CN106497857B - 一株可以高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌工程菌 - Google Patents

一株可以高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌工程菌 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株高产聚γ‑谷氨酸的地衣芽胞杆菌工程菌，其保藏号为CCTCC No:M2016439，命名为地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis(WX‑02)/pHY‑zwf，并进一步提供了地衣芽胞杆菌WX‑02/pHY‑zwf的构建方法及高产聚γ‑谷氨酸的方法。通过基因工程改造增加胞内NADPH的合成水平，提高γ‑PGA的产量。通过构建6‑磷酸葡萄糖脱氢酶过表达载体pHY‑zwf，并转化至实验室之前保存的产γ‑PGA地衣芽胞杆菌WX‑02中,重新构建了地衣芽胞杆菌产γ‑PGA工程菌WX‑02/pHY‑zwf。该菌株在优化培养基和培养条件下可以显著提高γ‑PGA的合成。其聚γ‑谷氨酸产量高达51.13g/L；与原始菌株相比聚γ‑谷氨酸产量显著提高49％。

Description

一株可以高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌工程菌
技术领域
本发明属于基因工程和微生物代谢工程技术领域，特别是涉及一株可以高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌工程菌。
背景技术
聚γ-谷氨酸是一种具有广泛用途的阴离子型高分子聚合物，其具有诸多特点：易溶于水；良好的保水能力；吸附金属离子；缓释性和可生物降解。因为聚γ-谷氨酸特殊的生物学性质，其在农业，医药，食品，化妆品等领域具有广泛用途。
相关文献报道，聚γ-谷氨酸的产生菌主要由枯草芽胞杆菌，解淀粉芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌等。一般来说，聚γ-谷氨酸的合成主要由内源和外源两种途径。外源途径主要是在培养基中添加谷氨酸，谷氨酸经转运至胞内从而形成聚γ-谷氨酸；而内源途径则主要是葡萄糖经糖酵解途径，TCA循环，由α-酮戊二酸形成谷氨酸。目前为止，人们主要是通过以下策略构建重组菌株来提高聚γ-谷氨酸产量有：1、强化谷氨酸合成途径；2、副产物合成途径的中断；3、强化聚γ-谷氨酸合成酶表达和ATP供应等。通过这些方面的基因工程改造，都能实现聚γ-谷氨酸产量的提高。
NADPH的供给水平在目标产物的合成过程中具有重要作用。而NADPH再生途径主要有磷酸戊糖途径，TCA循环和转氢酶途径等三个途径，其中磷酸戊糖在NADPH再生过程中起着主要作用。6-磷酸葡萄糖脱氢酶是6-磷酸葡萄糖进入磷酸戊糖途径的第一个酶，也是其整个磷酸戊糖途径的限速酶，因而Zwf在NADPH再生中具有重要作用。在之前的研究中，Wanget al(2012)在枯草芽孢杆菌中通过过表达Zwf将核黄素的产量提高了31％。然而，Zwf表达水平与聚γ-谷氨酸发酵产量之间的关系并没有人研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供可以高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌工程菌。
本发明第一方面提供了一种地衣芽胞杆菌，所述地衣芽胞杆菌于年月日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M2016439，命名为地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis(WX-02)/pHY-zwf，保藏日期：2016年8月30日。
本发明第二方面提供了地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf的构建方法，其步骤包括：在过表达质粒pHY300PLK基础上，构建过表达质粒pHY-zwf，重组质粒转化地衣芽胞杆菌WX-02后得到地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf；所述地衣芽胞杆菌WX-02，该菌保藏编号为CCTCC No:M208065，命名为地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformisWX-02，保藏日期：2008年4月28日。
本发明第三方面提供了地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf产聚γ-谷氨酸的方法，其步骤包括：
(1)种子培养：将地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf接至LB培养基中进行种子培养得到发酵菌种；
(2)发酵培养：将发酵菌种接至发酵培养基中进行发酵培养，所述发酵培养基配方为：30-100g/L葡萄糖；5-12g/L NH4Cl；5-15g/L柠檬酸钠；10-50g/L谷氨酸钠；0.1-1.5g/LK2HPO4·3H2O；0.1-1.5g/LMgSO4·7H2O；0.1-1.5g/LZnSO4·7H2O；0.1-1.5g/LCaCl2；0.10g/LMnSO4·H2O；pH 6.0-8.0；所述发酵培养条件为：发酵温度为30-40℃，装液量为容器体积的10-30％，摇床转速200-260r/min，发酵周期34-38h。
