CN106544297A

CN106544297A - 一种耐低温乳酸菌的培养方法及其应用

Info

Publication number: CN106544297A
Application number: CN201610952004.9A
Authority: CN
Inventors: 李长慧; 李淑娟; 许新新; 储徐健
Original assignee: Qinghai University
Current assignee: Qinghai University
Priority date: 2016-10-25
Filing date: 2016-10-25
Publication date: 2017-03-29

Abstract

本发明公开了一种耐低温乳酸菌的培养方法及其应用，L₂在MRS培养液中的培养条件为：接种量3.1％、初始pH 6.4、培养温度18.4℃。本发明从青海本地泡菜及青贮中分离耐低温乳酸菌，并从中筛选出一株生长繁殖能和发酵产酸能力较为优良的耐低温乳酸菌。通过培养优化实验，确定其最适培养温度、初始pH条件和最适接种量，找到该菌最佳扩培条件，为其应用过程中的扩大培养提供理论依据。将其添加到六种不同原料的青贮中，通过感官评定、pH评定、营养成分测定以及发酵产气试验评价该菌青贮调制的实际作用，对解决牧区饲草料短缺，减轻草原放牧压力，保护生态环境具有现实意义。

Description

一种耐低温乳酸菌的培养方法及其应用

技术领域

本发明属于农业技术领域，具体地说，涉及一种耐低温乳酸菌的培养方法及其应用。

背景技术

青贮饲料具有贮藏时间长、消化利用率高、原料来源广、贮存空间小、调制方便且受环境因素影响小等优点，可以很好为牲畜补饲提供优质饲料，保证饲料全年的充足供应。冬季是牲畜饲草料缺口最大的季节，这个时候补饲的青贮饲料大多是在秋冬季节所调制。地处高原的青海省年平均温度较低，秋冬季节收获的青贮原料在青贮调制过程中，原料自身携带的不多的乳酸菌代谢繁殖会受到低温的抑制，难以调制出高品质的青贮饲料。对此，外界添加优良的青贮乳酸菌添加剂，对提高青贮品质显得尤为重要。市售青贮乳酸菌添加剂中乳酸菌最适温度一般在30℃左右，10℃以下几乎不生长。因此在青贮发酵前期青贮窖中积累热不足，环境温度又很低的情况下很难发挥有效作用。若在青贮中添加耐低温乳酸菌，不仅可以增加青贮乳酸菌数量，还可以在青贮饲料内部积累热不足的较低温度下发生代谢产酸的反应，提前实现较低的pH环境，从而更好的抑制腐败菌的活动，提高青贮品质。

目前国内外有关耐低温乳酸菌的研究相对较少，且多集中于泡菜等食品方面，而青贮用耐低温乳酸菌的报道尚属空白。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种耐低温乳酸菌的培养方法及其应用，从青海本地泡菜及青贮中分离耐低温乳酸菌，并从中筛选出一株生长繁殖能和发酵产酸能力较为优良的耐低温乳酸菌。通过培养优化实验，确定其最适培养温度、初始pH条件和最适接种量，找到该菌最佳扩培条件，为其应用过程中的扩大培养提供理论依据。

其具体技术方案为：

一种耐低温乳酸菌的培养方法，L₂在MRS培养液中的培养条件为：接种量3.1%、初始pH 6.4、培养温度18.4℃。

本发明所述耐低温乳酸菌的培养方法在青贮饲料制备过程中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明从青海本地泡菜及青贮中分离耐低温乳酸菌，并从中筛选出一株生长繁殖能和发酵产酸能力较为优良的耐低温乳酸菌。通过培养优化实验，确定其最适培养温度、初始pH条件和最适接种量，找到该菌最佳扩培条件，为其应用过程中的扩大培养提供理论依据。将其添加到六种不同原料的青贮中，通过感官评定、pH评定、营养成分测定以及发酵产气试验评价该菌青贮调制的实际作用，为该菌在青海省青贮饲料添加剂的开发与应用方面提供理论基础，对解决牧区饲草料短缺，减轻草原放牧压力，保护生态环境具有现实意义。

附图说明

图1是各菌株生长曲线，其中，R1为1号球菌；R2为2号球菌；L1为1号杆菌；L2为2号杆菌；L3为3号杆菌；

图2培养液pH变化曲线，其中，R1为1号球菌；R2为2号球菌；L1为1号杆菌；L2为2号杆菌；L3为3号杆菌；

图3是接种量和初始pH对乳酸菌生长影响的响应面图；

图4是接种量和温度对乳酸菌生长影响的响应面图；

图5是初始pH和温度对乳酸菌生长影响的响应面图；

图6是不同处理组粗蛋白含量；

图7是不同处理组粗脂肪含量；

图8是不同处理组粗纤维含量；

图9是不同处理组中性洗涤纤维含量；

图10是不同处理组酸性洗涤纤维含量；

图11是不同处理组总磷含量；

图12是不同处理组总钙含量；

图13是不同处理组粗灰分含量；

图14是全株油菜、鹅观草各处理组累积产气量；

图15是麦鬓草、梭罗草各处理组累积产气量；

图16是全株玉米、全株小麦各处理组累积产气量。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1试验材料

