CN106554968A

CN106554968A - 日本血吸虫重组蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN106554968A
Application number: CN201510631291.9A
Authority: CN
Inventors: 傅志强; 贾秉光; 马帅; 宰金丽; 柴淑梅; 吕超; 韩倩; 张祖航; 陆珂; 洪炀; 李�浩; 林矫矫
Original assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Current assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2015-09-29
Filing date: 2015-09-29
Publication date: 2017-04-05

Abstract

本发明公开了一种日本血吸虫重组蛋白，该重组蛋白是由含日本血吸虫C1qBP基因的重组载体经表达而制得。本发明还公开了该日本血吸虫重组蛋白rSjC1qBP的制备方法及其在制备治疗血吸虫病的药物中的应用。本发明的日本血吸虫重组蛋白rSjC1qBP，在小鼠免疫实验中可诱导小鼠体内产生抗重组蛋白的特异性IgG抗体并能达到一个较高水平，表明该重组蛋白具有发展为抗血吸虫病新药物的潜力，具有很好的应用价值。本发明的重组蛋白rSjC1qBP能够抑制补体溶血，溶血抑制率达30％以上，表明本发明重组蛋白rSjC1qBP具有与补体***C1q分子结合的能力，对于治疗补体活性异常疾病的应用前景广阔。

Description

日本血吸虫重组蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种日本血吸虫重组蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

日本血吸虫病是由日本血吸虫引起的一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病。日本血吸虫唯一的中间宿主钉螺分布面积广、孳生环境复杂，难以消灭；再者，人畜重复感染严重。因此，我国的日本血吸虫病防治工作仍然是一项长期、艰巨而复杂的任务。

血吸虫尾蚴钻入终末宿主皮肤转变为童虫，移行经过肺脏、肝脏后发育为成虫，并在宿主体内繁殖产卵、长期寄生。血吸虫寄居的血液环境为其提供了适宜的生理生化环境及营养、激素、信号分子等物质，但也使它直接暴露于宿主的免疫效应因子中，如宿主补体。补体***是机体免疫防御机制的重要组成部分，其作用的发挥依赖补体***的激活。补体***可迅速标记并清除入侵微生物或毒性成分，介导体液免疫和细胞免疫，是机体中重要的免疫调节和效应放大***。血吸虫尾蚴突破皮肤屏障后就受到宿主免疫应答的攻击，补体反应是宿主最早开始杀伤虫体的免疫应答，是宿主获得非特异性抗力的机理之一。但是血吸虫在长期的进化过程中也积累了应对宿主补体***的适应性，相当比例的血吸虫能够逃避宿主的免疫攻击，在已建立免疫应答的宿主血管内存活、发育成熟并繁殖产卵，对补体反应的调节是其免疫逃避策略的重要组成部分。C1q作为补体经典途径的起始分子，是补体***经典途径的重要识别分子，能够启动经典途径，并且在固有免疫和特异性免疫之间发挥主要的连接作用。C1qBP能够与C1q结合，抑制补体激活途径。研究SjC1qBP有助于解释血吸虫免疫逃避现象，揭示虫体与宿主之间相互作用，评估C1qBP分子作为抗血吸虫新药物的潜力，并为筛选抗血吸虫新药物分子提供依据。但是，到目前为止，还没有出现关于日本血吸虫SjC1qBP重组蛋白作为抗血吸虫药物的公开报道。

补体(complement,C)是机体固有免疫(innate immunity)的重要效应***，因为是最初发现于血清中的不耐热蛋白，可辅助或“补充”特异性抗体的杀菌作用而得名。作为体内最复杂的限制性蛋白水解***，补***于机体防御的一线。

补体***是机体免疫防御机制的重要组成部分。补体级联反应的激活包括三条途径，分别为经典途径、替代途径和凝集素途径。经典途径在特异性免疫的效应阶段发挥作用；替代途径和旁路途径参与非特异性免疫，在感染早期抵抗病原微生物感染中发挥重要作用。补体反应是非常迅速、级联放大的免疫防御机制，是宿主杀伤血液内寄生虫的重要途径。研究表明，补体反应是宿主杀伤克氏锥虫的重要效应机制。血吸虫尾蚴突破皮肤屏障后就受到宿主免疫应答的攻击，补体反应是宿主最早开始杀伤虫体的免疫应答，是宿主获得性非特异性抗力的机理之一。但是血吸虫在长期的进化过程中也积累了应对宿主补体***的适应性，对补体反应的调节是其免疫逃避策略的重要组成部分。血吸虫在尾蚴阶段对血清补体非常敏感，但在尾蚴转变为童虫2-4小时后对血清补体杀伤的敏感性就开始逐渐下降，这表明血吸虫在感染初期就对宿主补体反应有调节作用。

