散、そのサンプルの特徴の各欄から構成される。各エレメントの比の平均と分散を予め設定した値と比較することで、それがどのサンプルに有意に傾いているか、あるいは実験がうまくいっているかどうかの判定をし、それを特徴欄に自動的に記入することで、容易にエレメントの性質を理解することができる。
以上の処理によって、サンプル中に含まれる複数種類のDNA等の生体高分子の特徴を、従来よりも精密に観測することが可能となる。
【００３５】
【発明の効果】
本発明によると、複数の濃度のスポットを用意することで、従来、蛍光シグナルが弱すぎたり強すぎたりして観測できなかったスポットのデータを観測することができ、従来見逃していた恐れのある有用な働きをもつ遺伝子を見逃すことがなくなる。
【図面の簡単な説明】
【図１】２つのサンプル間で遺伝子の発現状態を比較するためのバイオチップの利用方法の説明図。
【図２】図１の実験で得られる実験結果の表示例の説明図。
【図３】蛍光シグナルの読み取り限界を超えたスポットがある場合の説明図。
【図４】蛍光シグナルが小さすぎてデータ解析に使えない領域を示した説明図。
【図５】本発明によるバイオチップの一例の説明図。
【図６】本方式のバイオチップから得られる実験結果の表示例の説明図。
【図７】本発明によるバイオチップシステムの構成を示したブロック図。
【図８】エレメントデータのデータ構造の例を示した図。
【図９】チップ情報データのデータ構造の例を示した図。
【図１０】スポットデータのデータ構造の例を示した図。
【図１１】本発明によるバイオチップ作製と、そのバイオチップから得られる蛍光シグナルデータの解析処理の概略を示したフローチャート。
【図１２】蛍光シグナルデータ解析の詳細を示すフローチャート。
【図１３】本システムの実験結果表示の一例を示した説明図。
【図１４】本システムの実験結果表示の他の例を示した説明図。
【図１５】エレメントとスポットの関係を示した図。
【図１６】エレメントの濃度の説明図。
【符号の説明】
３０１…読み取り限界を超えたスポット、４０１…スポットからのシグナルが小さくデータ解析の対象とみなさない領域、７００…中央処理装置、７０１…表示装置、７０２…キーボード、７０３…マウス、７０４…バイオチップ情報データベース、７０５…ウェル、７０６…スポッタ、７０７…バイオチップ、７０８…ハイブリ実験装置、７０９…検出器、７１０…エレメント配置部、７１１…シグナル解析部、１５００…バイオチップ、１５０１…スポット、１５０２…エレメント

Claims

複数種類のエレメントを、各エレメント毎にエレメント濃度の異なる複数のスポットを配置した基板を用い、試料中に含有される蛍光標識されたターゲットと前記基板上に配置されたスポットのエレメントとのハイブリダイゼーション反応を行うステップと、
前記基板上の各スポットから発せられる蛍光シグナルを検出するステップと、
検出された蛍光シグナル強度をデジタル化するステップと、
同じエレメントを含むエレメント濃度の異なる複数のスポットから検出された蛍光シグナルのうち、デジタル化されたシグナル強度がデジタル化の最大値を示す蛍光シグナル及びシグナル強度が予め設定した閾値レベルより小さな蛍光シグナルを除外してデータ解析を行うステップとを備えることを特徴とする蛍光シグナル処理方法。
複数種類のエレメントを、各エレメント毎にエレメント濃度の異なる複数のスポットを配置した基板を用い、２種類の検体に由来するそれぞれ異なる蛍光色素で標識されたターゲットと前記基板上に配置されたスポットのエレメントとのハイブリダイゼーション反応を行うステップと、
前記基板上の各スポットから発せられる２種類の蛍光シグナルを検出するステップと、
検出された蛍光シグナル強度をデジタル化するステップと、
同じエレメントを含むエレメント濃度の異なる複数のスポットから検出された蛍光シグナルのうち、デジタル化されたシグナル強度がデジタル化の最大値を示す蛍光シグナル及びシグナル強度が予め設定した閾値レベルより小さな蛍光シグナルを除外するステップと、
同じエレメントを含むエレメント濃度の異なる複数のスポットについて、各スポット毎に検出された前記２種類の蛍光シグナルの比を算出し、比の平均と分散を演算するステップと、
前記分散を予め設定した値と比較するステップとを備えることを特徴とする蛍光シグナル処理方法。
複数種類のエレメントを、各エレメント毎にエレメント濃度の異なる複数のスポットを配置した基板と、第１の検体と第２の検体に由来するそれぞれ異なる蛍光色素で標識されたターゲットを含有する試料とを用いて行った、前記複数種類のエレメントと前記第１検体に由来するターゲット及び前記第２の検体に由来するターゲットとのハイブリダイゼーション反応の結果を表示する方法において、
一方の軸を前記第１の検体に由来するターゲットを標識した蛍光色素から発せられる蛍光シグナル強度とし、他方の軸を前記第２の検体に由来するターゲットを標識した蛍光色素から発せられる蛍光シグナル強度とした２次元座標上に前記各スポットに対応する複数のマークを表示するステップと、
前記２次元座標上に表示されたマークの一つを指定するステップと、
指定されたマークと同じエレメントに関する全てのマークを強調表示するステップとを含むことを特徴とするハイブリダイゼーション反応結果表示方法。