1.1试验材料

泡菜：2012年11月份取自青海大学蔬菜商店泡菜坛；

青贮玉米：全株玉米5℃条件下密封袋青贮60天；

乳酸菌：从上述新鲜泡菜和青贮玉米中分离得到。

1.2培养基

MRS培养基：牛肉膏10g、蛋白胨10g、酵母膏5g、吐温-80 1ml、柠檬酸二胺2g、乙酸钠5g、K₂HPO₄ 2g、MgSO₄·7H₂O 2g、MnSO₄·4H₂O 0.25g、葡萄糖20g、琼脂10g、蒸馏水1L，调pH6.2-6.4，121℃灭菌15min。

PY培养基：蛋白胨0.5g、胰酶解酪阮0.5g、酵母提取物1.0g、0.1%刃天青液0.1ml、半胱氨酸-HCl·H₂O 0.05g、盐溶液4.0ml（盐溶液成分:无水CaCl₂ 0.2g，MgSO₄·7H₂O0.48g，K₂HPO₄ 1.0g,KH₂PO₄ 1.0g，NaHCO₃ 10.0g，NaCl₂ 2.0g）、蒸馏水100ml。厌氧条件下将CaCl₂和MgSO₄·7H₂O混合溶解于300ml蒸馏水中，再加500ml水，一边搅拌一边缓慢加人其他盐类。继续搅拌直到全部溶解，加200ml蒸馏水，混合后贮备于4℃。

PYG培养基：在PY培养基中加入1.0g葡萄糖，配置方法相同。

1.3仪器与设备

2试验方法

2.1乳酸菌分离与初筛

取新鲜泡菜汁液体样品1ml于盛有9ml无菌水的试管中，振荡混匀；全株玉米青贮固体样品称取1g，剪碎置于无菌烧杯中，加50ml无菌生理盐水，摇晃并浸泡数分钟。无菌试管中利用10倍稀释法分别上述两样品溶液稀释至10^-3、10^-4以及10^-5倍，并进行编号。对应编号，吸管移取2滴于的含有0.5%CaCO₃的MRS培养基上涂平板。10℃恒温培养72h后，选取周围出现溶钙圈的菌落，利用划线法在空白MRS平板上分离出单菌落，观察菌落形态。分离出的单菌落菌株进行革兰氏染色和接触酶试验，选择溶钙圈较大、革兰氏染色阳性且接触酶试验阴性的菌株，转移至MRS斜面培养基上，2℃恒温保存备用。

革兰氏染色：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体在载玻片上均匀涂抹。待涂片干燥，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染色1min。用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干，观察细胞形态。滴加1滴碘液，染1min，水洗。吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。滴加蕃红复染3-5min，水洗。染色结束后镜检，菌体呈红色为革兰氏阴性菌，菌体呈蓝紫色为革兰氏阳性菌。

接触酶试验：将试验菌接种于PYG琼脂斜面上，适温培养18-24h。乳酸菌连同培养基在空气中暴露30min后，取一环乳酸菌涂于干净的载玻片上，然后在其上加一滴3%-15%的H₂O₂，若有气泡产生则为阳性反应，无气泡为阴性反应。

2.2乳酸菌复筛

用接种环分别挑取上述菌种约两环于MRS液体培养基中，10℃培养48h得到母液。将母液分别接入空白MRS液体培养基中，保持接入后菌种浓度一致（4.78lgCFU·mL^-1）。10℃恒温培养，每隔12h测定一次菌体浓度及发酵液pH。选出生长速度和产酸能力最好的一株菌种。

2.3乳酸菌的鉴定

光学显微镜下对菌种进行形态学鉴定；参照伯杰氏细菌鉴定手册和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》进行乳酸菌生理生化特性鉴定。

⑴、精氨酸产氨实验含精氨酸的PY培养液：在PY培养液中加入配制好的精氨酸液（L-精氨酸1.5g、浓度为1g/l0ml H₂O的半胱氨酸0.05ml、蒸馏水10ml。调pH至7.0，灭菌后加3滴至3ml培养基中）。

奈氏试剂：20g KI溶于50ml蒸馏水中，溶解后再向其中加入约32g的HgI₂颗粒，另外加入460ml蒸馏水水和134g KOH混合均匀，上清液贮存于棕色瓶中避光保存备用。

乳酸菌接种到含精氨酸的PY培养基中（以不含精氨酸的PY培养基为对照），适合温度培养3d。取稳定期乳酸菌菌液数滴于比色盘内，加入数滴奈氏试剂，若出现橙黄或黄褐色沉淀表示有产氨反应。若含精氨酸培养基中的反应强于无精氨酸培养基为阳性反应，反之为阴性。

⑵、葡萄糖和葡萄糖酸盐产酸产气实验配置培养基：在PY基础培养基（1L）内加人30g葡萄糖、0.5ml的吐温80、6g琼脂和1.6g/100ml的澳甲酚紫指示剂1.4ml。分装试管，高度4-5cm。加人浓度为。置于112℃灭菌20-30min后冷却备用。用穿刺接种的方法接入乳酸菌，置于适温培养。培养基中指示剂变黄表示产酸；软琼脂柱内产生气泡或出现将2%琼脂层向上顶，表示产气。

