CN106544286B

CN106544286B - 一种减少多糖积累强化光滑球拟酵母生产丙酮酸的方法

Info

Publication number: CN106544286B
Application number: CN201611112791.2A
Authority: CN
Inventors: 周景文; 陈坚; 罗正山; 堵国成; 刘松; 方芳
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2016-12-07
Filing date: 2016-12-07
Publication date: 2019-05-10
Anticipated expiration: 2036-12-07
Also published as: CN106544286A

Abstract

本发明公开了一种减少多糖积累强化光滑球拟酵母生产丙酮酸的方法，属于发酵工程技术领域。本发明通过在光滑球拟酵母菌株中敲除掉多糖合成相关基因CAGL0H02695g和CAGL0K10626g，获得了一株高产丙酮酸的工程菌株TGΔarg8Δura3(CAGL0H02695g::ARG8；CAGL0K10626g::URA3)，相对于对照菌T.glabrata，其丙酮酸的产量、丙酮酸生产强度和底物转化率分别提高了12.8％、13.6％和34.8％，而细胞干重、葡萄糖消耗速率和副产物多糖分别降低了12.5％、17.9％和16.6％。

Description

一种减少多糖积累强化光滑球拟酵母生产丙酮酸的方法

技术领域

本发明涉及一种减少多糖积累强化光滑球拟酵母生产丙酮酸的方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术

丙酮酸(pyruvate)是生物代谢的中间产物，处于各代谢途径的中间环节，如：是糖酵解的终产物；通过脱氢脱羧反应转化为TCA循环的起始物质乙酰-CoA；在丙酮酸羧化酶作用下生成TCA循环的中间产物草酰乙酸；通过转氨基作用生成丙氨酸等，同时也是非常重要的酮酸之一。由于丙酮酸是多种物质的合成前体，如多巴胺，丙酮酸乙酯等，目前社会对丙酮酸的需求量日益增加，其广泛的应用于日化，食品，医疗，农业等行业。

丙酮酸的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法两大类。化学合成法主要有酒石酸法、乳酸乙酯空气氧化法、羟基丙酮法、电化学合成法、乳酸催化氧化法。化工合成存在污染大、能耗大、反应条件苛刻的诸多缺点。目前丙酮酸的生产正在由化工合成向微生物发酵转化。微生物发酵法相对于化工合成有更多的优点，如原料的转化率高、污染小、成本低等优点。

目前，微生物发酵法生产丙酮酸作为一种替代性的绿色环保方法成为了国内外研究的热门。而要通过微生物发酵获得高产丙酮酸，其中最关键是要有一株高产并且高生产强度的丙酮酸菌株。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种通过敲除多糖合成途径的基因以增强丙酮酸产量和生产强度的方法。

本发明的第一个目的是提供一种丙酮酸产量和生产强度提高的重组菌，所述重组菌缺失CAGL0H02695g和CAGL0K10626g基因，多糖合成途径被弱化的重组光滑球拟酵母。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌，是以缺失了URA3和ARG8基因的T.glabrata CCTCC M202019为宿主，采用同源重组的方式敲除了SEQ ID NO.1所示的基因CAGL0H02695g和SEQ ID NO.2所示的基因CAGL0K10626g。