发明内容

本发明要解决目前缺乏抗血吸虫新药物的技术问题，提供一种日本血吸虫重组蛋白，该重组蛋白包含日本血吸虫C1qBP(SjC1qBP)的SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，具有良好的免疫原性，适于作为抗血吸虫病新药物。

此外，还需要提供一种上述日本血吸虫重组蛋白的制备方法和应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种重组载体，包含日本血吸虫C1qBP基因，该基因序列是编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

优选的，所述基因序列是SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。

更优选的，所述重组载体的空载体为原核表达载体pET-32a(+)，所述日本血吸虫C1qBP基因***在空载体pET-32a(+)的EcoRⅠ和XhoⅠ两个酶切位点之间。

在本发明的另一方面，还提供了一种日本血吸虫重组蛋白，该重组蛋白是由上述重组载体经表达而制得。

本发明的日本血吸虫重组蛋白，还包含由部分载体序列表达的具有His、Trx等标签序列，该标签序列仅是便于后续的重组蛋白的纯化。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述重组载体的宿主细胞。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

构建含日本血吸虫C1qBP基因的重组表达载体；

将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞；

培养包含所述重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组表达载体表达日本血吸虫C1qBP蛋白。

优选的，还包括步骤：将诱导表达获得的日本血吸虫C1qBP蛋白进一步纯化。

在本发明的一个具体实施例中，构建含日本血吸虫C1qBP基因的重组表达载体，具体包括以下步骤：利用生物信息学进行在线分析，找出编码日本血吸虫C1qBP的核苷酸片段；根据该核酸序列设计PCR引物，并在两端加上特异限制性内切酶酶切位点，PCR扩增核酸片断，再利用特异限制性内切酶EcoRⅠ、XhoI将编码SjC1qBP抗原的核酸片段定向克隆至原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点区，构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-SjC1qBP。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述日本血吸虫重组蛋白的补体抑制剂，该补体抑制剂可应用于生物学实验。

在本发明的另一方面，还提供了一种能与上述日本血吸虫重组蛋白特异性结合的抗体。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫重组蛋白在制备治疗血吸虫病药物中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫重组蛋白在制备治疗补体异常疾病的药物中的应用。

本发明日本血吸虫重组蛋白，在小鼠免疫实验中可诱导小鼠体内产生抗重组蛋白的特异性IgG抗体并且能达到一个较高水平，Western-blot分析表明rSjC1qBP具有较好的免疫原性，表明该重组蛋白具有发展为抗血吸虫病新药物的潜力，具有很好的应用价值。且本发明的重组蛋白rSjC1qBP能够抑制补体溶血，产生的溶血抑制率可达30％以上，表明本发明重组蛋白rSjC1qBP具有与补体***C1q分子结合的能力，对于治疗补体活性异常疾病的应用前景非常广阔。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1的SjC1qBP的PCR扩增结果及重组原核表达质粒pET-32a(+)-SjC1qBP的双酶切鉴定图；

图2是本发明实施例1重组蛋白SjC1qBP表达时相分析图；

图3是本发明实施例1重组蛋白SjC1qBP表达及纯化结果图；

图4是本发明实施例2重组蛋白SjC1qBP抗原性分析结果图；

图5是本发明实施例3抗rSjC1qBP特异性IgG抗体水平的检测结果图；

图6是本发明实施例4溶血试验的结果图；

图7是本发明实施例4补体结合试验结果图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

本发明利用PCR克隆了日本血吸虫SjC1qBP(简称SjC1BP)基因编码序列，并且进行了生物信息学分析，SjC1BP ORF含729个核苷酸，编码242个氨基酸，理论分子量为27.58kD，理论等电点为4.728；利用TMHMM软件预测蛋白质的跨膜区，结果显示SjC1BP不存在跨膜区，SignalP软件预测显示SjC1BP不存在信号肽；该氨基酸的二级结构预测显示，该基因编码的多肽以无规则卷曲为主，SMART软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)观察其结构域，预测其补体***C1q结合位点，推测SjC1BP分子可能具有抑制和调节宿主补体反应的功能，并在血吸虫移行发育过程中发挥重要的免疫逃避功能。