⑶、淀粉水解实验 PY培养基中加入0.5g可溶性淀粉。分装试管，112℃灭菌30min。冷却后接入待试菌种，适温培养1-2d。取培养液少许置于比色盘内，同时取未接种的培养液作为对照，分别在其中滴加卢哥氏碘液（先用少量蒸馏水溶解2g碘化钾，再加人1g碘片，待碘全溶后，用水稀释至300ml）。如不显色表示淀粉水解，显蓝黑色或蓝紫色时，表示淀粉未水解或水解不完全。卢哥氏碘液：

⑷、石蕊牛奶每100ml脱脂牛奶加人4ml浓度为25g/L的石蕊牛奶。分装试管，牛奶高度4-5cm。113℃高压蒸气灭菌15-20min。接种后适温培养1-3d观察产酸和凝固反应。

⑸、明胶液化实验拟分装的试管中各加人明胶0.6g，再分别加入5ml配制好煮沸后的培养基（蛋白陈1g，酵母提取物1.0g，葡萄糖0.l g，盐溶液4.0ml，蒸馏水100ml。调制pH至7.0）。113-115℃高压蒸气灭菌15-24min。冷却后接种20℃恒温培养，以未接种的试管培养基作对照。相同温度环境下，若对照管凝固而接种管液化则为阳性反应；若接种管与对照管液化或凝固现象均表现一直为阴性。

⑹、硫化氢实验培养基：胰胨l0g，肉浸膏3g，酵母提取物5g，NaCI 5g，半胱氨酸0.4g，葡萄糖2g，蒸馏水1L，调pH至7.2-7.4。分装试管，保证每管培养液层高度约为4-5cm。113℃灭菌20min灭菌后备用。乙酸铅试纸条：根据试管和培养基高度，将普通滤纸剪成约0.5-0.6cm宽的纸条。用浓度为50-100g/L的乙酸铅将纸条浸透，然后置于烘箱烘干，放人培养皿或试管内，灭菌后备用。

接种后，用无菌的镊子夹取一乙酸铅纸条悬挂于接种管内。保证下端不接触培养液表面的前提下尽量接近培养基表面，上端塞上棉塞。另外乳酸菌需在无氧条件下进行。在未接种任何菌种的试管斜面上悬挂乙酸铅纸条，作为空白对照试验。另设一组接种已知阴性反应的菌中作参照。培养基置于合适温度下培养，对纸条进行对比和观察，如果纸条变成黑色则反应为阳性，反之为阴性。

⑺、精氨酸水解实验培养基：蛋白陈5g，肉浸膏5g，葡萄糖0.5g，吡哆醛5mg，L-精氨酸10g，蒸馏水1L，1.6g/100ml甲酚紫乙醇溶液0.625ml，甲酚红液(0.5g甲酚红溶解到26.2ml的0.0l mol/L NaOH中，并且稀释至250ml)2.5ml，调pH至6.0-6.5，每试管分装3ml，121℃灭菌10min。上述培养基接入1-2滴培养过夜的菌液，并在培养基上涂上一层无菌的石蜡矿物油。放置在35℃下，恒温培养72h。如果接种和培养的试管中培养基转变成黄色，表示葡萄糖产酸，反应为阴性。培养基内pH指示剂显示紫色，表示精氨酸被细菌酶水解，产生了碱性物至，反应为阳性。

⑻、葡聚糖实验培养基：胰胨10.0g，K₂HPO₄ 5.0g，酵母提取物5.0g，柠檬酸二铵5.0g，蔗糖50.0g，琼脂15g调pH至7.0，121℃灭菌15min。冷却后接种，合适温度培养2-4天。如果斜面培养物形成了粘稠状菌苔，表明该菌能够产生葡聚糖，结果为阳性反应。反之结果则为阴性。

⑼、脲酶实验待试验菌接种到PYG培养基的斜面上，合适温度培养2-3天。取PYG培养基上待试菌种，放入在空试管中制成2ml的浓菌悬液，加人1滴酚红指示剂，调节pH至7，至酚红指示剂恰好转为黄色。将此调好pH的菌悬液分成两份，在其中一个试管加人少许约0.05-0.1g的结晶的尿素，另一管作为对照不加尿素。如果加有尿素的试管在数分钟内变为红色，则表示试验菌能够分解尿素并生成了氨，使液体呈碱性，酚红指示剂该条件下变红色，表示脲酶是结果为阳性，如果仍为黄色表明为阴性反应。

⑽、糖酵解在PY培养基中分别加人各种糖、醇类和某些昔类碳水化合物，试验发酵产酸情况。

3结果与分析

3.1筛选获得乳酸菌

通过两次筛选，从泡菜和全株青贮玉米中得到有溶钙圈、革兰氏染色呈阳性、接触酶试验呈阴性的菌株共5株。通过光学显微镜观察可知其中球菌2株，杆菌3株。现记球菌为R、杆菌为L，分别对其进行编号，5株菌种表示为R₁、R₂、L₁、L₂、L₃，其中R₁、L₁、L₃来源于泡菜，R₂、L₂来源于全株青贮玉米。

3.2优良菌株筛选结果

上述菌种液体培养得到各菌株生长曲线见图1，其培养液pH变化见图2。由图1得出：L₂菌稳定期菌体浓度最大，为6.30lgCFU·mL^-1。由图2知：培养液pH下降的最快，表明L₂产酸能力最好。所以这5株菌种中选取L₂作为目的菌种。