本发明的第二个目的是提供所述重组菌的构建方法，其步骤为：(1)扩增目的基因CAGL0H02695g在基因组所在位置上下游各600bp的序列CAGL0HL和CAGL0HR，将CAGL0HL和CAGL0HR及序列如SEQ ID NO.3所示的ARG8基因融合，构建CAGL0H02695g基因敲除组件CAGL0HL-ARG8-CAGL0HR；(2)扩增目的基因CAGL0K10626g在基因组的上下游各600bp的序列CAGL0KL和CAGL0KR，将CAGL0KL和CAGL0KR及序列如SEQ ID NO.4所示的URA3基因融合，构建CAGL0K02695g基因敲除组件CAGL0KL-URA3-CAGL0KR；(3)将CAGL0HL-ARG8-CAGL0HR和CAGL0KL-URA3-CAGL0KR分别与T载连接，将连接后的片段进行测序，将测序正确的基因敲除框分别转化至尿嘧啶缺陷性和精氨酸缺陷性的受体菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：(1)扩增目的基因CAGL0H02695g在基因组中所在位置上下游各600bp的序列CAGL0HL和CAGL0HR，扩增ARG8基因，通过融合PCR将其三个片段连接并获得CAGL0HL-ARG8-CAGL0HR，将其连接到T载上进行测序和保藏；将测序正确的上述敲除框CAGL0HL-ARG8-CAGL0HR转化至尿嘧啶缺陷性和精氨酸缺陷性的受体菌中，在不含尿嘧啶但含有精氨酸的培养基中进行筛选，得到多糖合成基因CAGL0H02695g缺陷的菌株TGΔarg8Δura3(CAGL0H02695g::ARG8)；(2)从目的基因CAGL0K10626g在基因组的上下游分别扩增600bp的序列CAGL0KL和CAGL0KR，并扩增URA3基因，通过融合PCR连接三个片段构建CAGL0K10626g敲除框CAGL0KL-URA3-CAGL0KR，将其连接到T载上进行测序和保藏，(3)将测序正确的CAGL0K10626g敲除框CAGL0KL-URA3-CAGL0KR转化到TGΔarg8Δura3(CAGL0H02695g::ARG8)中，在不含有尿嘧啶和精氨酸的平板上进行筛选，得到多糖合成基因CAGL0H02695g和CAGL0K10626g双缺陷性的菌株TGΔarg8Δura3(CAGL0H02695g::ARG8；CAGL0K10626g::URA3)。

本发明的第三个目的是提供一种提高丙酮酸产量和生产强度的方法，所述方法是在产丙酮酸的菌株中敲除多糖合成相关的基因；所述多糖合成相关的基因包括SEQ IDNO.1所示基因CAGL0H02695g和SEQ ID NO.2所示的基因CAGL0K10626g。

在本发明的一种实施方式中，所述产丙酮酸的菌株是缺失了URA3基因和ARG8基因的光滑球拟酵母T.glabrata CCTCC M202019。

本发明的第四个目的是提供一种利用所述重组菌发酵生产丙酮酸的方法，是将重组菌活化后接种至发酵培养基，在30℃，200～220rpm条件下进行发酵培养。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基每L含有：葡萄糖50-120g，尿素0-5g，MgSO₄.7H₂O 0-1g，KH₂PO₄0-5g，CH₃COONa 0-5g，微量元素液10ml，维生素液10ml；所述微量元素液每L含有：MnCl₂·4H₂O 0-12g，FeSO₄·7H₂O 0-2g，CaCl₂·2H₂O 0-2g，CuSO₄·5H₂O0-2g，ZnCl₂0-0.1g；所述维生素液每L含有：生物素0-0.01g，硫胺素0-2mg，吡哆醇0-0.2g，烟酸0-2g。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基成分为：葡萄糖50-120g/L，尿素0-5g/L，MgSO₄.7H₂O 0-1g/L，KH₂PO₄0-5g/L，CH₃COONa 0-5g/L，微量元素液10ml，维生素液10ml，初始pH＝5.5。

在本发明的一种实施方式中，所述微量元素液配方为：将MnCl₂·4H₂O 0-12g，FeSO₄·7H₂O0-2g，CaCl₂·2H₂O 0-2g，CuSO₄·5H₂O 0-2g，和ZnCl₂0-0.1g用2mol/L的HCl溶解后定容至1L。