本发明应用PCR技术扩增获得编码日本血吸虫SjC1BP基因的核苷酸片段，并运用基因工程重组技术将该核苷酸片段重组到载体pET-32a(+)中，构建了pET-32a(+)-SjC1BP原核表达质粒。将重组原核表达质粒pET-32a(+)-SjC1BP转化大肠杆菌BL21(DE3)后进行诱导表达并纯化得到重组蛋白。

本发明应用生物信息学方法和基因工程技术获得重组蛋白rSjC1BP后，通过western blot分析此蛋白的抗原性和免疫原性，试验结果表明重组蛋白rSjC1BP具有良好的抗原性和免疫原性，并且在小鼠免疫实验中可诱导小鼠体内产生抗该重组抗原的特异性IgG抗体，且这些抗体能达到一个较高的水平。其生物学功能研究的结果表明，重组蛋白rSjC1BP能够抑制补体溶血，产生的溶血抑制率可达30％以上，具有与补体***中的C1q分子结合的能力。这些实验结果表明，本发明重组蛋白rSjC1qBP能诱导产生高水平的特异性抗体，预示该重组蛋白具有发展为抗血吸虫病新药物的潜力，同时该重组蛋白能通过结合C1q分子抑制补体溶血，应用价值广阔。

实施例1日本血吸虫重组蛋白的表达和纯化

1.方法

1.1重组表达质粒的构建

根据NCBI收录的SjC1qBP(简称SjC1BP)的基因序列(FN315565)，设计引物，上游引物(P1)：5’-CGCGAATTCTTACGGCGTGAAATGTCT-3’(SEQ ID NO.3)带EcoR I酶切位点；下游引物(P2)：5’-GCGCTCGAGCAGTCTTTAAGGATTGTGCA-3’(SEQ ID NO.4)带Xho I酶切位点，用于扩增SjC1qBP基因片段。以日本血吸虫42天虫体的cDNA为模板，PCR扩增其含有ORF的cDNA片段，反应体系组成如下：

PCR反应条件：94℃5min，94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸90sec，共30个循环；最后72℃15min。PCR产物纯化后连接pMD19-T载体，转化DH5α细胞，挑取单克隆，进行PCR菌液鉴定，阳性克隆送上海华津生物技术有限公司测序，将测序结果与NCBI上提交的序列进行比对，用上述测序正确的pMD19-T-SjC1qBP/DH5α转接LB液体培养基，按照试剂盒说明书，小量提取质粒DNA，采用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切体系在37℃恒温仪中双酶切30min。酶切产物利用凝胶回收纯化的方法得到带有粘性末端的DNA目的片段，并将其定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点中，16℃连接过夜。由此，构建得到重组质粒pET-32a(+)-SjC1qBP，将其转化到BL21细胞中，挑取单克隆，进行PCR菌液鉴定，抽提阳性克隆质粒进行双酶切鉴定，并送上海华津公司测序。

1.2重组蛋白pET-32a(+)-SjC1qBP的表达与纯化

将测序正确的pET-32a(+)-SjC1qBP/BL21菌液转接到500ml含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃恒温振荡培养，当OD₆₀₀＝0.6时，加入IPTG，使其终浓度为1mmol/L进行诱导表达。分别于诱导后0、1、2、3、4、5、6小时取出1ml菌液，4℃12000×g离心3min，倒掉上清，用50μl PBS充分悬浮沉淀，随后加入50μl蛋白电泳上样缓冲液并吹打混匀。沸水煮样5min，进行SDS-PAGE电泳。

剩余的诱导了6个小时的菌液，4℃12000×g离心15min，倒掉上清，用18ml PBS充分悬浮沉淀，反复冻融三次后，冰浴超声15min(超声5s，停45s)，随后4℃12000×g离心15min，收集上清。再用10ml 8mol/L尿素溶解沉淀，完全溶解后4℃12000×g离心15min，收集上清。将收集的上清样品，混合蛋白上样缓冲液，沸水煮样5min后，直接进行SDS-PAGE分析。重组蛋白在大肠杆菌中成功表达，用尿素溶解离心后所得上清作为样品，按照说明书利用Ni-NTA His-Bind Resin纯化得到重组蛋白。