3.3乳酸菌鉴定

⑴、形态学鉴定

表1 乳酸菌的表观特征

⑵、生理生化及糖发酵试验

表2 乳酸菌属鉴定结果

注：表中“+”表示95％以上为阳性，“-”表示95％以上为阴性，“--”表示弱阴性反应。

菌株L₂的明胶液化试验、吲哚试验、H₂S试验、硝酸盐还原和联苯胺试验均为阴性；而石蕊牛奶试验、淀粉水解试验为阳性。可以判断该菌为乳杆菌属。***糖、棉子糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖等发酵产酸试验中，发现其除鼠李糖外其他糖类都可以利用。对照鉴定手册，鉴定结果L₂为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。其它菌株鉴定结果：R₁、R₂为乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）；L₁为德氏乳杆菌（Lactobacillusdelbrueckii）；L₃为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

2.4结论与讨论

平板划线法是分离纯化细菌较为快速和有效的方法，本章利用该方法从新鲜泡菜和全株玉米青贮中分离得到2株乳酸球菌和3株乳酸杆菌，经过复筛得到其生长繁殖能力最强、产酸能力最好的乳酸杆菌L₂。对该菌进行生理生化鉴定发现其为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），其它菌株鉴定结果分别是：R₁、R₂为乳明串珠菌（Leuconostoclactis）；L₁为德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）；L₃为植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）。

植物乳杆菌是青贮及泡菜中较为常见的乳酸菌菌种，云月英等利用平板分离法从农家自腌酸菜中分离出6株耐酸乳酸菌，其中三株为植物乳杆菌。何轶群等采用平板分离法从青贮饲料中分离出12株乳酸菌，通过细菌形态学、生理生化特征鉴定和16S rRNA基因序列分析相结合的方法对分离出的细菌进行鉴定，其中4株为植物乳杆菌。

3.1试验材料

3.1.1菌种

乳酸菌：全株玉米青贮中分离、筛选得到的耐低温乳酸菌L₂。

3.1.2培养基

3.1.3仪器设备

3.2试验方法

3.2.1不同培养条件对乳酸菌生长的影响

⑴、分别以1%、2%、3%、4%、5%(V/V)的接种量将乳酸菌接种于MRS液体培养基中（初始pH6.2），10℃恒温培养，每隔12h进行一次活菌计数。观察接种量对耐低温乳酸菌生长的影响。

⑵、调节MRS液体培养基初始pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，按接种量3%(V/V)进行接种，10℃恒温培养，每隔12h进行一次活菌计数。观察初始pH对耐低温乳酸菌生长的影响。

⑶、按接种量3%(V/V)进行接种，初始pH6.2，分别在10℃、13℃、16℃、19℃、22℃条件下恒温培养，每隔12h进行一次活菌计数。观察培养温度对耐低温乳酸菌生长的影响。

3.2.2耐低温乳酸菌培养条件优化

利用Design Expert 7.0软件按照Box-Benhnken实验设计原理设计试验组，设置接种量、起始pH和培养温度三个因素为自变量，活菌数（CFU）作为响应值，通过响应面分析(ResponseSurface Analysis，RSA)确定最优培养条件。接种量、起始pH及培养温度三自变量因素的Box-Benhnken响应面设计因素水平表见表4。

表4 响应面设计因素水平表

3.2.3数据处理

活菌计数采用血球计数板计数，移液枪吸取培养液1ml于无菌试管中，十倍稀释法稀释至合适倍数后，取数滴于血球计数板上，置于显微镜下观察计数。利用SAS 9.1.3软件对数据进行t检验分析，Design Expert 7.0软件进行响应面分析。

3.3结果与分析

3.3.1不同培养条件对耐低温乳酸菌生长的影响

⑴、接种量对耐低温乳酸菌生长的影响

一般接种量太小会延长菌种的适应期，而接种量太大则会缩短其稳定期。表5显示：不同接种量，培养0h至36h菌体浓度显著增大（p＜0.05），36h至60h趋于稳定（p＞0.05），之后显著下降（p＜0.05）。比较不同接种量最大活菌数知：接种量为1%、2%、3%、4%、5%时，对应稳定期发酵液活菌数分别为6.083a、6.190b、6.316c、6.248bc、6.215b lgCFU·mL^-1。接种量从1%增加到3%时，菌体浓度有显著提高（p＜0.05）；接种量继续增大时菌体浓度降低，但不显著（p＞0.05），接种量为3%时，菌体浓度达到最大值。

表5 接种量对乳酸菌活菌数的影响

注：表中同列数字肩标有相同小写英文字母表示差异不显著(p>0.05)，不同小写英文字母表示差异显著(p<0.05)。

⑵、初始pH对耐低温乳酸菌生长的影响

每一种乳酸菌都有自己的pH耐受范围，高于或低于此范围都会对其生长繁殖产生一定的影响。表6显示：不同初始pH条件下，培养0h至36h菌体浓度显著增大（p＜0.05），48h左右菌体浓度达到最大。比较不同初始pH条件下最大活菌数知：初始pH为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0时，稳定期发酵液活菌数分别为6.127a、6.203ab、6.233bc、6.286c、6.155ablgCFU·mL^-1。初始pH从5.0升高至6.0时，菌体浓度显著升高（p＜0.05），pH由6.5升至7.0时菌体浓度显著下降（p＜0.05），初始pH为6.5时菌体浓度最大，最适宜菌体生长。