在本发明的一种实施方式中，所述维生素液配方为：将生物素0-0.01g，硫胺素0-2mg，吡哆醇0-0.2g，烟酸0-2g用2mol/L的HCl溶解后定容至1L。

在本发明的一种实施方式中，所述接种的接种量按体积比为5-10％。

本发明的第五个目的是提供所述菌在食品、化工、医药、农业领域生产含丙酮酸的产品中的应用。

本发明还提供所述方法在生产丙酮酸及其上下游产品方面的应用。

有益效果：本发明方法可提高丙酮酸产量和生产强度，相对于对照菌株T.glabrata CCTCC M202019，本发明构建的重组菌株TGΔarg8Δura3(CAGL0H02695g::ARG8；CAGL0K10626g::URA3)丙酮酸的产量、丙酮酸生产强度和底物转化率分别提高了12.8％、13.6％和34.8％，而细胞干重、葡萄糖消耗速率和副产物多糖分别降低了12.5％、17.9％和16.6％。

具体实施方式

菌株和质粒：光滑球拟酵母(TGΔarg8Δura3)为在T.glabrata CCTCC M202019的基础上敲除了URA3和ARG8基因的缺陷型菌株，是具有烟酸、生物素、硫胺素、盐酸吡哆醇，尿嘧啶和精氨酸6种营养缺陷型菌株。

细胞干重的测定：取一定量的菌悬液于10mL容量瓶中，加入2mL盐酸(2mol/L)溶解悬液中的碳酸钙，加去离子水定容到10mL，充分混匀，用UV 7500型可见光分光光度计，于660nm处测定OD值，利用细胞干重标准曲线计算出细胞干重。

丙酮酸和葡萄糖的测定：高效液相色谱(HPLC)。仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站)，色谱条件：色谱柱：Aminex HPX-87Hion exchange column，流动相：5mM H₂SO₄，流速：0.6mL/min，柱温：40℃，进样量：10μL，紫外检测器波长：210nm(检测丙酮酸)，示差折光检测器：检测葡萄糖，样品制备：1mL发酵液于12,000rpm下离心5min，上清经过适当的稀释处理和经0.22μL滤膜过滤后，进行高效液相色谱分析。

种子培养基(g/L)：葡萄糖15-30g，植物蛋白胨5-10g，磷酸二氢钾0-2g，七水硫酸镁0-1g，固体培养基添加20g琼脂。115℃灭菌15min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖50-120g，尿素0-5g，MgSO₄.7H₂O 0-1g，KH₂PO₄0-5g，CH₃COONa 0-5g，微量元素液(过滤除菌)10ml，维生素液(过滤除菌)10ml，于115℃下灭菌15min。40g/L的碳酸钙(单独灭菌)被添加用来调节pH。微量元素液：MnCl₂·4H₂O 0-12g，FeSO₄·7H₂O 0-2g，CaCl₂·2H₂O 0-2g，CuSO₄·5H₂O 0-0.1g，ZnCl₂0-1g，用2mol/L的HCl溶解后定容至1L。维生素液：生物素0-0.01g，硫胺素0-0.2mg，吡哆醇0-0.2g，烟酸0-2g，用2mol/L的HCl溶解后定容至1L。

表1引物

实施例1：多糖合成基因的敲除框的构建

利用设计好的PCR引物CAGL0H02695g-leftS、CAGL0H02695g-leftA和CAGL0H02695g-rightS、CAGL0H02695g-rightA分别从SEQ ID NO.1所示目的基因CAGL0H02695g在基因组的上下游各扩增600bp的序列，再利用利用引物ARG8-S和ARG8-A扩增出ARG8基因(序列如SEQ ID NO.3所示)，通过融合PCR将其3个片段连接起来构建获得CAGL0H02695g基因敲除框CAGL0HL-ARG8-CAGL0HR，并连接到T载上。同理，利用引物CAGL0K10626g-leftS、CAGL0K10626g-leftA和CAGL0K10626g-rightS、CAGL0K10626g-rightA从SEQ ID NO.2所示目的基因CAGL0K10626g在基因组的上下游各扩增600bp的序列，再利用引物URA3-S和URA3-A扩增出URA3基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，通过融合PCR将上述扩增获得的3个片段连接起来构建CAGL0K10626g敲除框CAGL0KL-URA3-CAGL0KR，将其连接到T载上。将上述融合构建好的2个多糖合成敲除框连接到T载进行测序，测序正确的带有目的敲除框的T载转化到感受态细胞JM109并涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上进行扩增和保存。