2.结果

2.1重组质粒pET-32a(+)-SjC1qBP的构建及鉴定

利用PCR扩增得到大小为729bp的SjC1qBP特异片段(图1，左图A泳道)，与预期目的片段大小相符。利用PCR和限制性内切酶位点EcoRI、XhoI将SjC1qBP目的核苷酸片段亚克隆入载体pET-32a(+)中，PCR、酶切鉴定重组的原核表达质粒均出现了与预期大小一致的DNA片段(图1，右图)。图1左图为PCR扩增产物电泳图，其中，M：DNA分子量标准；A：SjC1qBP PCR产物。图1右图为双酶切鉴定重组质粒pET-32a(+)-SjC1qBP结果图，其中，M：DNA分子量标准；B：重组表达质粒的EcoRⅠ、XhoI双酶切结果。对阳性克隆的菌落小量液体培养后，将菌液样本送上海华津生物公司测序，结果证实核苷酸序列编码阅读框正确。

2.2pET32-a(+)-SjC1qBP在大肠杆菌中的表达与重组蛋白的纯化

重组原核表达质粒pET-32a(+)-SjC1qBP在大肠杆菌BL21中获得成功表达。在1mM IPTG诱导5个小时后，蛋白表达达到最大量(见图2，在图2中，M：蛋白Marker；0～8：重组表达质粒pET-32a(+)-SjC1qBP在大肠杆菌BL21中，在37℃，1mM IPTG条件下，诱导0、1、2、3、4、5、6、7、8小时后蛋白表达情况)。纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE电泳结果显示，得到了较纯的重组蛋白(见图3，在图3中，M：蛋白Marker；1：Binding洗脱液；2-5：Washing洗脱液；6-9：Elution洗脱液)。

实施例2日本血吸虫重组蛋白rSjC1qBP的抗原性检测

1.Western Blotting分析重组蛋白抗原性

将Ni柱纯化后的重组蛋白rSjC1qBP进行SDS-PAGE电泳，随后在4℃条件下，采用130mA，75min转移到NC膜上，用抗重组蛋白的抗血清作为第一抗体分析重组蛋白的抗原性。

2.Western Blot分析重组蛋白抗原性的结果

Western Blot分析结果显示，重组蛋白rSjC1qBP能被重组蛋白免疫血清和阳性血清分别识别，说明重组蛋白rSjC1qBP具有良好的免疫原性(图4)。在图4中，M：Marker；A：一抗为小鼠阳性血清；B：一抗为正常小鼠血清。

实施例3日本血吸虫重组蛋白rSjC1qBP(简称rSjC1BP)的免疫实验

1.方法步骤

1.1动物免疫实验

将6周龄BALB/c小鼠，分为四组，即重组蛋白rSjC1qBP免疫组，206佐剂对照组、pET32-a(+)标签蛋白组和PBS对照组，每组10只小鼠。重组蛋白免疫组小鼠每次免疫时，每只小鼠皮下注射100μL重组蛋白rSjC1qBP(20μg)和206佐剂的乳化液。206佐剂对照组每只小鼠每次皮下注射100μL206佐剂和PBS的乳化液。PBS对照组每只小鼠每次皮下注射100μLPBS。总共免疫三次，每次间隔2周，在每次免疫后7天，对每只小鼠眼眶采血，收集血清，于-20℃保存备用。

1.2特异性抗体水平的检测

各免疫组小鼠分别在免疫前1周，每次免疫后2周采血，按照间接ELISA方法操作，以l0μg/ml rSjC1qBP纯化重组蛋白4℃包被过夜，次日以1.5％牛血清白蛋白(PBST稀释)于37℃封闭1h，小鼠血清作1：100稀释，于37℃温育1h，以HRP-羊抗小鼠IgG(1:2500)做二抗，于37℃温育1h，各步骤间用PBST洗涤3次，每次5min，最后以可溶性TMB溶液进行显色，2mol/L硫酸终止反应，在450nm波长处读取OD₄₅₀值，分别检测由重组蛋白rSjC1qBP诱导产生的特异性抗体IgG的水平。