表6 初始pH对乳酸菌活菌数的影响

⑶、培养温度对耐低温乳酸菌生长的影响

温度与乳酸菌酶的活性直接相关，高于或低于酶的最适温度时将不同程度的影响菌体的生长代谢。表7显示：不同培养温度条件下，培养0h至48h菌体浓度显著增大（p＜0.05），培养60h至72h菌体浓度显著下降（p＜0.05）。比较不同培养温度条件下稳定期活菌浓度知：培养温度为10、13、16、19、22℃时，对应稳定期活菌数分别为6.274a、6.346b、6.403bc、6.468d、6.415cd lgCFU·mL^-1。10℃时菌体浓度最小，随着温度的增高，菌体浓度逐渐升高。19℃时菌体浓度达到最大值，温度进一步增高时，菌体浓度显著下降（p＜0.05）。分析可知，最佳培养温度在19℃左右。

表7 温度对乳酸菌活菌数的影响

注：表中同列数字肩标有相同小写英文字母表示差异不显著(p>0.05)，不同小写英文字

母表示差异显著(p<0.05)。

3.3.2耐低温乳酸菌培养条件的优化

Box-Benhnken实验设计的17个试验组以及活菌数作为响应值的试验结果如表8所示。

表8 Box-Benhnken试验结果

Design Expert 7.0软件对试验结果进行回归分析得到方程：

Y=-5.9778+19.2660A+52.8653B+6.7060C+0.600AB-1.8750AC+5.9167BC-57.8700A²-89.0800B²-5.6372C²

（方程中Y代表响应值、A代表接种量、B代表初始pH、C代表培养温度）

对该回归方程进行方差分析，结果见表9。由表9得知，该模型水平极显著（p＜0.001），方程失拟项不显著（p=0.0860），表明该方程的误差较小。方程相关系数R²=0.9897，表明该方程模型与试验数据符合度较高，能够很好的代表真实试验结果。

以活菌数对数值作为响应值，绘制接种量与起始pH、接种量与培养温度、起始pH与培养温度之间的三维响应曲面图，分别见图3、图4和图5。

表9 Box-Benhnken试验方差分析

注：R²=0.9897；R_Adj ²=0.9764。

图3至图5分别显示了以培养温度、初始pH以及接种量为中心水平时，其它两因素对活菌数的影响。从中可以看出：接种量、起始pH以及温度三者之间交互作用不明显。由响应面的高点及等值线可以看出，在所选的范围内拟合曲面有极大值，对回归方程求导，得到极大值为6.505lgCFU·mL^-1，对应的接种量为3.12%、起始pH为6.44、温度为18.44℃。

影响乳酸菌生长繁殖的因素很多，本文从扩大培养角度考虑，选取了接种量、起始pH以及培养温度三个因素进行优化试验。接种量的大小会影响乳酸菌各生长时期的长短，过小的接种量会使菌种经历较长的适应期，因而减缓了前期发酵速度；而过大的接种量则会使菌种提早进入衰亡期，影响发酵品质。环境的pH值会引起细胞膜电荷变化，从而改变其通透性，进而影响乳酸菌吸收营养物质的能力，甚至胞内酶的活性从而影响乳酸菌的代谢。温度通过影响蛋白质、核酸等生物大分子的结构和功能、细胞结构如细胞膜的流动性和完整性以及胞内酶的活性来影响微生物的生长、繁殖。同时还会影响乳酸菌的代谢，改变其代谢产物的产量和质量，比如产品的酸度、风味和组织状态。

3.4结论与讨论

⑴、实验表明：接种量、起始pH以及培养温度三个因素对L₂乳酸菌稳定期活菌数有显著影响。

⑵、响应面分析结果表明：接种量、起始pH以及培养温度三因素两两之间的交互作用均不显著，其中起始pH与培养温度之间交互作用最大，但仍不显著（p＞0.05）；

⑶、响应面分析得到L₂乳酸菌最佳培养条件：接种量为3.1%、起始pH为6.4、温度为18.4℃。此时L₂乳酸菌活菌数理论最大值为6.505lgCFU·mL^-1。

L₂最佳接种量为3.1%，与田菊梅等研究相近；最适pH为6.4，较乳杆菌属最适pH偏高，但仍在乳酸菌正常生长pH（3.5-7.0）范围内；最适温度为18℃，相比乳杆菌属最适温度明显偏低，但相对王翠等研究中的低温乳酸菌复合菌系最适温度要高。有文献对筛选得到的低温乳酸菌复合菌系(LAC-1)进行培养优化试验，响应面分析LAC-1最佳的培养条件为培养温度9.5℃、接种量3.3%和培养时间139h。唐血梅等从新疆伊犁牧民自制酸马奶中筛选出一株高产胞外多糖的乳酸菌，并对该菌产胞外多糖的培养条件进行优化，确定该菌产胞外多糖的最佳合成条件为葡萄糖2%，蛋白胨1.5%，发酵时间28h，初始pH值6.5，且此条件下所合成胞外多糖量为121.6mg·L^-1。各文献中乳酸菌最适接种量各不相同，与乳酸菌种类、培养基等因素有关；不同文献中乳酸菌最适起始pH条件基本相同；最适培养差别较大，普通植物乳杆菌最适培养温度一般在30℃左右，本文L₂植物乳杆菌最适温度低于20℃，与青海特殊气候环境有关。