实施例2：重组菌的构建与鉴定

由于CAGL0H02695g敲除框上带有ARG8基因，将测序正确的CAGL0H02695g敲除框片段转化到尿嘧啶缺陷性和精氨酸缺陷性的受体菌中，得到在不含精氨酸但含有尿嘧啶的培养基上进行正常生长的多糖合成基因CAGL0H02695g缺陷的菌株TGΔarg8Δura3(CAGL0H02695g::ARG8)；进一步将上述构建成功并带有URA3基因的CAGL0K10626g敲除框转化到尿嘧啶缺陷性的受体菌TGΔarg8Δura3(CAGL0H02695g::ARG8)，得到在不含尿嘧啶和精氨酸的培养基中正常生长的多糖合成基因CAGL0H02695g和CAGL0K10626g双缺陷型的菌株TGΔarg8Δura3(CAGL0H02695g::ARG8；CAGL0K10626g::URA3)。

实施例3：重组菌与对照菌对照发酵实验

挑取重组菌TGΔarg8Δura3(CAGL0H02695g::ARG8；CAGL0K10626g::URA3)和对照菌T.glabrata的单菌落于种子培养基上活化培养18-24h，以10％的接种量，将上述活化培养好的种子液接种到发酵培养基中，在30℃，220rpm条件下进行发酵培养。发酵结果如表1所示。相对于对照菌T.glabrata，重组菌TGΔarg8Δura3(CAGL0H02695g::ARG8；CAGL0K10626g::URA3)的丙酮酸的产量、丙酮酸生产强度和底物转化率分别提高了12.8％、13.6％和34.8％，而其细胞干重、葡萄糖消耗速率和副产物多糖分别降低了12.5％、17.9％和16.6％。

表1 TGΔarg8Δura3(CAGL0H02695g::ARG8；CAGL0K10626g::URA3)与对照菌发酵对比

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种减少多糖积累强化光滑球拟酵母生产丙酮酸的方法

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1650

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgggtaagg agaatgttgc tgtagcgact ctgttatatt cggcggatta tctgcctggt 60

gtgtttacgt tggggtttca attgcggaaa cttatcgatg ctggcggttg tggatgtgtt 120

aagacgtgta ttgtggtgac caagttgctg tacaatgaca tactgagcga tatcagtaag 180

aacttgctga attgtttgta cgatgatatt gtgctcgtgg atcctttgga ttaccagcat 240

attacccagg acatgaacaa ggagaacttg aaaatgctgg agagacctga actgtccttt 300

gctctgatta aagcgaggat ctttgagcta acccagtatg agcaagtact ttacttggac 360

gctgacacct tgcctctgaa ctctggcata tttgacttat ttgaccagtt ggccgaccag 420

actagcgaac aagtcgccgc tgtcccagat atcggctggc cagacatttt caacagtggt 480

gttatgatga ttgtccctaa cagggacgtt gtcgccgaac taaacaacta cattttaaat 540

gtggtgtcca ttgatggttc tgaccaaggt atcctaaatc aatttttcaa tcagaacatg 600

agattgaatg attttgggag aatagccaat tactccacta aggaatggat taggttgcca 660

tacctttaca acgttactac gccaaattac ggctacgagt gccctccagc tatgaaattc 720

tttggcccac atattcgttt agtgcatttc attggtaaac ataaaccatg gagcaaatgg 780

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ttccaaatac agtatgatct ggttgatcta ttagcccata ctaccatcaa ggacgaggat 900