2.结果

2.1特异性抗体水平的检测

应用ELISA方法检测重组免疫组、206佐剂对照组、pET32-a(+)标签蛋白组和PBS对照组小鼠血清中抗rSjC1BP特异性IgG水平的变化，结果如图5所示。从图5中可见，第一次免疫重组蛋白rSjC1BP后，免疫组的小鼠血清中特异IgG抗体滴度即升到较高水平，并且这种高水平一直持续到感染尾蚴42天后剖杀时。而在206佐剂对照组和PBS空白对照组的小鼠血清中，特异性抗rSjC1BP的IgG抗体滴度在整个过程中一直维持在较低水平，变化不明显。这说明，免疫重组蛋白能够在小鼠体内诱导较高水平的特异性IgG抗体(P<0.01)。

表1 血清中特异性IgG抗体水平

实施例4日本血吸虫重组蛋白rSjC1BP生物学功能试验

1.方法步骤

1.1绵羊红细胞溶血抑制试验

①.溶解于50微升明胶巴比妥缓冲液(SGVB²⁺)中相同浓度(0.01μM～10μM)的rSjC1BP、pET-32a标签蛋白和BSA，用100微升正常豚鼠血清37℃孵育30分钟。

②.加入50微升抗体致敏的绵羊红细胞(EA，2×10⁸个/mL)，均匀混合后在37℃下水浴30分钟并进行离心(6000rpm 1min)。

③.试验结果即各组溶血程度(释放的血红蛋白)通过测定上清液在450nm处的吸光值来确定。

④.以牛血清白蛋白作为对照。并同时设实验体系对照组三组，一组为正常溶血组：第一步50微升明胶巴比妥缓冲液(SGVB²⁺)中不加任何蛋白，其他条件与实验组相同；二组为不溶血组：用明胶巴比妥缓冲液代替正常豚鼠血清，其他条件与实验组相同；三组为100％溶血组：50微升EA和150微升的灭菌水。

1.2日本血吸虫重组蛋白rSjC1BP与补体C1q结合试验

将rSjC1BP(10μg/孔)用0.1M碳酸盐缓冲液在酶标板中4℃包被过夜。用PBST洗板三次后，在PBST稀释的1％明胶在37℃下封闭1h。然后将纯化的C1q补体按不同质量稀释于PBST，浓度分别为5、4、3、2、1、0.5、0.25、0μg/mL，37℃下封闭1h。洗板后加入1:2000PBST稀释的C1q补体抗体，37℃孵育1h。用可溶性TMB底物进行显色，用酶标仪在450nm波长处读取吸光度。(此试验中的对照，以包被与rSjC1BP相同浓度的BSA作为对照)

2.结果

2.1溶血试验

结果表明，牛血清白蛋白不能抑制补体溶血，而重组蛋白rSjC1BP能够抑制补体溶血，产生的溶血抑制率可达30％以上(图6)，在一定范围内其抑制率与重组蛋白rSjC1BP的浓度成正相关。

2.2补体结合试验

利用类似间接ELISA方法检测了重组蛋白rSjC1BP与补体C1q的结合，结果表明重组蛋白rSjC1BP与人类补体C1q的结合(图7)。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种重组载体，其特征在于，包含日本血吸虫C1qBP基因，该基因序列是编码SEQ IDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述基因序列是SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。

3.一种包含权利要求1或2所述重组载体的宿主细胞。

4.一种日本血吸虫重组蛋白，其特征在于，该重组蛋白是由权利要求1所述重组载体经表达而制得。

5.一种日本血吸虫重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建含日本血吸虫C1qBP基因的重组表达载体；

将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞；

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤：将诱导表达获得的日本血吸虫C1qBP蛋白进一步纯化。

7.一种补体抑制剂，其特征在于，包含权利要求4所述的日本血吸虫重组蛋白。

8.一种能与权利要求4所述日本血吸虫重组蛋白特异性结合的抗体。

9.权利要求4所述日本血吸虫重组蛋白在制备治疗血吸虫病药物中的应用。

10.权利要求4所述日本血吸虫重组蛋白在制备治疗补体异常疾病的药物中的应用。