4.1试验材料

4.1.1青贮原料

返青期鹅观草（Roegneria kamoji）、返青期麦鬓草（Elymus tangutorum）、返青期梭罗草（Roegneria thoroldiana(Oliv.)Keng）、完熟期全株玉米（Zea mays）：青海大学草科系试验田；

蜡熟期小麦（Triticum aestivumLinn.）：青海大学作物所试验田；

花期油菜（Brassica campestris）：青海大学油菜所试验田。

4.1.2仪器设备

4.2试验方法

4.2.1乳酸菌的扩大培养

锥形瓶中配置MRS液体培养基，调pH至6.4，高压灭菌锅121℃灭菌15min后取出冷却至室温，备用。无菌操作台中接入约两环耐低温乳酸菌L₂摇晃均匀后放入冰箱中18.5℃恒温培养48h获得菌种母液。

4.2.2青贮的制作

六种原料刚收割的鲜样进行含水量测定后，各分出一部分直接制成绝干样并粉碎过40目筛作为A组样品，另一部分切割为1cm～2cm短茎，按每袋200g装入真空压缩袋中，每种原料分为两组，每组三个重复。B组不添加乳酸菌，C组按3%质量比添加乳酸菌培养液。用移液枪吸取培养液均匀喷洒到原料上，原料混合均匀，分层装填，用真空压缩机抽出袋内空气直至真空状态后封口，抽真空的同时挤压青贮袋以保证青贮料的厌氧环境。所有青贮袋放置在试验室冰箱中10℃恒温发酵30天（青贮时各原料含水量分别为全株油菜84.35%、鹅观草74.66%、麦鬓草65.37%、梭罗草77.22%、全株玉米81.40%和全株小麦78.72%）。

4.2.3青贮品质感观鉴定方法

青贮样品感官评分标准：青贮的第30天开包采样，现场进行感官鉴定（嗅觉、结构、色泽），采用《德国DLG青贮饲料感观评分标准》进行评定。

表10 青贮饲料感观评分标准

4.2.4青贮品质化学分析方法

青贮样品pH值测定及评分标准：青贮30天后打开密封袋，每袋从中部取出约10g样品放入干净的烧杯中，加入90ml蒸馏水浸泡约24h，用酸度计测量浸提液pH。pH值评定及评分标准见表11。

表11 pH值评定及评分标准

4.2.5各青贮样品营养物质含量测定

每袋青贮分别取样，取中间40g，65℃烘干粉碎至40目作为分析样品保存备用。对A、B、C三组样品进行分析时，每个样品另设置一个平行样。

⑴、粗蛋白（CP）测定：利用定氮仪分析法测定粗蛋白含量。称量粉碎样品约1g（精确到0.0001），置于定氮仪配套消煮管中，加入0.4g无水硫酸铜、6g无水硫酸钠以及10ml浓硫酸进行高温消煮，直到消煮管中溶液呈透明的蓝绿色。消煮完成后冷却至60℃左右，放入全自动FOSS定氮仪中蒸馏、滴定获得样品中粗蛋白含量。

⑵、粗脂肪（EE）测定：参照GB/T 6433-2006利用油重法测量粗脂肪含量。利用***浸泡和反复抽提样品中油脂，直到样品中油脂全部进入坩埚中，称量烘干坩埚抽提前后质量差即为样品中所含油脂质量。

⑶、粗纤维（CF）、中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）的测定：利用Ankom纤维素分析装置测，滤袋技术分析样品中CF、NDF和ADF含量。称量样品约1g（精确到0.0001）置于专用滤袋中，放入纤维素分析仪中利用不同洗涤剂洗涤。洗涤完成烘干后称量滤袋及样品对比空白滤袋减轻的重量即为样品中各纤维质量。

⑷、总磷（P）测定：参照GB/T6437-2002，利用钼黄比色法测定样品中总磷含量。

⑸、总钙（Ca）测定：参照GB/T 6436-2002，利用高锰酸钾滴定法测定样品中总钙含量。

⑹、粗灰分（Ash）测定：参照GB/T 6438-2007，利用高温灼烧的方法测定样品中粗灰分含量。

4.2.6青贮品质体外消化率分析方法

⑴、瘤胃液采集：选择2头体重、年龄及健康状况相近的健康牦牛作为瘤胃液采集对象，牦牛装有永久性瘤胃瘘管，舍饲圈养。提供充足死草料保证充足营养，饮水卫生、充足。选择早晨喂料前采集瘤胃液，进入实验室前用保温桶保证瘤胃液温度。