gagcacattg aacctcaaca ggatgagtgt gaagaacaca tagaagagaa ccaacctgat 960

gaataccacc atgagcaaac gcaatacaat gagcgtctgg agaagattga cgaaatcaac 1020

gaggacgagt gcgatattat tgaggaggaa caacaaccaa tagaaaaacc cccaactcca 1080

atccaacttc ctctagattt caaagaatgg ttaacaacat ttatatcgaa ggaagatgaa 1140

gagcaacaac ataacgaaga gccttccgtt gaggaatccc aaggaaatga gccagaagaa 1200

acacatttta gaggtgttca ttatgaggag catatgattc aacatcatga agaggaaacc 1260

ataaatagac aggtatcgca tccaaaagaa gacgccgcaa acgaggcagc aagagaaatt 1320

gaacaaccaa aagatagata tgatagaaag gttgagatta tagaggaaga agacataaag 1380

gatcatgaac tggatgattt aattgatgat gaatcgtcaa ccaataaaca agaggatgac 1440

gatgaaatag tagatgagca agaagagtct agacttgctt cggagctgga agtaaaggac 1500

tccaagatgg atgtacaaga atcaaggtca cataatattc acaaccaaaa taataataat 1560

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<210> 2

<211> 2091

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aagtgaaaaa actagattgg aaaattaagc gtaaaccgct tcaatag 47

<210> 9

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctattgaagc ggtttacgct taattttcca atctagtttt ttcactt 47

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tggttagtgg cataggatat caaagc 26

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

caagtaaact gcattttagt gt 22

<210> 12

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgttccttat atgtagcttt cgacatgata ctgtaattgg ttagttagaa a 51

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tttctaacta accaattaca gtatcatgtc gaaagctaca tataaggaac g 51

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

agtgggattg agaagggtta attagttttg ctggccgcat c 41

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gatgcggcca gcaaaactaa ttaacccttc tcaatcccac t 41

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gagaggcaat ctaatttaat tgg 23

Claims

1.一种丙酮酸产量和生产强度提高的光滑球拟酵母重组菌，其特征在于，所述重组菌是以缺失了URA3和ARG8基因的T.glabrata CCTCC M202019为宿主，采用同源重组的方式敲除了SEQ ID NO.1所示基因CAGL0H02695g和SEQ ID NO.2所示基因CAGL0K10626g。

2.权利要求1所述的重组菌的构建方法，其特征在于，以缺失了URA3和ARG8基因的T.glabrata CCTCC M202019为出发菌株，采用同源重组的方式敲除了SEQ ID NO.1所示的基因CAGL0H02695g和SEQ ID NO.2所示的基因CAGL0K10626g。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤为：(1)扩增目的基因CAGL0H02695g在基因组所在位置上下游各600bp的序列CAGL0HL和CAGL0HR，将CAGL0HL和CAGL0HR及序列如SEQ ID NO.3所示的ARG8基因融合，构建CAGL0H02695g基因敲除组件CAGL0HL-ARG8-CAGL0HR；(2)扩增目的基因CAGL0K10626g在基因组的上下游各600bp的序列CAGL0KL和CAGL0KR，将CAGL0KL和CAGL0KR及序列如SEQ ID NO.4所示的URA3基因融合，构建CAGL0K02695g基因敲除组件CAGL0KL-URA3-CAGL0KR；(3)将CAGL0HL-ARG8-CAGL0HR和CAGL0KL-URA3-CAGL0KR分别与T载体连接，分别转化至缺失了URA3和ARG8基因的T.glabrata CCTCC M202019中。

4.一种提高丙酮酸产量和生产强度的方法，其特征在于，所述方法是在产丙酮酸的菌株中敲除多糖合成相关的基因；所述多糖合成相关的基因包括SEQ ID NO.1所示的基因CAGL0H02695g和SEQ ID NO.2所示的基因CAGL0K10626g；所述产丙酮酸的菌株是缺失了URA3基因和ARG8基因的光滑球拟酵母T.glabrata CCTCC M202019。

5.一种利用权利要求1所述重组菌发酵生产丙酮酸的方法，其特征在于，将重组菌按体积比5-10％的接种量接种至发酵培养基，在30℃，200～220rpm条件下进行发酵培养。

6.权利要求1所述重组菌在食品、化工、医药、农业领域生产含丙酮酸的产品中的应用。