⑵、体外产气法模拟并测定牦牛消化率：六种原料A、B、C三个处理、每个青贮袋分别取样，且每个样品做3个重复。分别称取0.2g样品放入对应编号的专用培养管中待用。牦牛瘤胃液中加入缓冲液和多种盐类，调节pH后制成瘤胃混合营养液。混合液通过自动加液器加入已排出气体的培养管中（注意不要将培养管中样品排出），每个培养管中加入30ml混合液，用铁夹夹紧末端橡胶管，不能有漏液情况。记录此时培养管液面刻度值，另外设置3个对照组，对照组不加任何样品，其它与实验组相同。加入样品和混合液的培养管放入人工瘤胃培养箱中39℃恒温培养72h，中间2、4、6、10、16、24、48、60、72h时分别读取产气量，并排出管内气体。

⑶、产气量测定：某一时间段培养管净产气量（0.200g DM）计算公式：净产气量(ml)=某时间段产气量(ml)-对应时间段3支空白管平均产气量(ml)。累积产气量为某时间段及之前产气量总和。

4.3、结果与讨论

4.3.1六种青贮感官评定结果

表12 青贮饲料感观评定结果

注：B为自然青贮；C为添加耐低温乳酸菌青贮。

理论上添加乳酸菌有利于提高青贮品质，由表中可以看出全株油菜青贮感官评定结果为中等级别，其它5种材料均达到了良好级别。B组中得分最高和最低分别为：全株小麦青贮14分和全株油菜青贮7分。C组中得分最高和最低分别为全株玉米青贮16分和全株油菜青贮9分。各青贮B、C处理之间比较可知，添加L₂乳酸菌后青贮品质均有所提高。其中全株玉米青贮添加了L₂乳酸菌后感官品质提高了5分，表现最为明显。麦鬓草、全株小麦提高的最少，均只有1分。方社会等对燕麦、冬小麦、糜子、冬大麦、箭舌豌豆和荞麦6种饲草青贮60天，感官评定结果表明：前三者均达到20分，冬大麦获得19分达到1级优等水平；箭舌豌豆获得15分，荞麦最低获得13分，达到2级尚好水平。本试验中得分偏低，尤其是全株油菜只达到中等水平，可能是由于青贮原料含水量太高所致。

4.3.2六种青贮pH评定结果

表13 青贮饲料pH评分结果

注：B为自然青贮；C为添加耐低温乳酸菌青贮。

由上表可知全株油菜青贮B、C处理以及麦鬓草B处理得分不理想，其他青贮得分也没有达到优、良等级。分析比较不同青贮B、C之间得分差别可知：全株油菜两处理之间得分没有变化，均为0分，但C处理pH较B处理降低了1；鹅观草C处理较B处理得分下降了1分，但是实际测得pH仅仅相差0.1；其他青贮C处理均较B处理得分高，其中梭罗草的C处理得分最高，其与B处理之间的差别也最大，相差了3分。总体来看，添加了L₂乳酸菌对降低青贮pH有积极作用。王琳等对紫花苜蓿、普通玉米等9种材料进行单独青贮和混合青贮，结果各青贮pH均降低到5.10以下，其中牛鞭草+米糠的组合青贮pH最低为3.82。本文中全株油菜两种处理及麦鬓草自然青贮pH均在5以上，其他青贮pH均没有降到4以下。可能与材料种类、青贮含水量以及pH测定方法不同有一定关系。

4.3.3六种青贮营养成分测定结果

六种青贮粗蛋白（CP）、粗脂肪（EE）、粗纤维（CF）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）、总磷（P）、总钙（Ca）以及灰分（Ash）含量测定结果见6至13，小写英文字母标出了相同原料、不同处理之间的显著性关系。

由图6可以看出：未经青贮全株油菜中粗蛋白含量最高（26.73%），全株小麦中粗蛋白含量最低（10.83%）。青贮处理后除鹅观草外，粗蛋白显著下降（p﹤0.05）。添加L₂乳酸菌青贮，麦鬓草和全株小麦粗蛋白下降变得不显著（p﹥0.05），但鹅观草粗蛋白下降变得显著（p﹤0.05），不过与自然青贮相比差异不显著（p﹥0.05）。与自然青贮相比，除鹅观草外添加L₂乳酸菌更有利于避免粗蛋白损失，其中麦鬓草、全株玉米和全株小麦青贮中添加L₂乳酸菌粗蛋白含量显著提高（p﹤0.05）。由图7可以看出：自然青贮后全株油菜、鹅观草、麦鬓草、梭罗草粗脂肪含量均下降显著（p﹤0.05）；全株玉米与全株小麦粗脂肪显著升高（p﹤0.05）。添加L₂乳酸菌青贮，与未青贮比较全株油菜、全株玉米、全株小麦粗脂肪显著升高；梭罗草粗脂肪变化不显著；其他均显著下降。B、C两组比较发现添加L₂乳酸菌后，粗脂肪含量较自然青贮高，除全株小麦与麦鬓草差异不显著（p﹥0.05）外其它均差异显著（p﹤0.05）。

从图8中可以看出梭罗草的粗纤维含量最高（40.80%）、全株玉米粗纤维含量最低（28.50%）。青贮后除全株油菜外粗纤维含量有显著增高趋势（p﹤0.05）；且添加L₂乳酸菌后增加更为明显，但与不添加L₂相比变化不显著（p﹥0.05）。全株油菜自然青贮粗纤维变化不显著（p﹥0.05），添加L₂乳酸菌的青贮粗纤维含量明显下降（p﹤0.05）。

从图9可以看出未经青贮的梭罗草中性洗涤纤维含量最高（62.47%），全株小麦中含量最低（42.47%）。自然青贮后全株油菜、麦鬓草以及梭罗草中中性洗涤纤维下降显著（p﹤0.05），其它无显著变化。添加L₂乳酸菌后，全株玉米和全株小麦中中性洗涤纤维下降显著（p﹤0.05），但与自然青贮相比变化不显著。总体上自然青贮后中性洗涤纤维下降最多的为全株油菜（8.58%）；添加L₂乳酸菌后青贮后下降最多的也是全株油菜（10.13%）；添加L₂乳酸菌较自然青贮下降最多的为鹅观草（2.27%）。

从图10可以看出未经青贮的梭罗草酸性洗涤纤维含量最高（38.33%），全株玉米中含量最低（33.36%）。鹅观草自然青贮及添加L₂乳酸菌青贮中酸性洗涤纤维显著升高（p﹤0.05），全株油菜、全株玉米添加L₂乳酸菌青贮酸性洗涤纤维显著下降（p﹤0.05），其它无显著变化。

从图11中可以看出未青贮全株油菜中总磷含量最高为（0.41%），全株小麦中最低为（0.27%）。自然青贮后，全株油菜总磷显著升高（p﹤0.05）；鹅观草总磷显著下降（p﹤0.05）；其它变化不显著。添加L₂乳酸菌青贮后所有原料总磷含量较自然青贮提高，其中全株玉米中变化显著（p﹤0.05）。

从图12中可以看出未经青贮全株油菜中Ca含量最高（1.17%），鹅观草中含量最低（0.35%）。自然青贮及添加L₂乳酸菌青贮后全株油菜、鹅观草以及全株小麦中Ca含量显著上升（p﹤0.05），其它变化不显著。添加L₂乳酸菌与自然青贮之间差异均不显著（p﹥0.05）。

从图13中可以看出未经青贮处理全株油菜灰分含量最高（10.23%），梭罗草灰分含量最低（7.76%）。自然青贮及添加L₂乳酸菌青贮后灰分均呈下降趋势。其中鹅观草、全株玉米及全株小麦自然青贮粗灰分含量显著下降（p﹤0.05）；除全株小麦外，添加L₂乳酸菌青贮粗灰分含量均显著下降（p﹤0.05）。

4.3.4各原料不同处理组体外产气量

从图14到图16三个图可知：2至6小时产气缓慢，6至24小时产气速率最快，24小时后产气量又趋于缓慢。同一种原料添加L₂乳酸菌青贮料的产气量高于自然青贮的产气量、而后者又高于未经青贮处理的鲜样。其中全株油菜与梭罗草自然青贮后产气量显著升高（p﹤0.05），添加L₂乳酸菌青贮后产气量均显著升高（p﹤0.05）。说明添加L₂乳酸菌对六种青贮牦牛消化率有明显的提高作用。

4.4结论与讨论

⑴、添加了L₂乳酸菌青贮，感官评定得分普遍高于自然青贮，且青贮pH普遍低于自然青贮；

⑵、除鹅观草外，添加L₂乳酸菌青贮较自然青贮提高了粗蛋白含量，其中只有梭罗草中表现不显著；各青贮原料粗脂肪含量变化无明显规律性；除全株油菜外，两种青贮处理粗纤维含量均有上升趋势；NDF及ADF含量总体呈下降趋势，但两种青贮处理之间总体差异不显著；总磷含量变化趋势不明显，但添加L₂乳酸菌青贮总磷含量总体高于自然青贮；两种青贮处理钙含量均呈上升趋势，但两者之间差异不显著；两种青贮处理粗灰分均呈下降趋势，除鹅观草和全株小麦外，添加L₂乳酸菌青贮下变化更显著。

⑶、两种青贮处理饲草料消化率都呈上升趋势，添加L₂乳酸菌青贮效果更为明显。

青贮饲料调制过程中添加乳酸菌有利于加快pH下降，抑制粗蛋白降解为非蛋白氮，减少蛋白质的损失，同时还能提高青贮饲料的消化率。兴丽等在不同的青贮饲料中添加乳酸菌及纤维素酶制剂的研究均表明：添加乳酸菌制剂有利于提高青贮中乳酸菌的数量，并且能够有效降低ADF和CF的含量（两者质量分数分别下降了1.85%和2.09%），明显提高了青贮饲料的发酵品质。研究表明添加乳酸菌后不同早籼稻青贮CP含量有所提高，NDF、ADF及粗灰分含量均呈下降趋势。本文中添加L₂乳酸菌有利于降低青贮中粗蛋白损失，有效降低NDF含量和粗灰分含量，与上述研究结果一致。但ADF含量变化大多不显著，可能与青贮原料不同有关。青贮后饲草料消化率会有不同程度的提高，有研究表明添加乳酸菌苜蓿青贮较苜蓿鲜、干草产气量有较大提高，48h累积产气在45ml左右，与本文研究结果相近。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种耐低温乳酸菌的培养方法，其特征在于，L₂在MRS培养液中的培养条件为：接种量3.1％、初始pH 6.4、培养温度18.4℃。

2.权利要求1所述耐低温乳酸菌的培养方法在青贮饲料制备过程中的应用。