本发明的有益效果是：本发明通过基因工程改造增加胞内NADPH的合成水平，α-酮戊二酸形成谷氨酸过程中会消耗大量NADPH，以此提高γ-PGA的产量。通过构建6-磷酸葡萄糖脱氢酶过表达载体pHY-zwf，并转化至实验室之前保存的产γ-PGA地衣芽胞杆菌WX-02中,重新构建了地衣芽胞杆菌产γ-PGA工程菌WX-02/pHY-zwf。本发明的地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在液体发酵过程中可以高产聚γ-谷氨酸，其聚γ-谷氨酸产量高达51.13g/L，为以后的科学研究和工业化生产奠定了基础，具有非常广阔的应用前景。
附图说明
图1为zwf过表达载体中表达元件琼脂糖凝胶图；
图2为zwf基因过表达载体质粒图谱；
图3为重组载体转化地衣芽胞杆菌WX-02菌落PCR验证图；
图4为地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在优化培养基中发酵终点测定聚γ-谷氨酸产量示意图。
具体实施方式
本发明第一方面提供了一种地衣芽胞杆菌，所述地衣芽胞杆菌于年月日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M2016439，命名为地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis(WX-02)/pHY-zwf。
进一步的，本发明提供了上述地衣芽胞杆菌在产聚γ-谷氨酸中的应用。本发
明第二方面提供了地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf的构建方法，其步骤包括：在过表达质粒pHY300PLK基础上，构建过表达质粒pHY-zwf，重组质粒转化地衣芽胞杆菌WX-02后得到地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf；所述地衣芽胞杆菌WX-02，该菌保藏编号为CCTCC No:M208065，命名为地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformisWX-02。
优选的，所述过表达质粒pHY-zwf，其启动子为枯草芽胞杆菌168中P43启动子，zwf为地衣芽胞杆菌WX-02中6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因，终止子为地衣芽胞杆菌WX-02中amyL终止子。
本发明第三方面提供了地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf产聚γ-谷氨酸的方法，其步骤包括：
(1)种子培养：将地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf接至LB培养基中进行种子培养得到发酵菌种；
(2)发酵培养：将发酵菌种接至发酵培养基中进行发酵培养，所述发酵培养基配方为：30-100g/L葡萄糖；5-12g/L NH4Cl；5-15g/L柠檬酸钠；10-50g/L谷氨酸钠；0.1-1.5g/LK2HPO4·3H2O；0.1-1.5g/LMgSO4·7H2O；0.1-1.5g/LZnSO4·7H2O；0.1-1.5g/LCaCl2；0.10g/LMnSO4·H2O；pH 6.0-8.0；所述发酵培养条件为：发酵温度为30-40℃，装液量为容器体积的10-30％，摇床转速200-260r/min，发酵周期34-38h。
优选的，所述种子培养的条件为：培养温度为30-39℃，装液量为容器体积的15-25％，摇床转速160-200r/min，培养时间为8-12h。
下面将结合具体实施例对本发明提供的一株可以高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌工程菌予以进一步说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
实施例1
本实施例提供了地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf及其构建方法。
1重组载体中表达元件的克隆
以枯草芽胞杆菌168的总DNA为模板，根据NCBI公布的枯草芽胞杆菌168的基因组序列，采用PCR的方法扩增出启动子P43的序列SEQ ID NO:1，引物分别为P43-F SEQ ID NO:2、P43-R SEQ ID NO:3；以地衣芽胞杆菌WX-02的总DNA为模板，根据NCBI上公布的地衣芽胞杆菌WX-02基因组序列，采用PCR的方法扩增出6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf序列SEQ IDNO:4，引物为zwf-F SEQ ID NO:5、zwf-R SEQ ID NO:6；以地衣芽胞杆菌WX-02的总DNA为模板，根据NCBI上公布的地衣芽胞杆菌WX-02基因组序列，采用PCR的方法扩增出淀粉酶基因amyL终止子的序列SEQ ID NO:7，引物为TamyL-F SEQ ID NO:8、TamyL-R SEQ ID NO:9。
对zwf过表达载体中表达元件进行了琼脂糖凝胶电泳检测，其琼脂糖凝胶图如附图1所示，其中，泳道1为5K DNA marker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，泳道2为来源于枯草芽胞杆菌168中启动子P43的条带(305bp)；泳道3为来源地衣芽胞杆菌WX-02中6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因zwf的条带(1479bp)；泳道4为来源于地衣芽胞杆菌WX-02中淀粉酶基因amyL终止子条带(501bp)。
2以P43为启动子强化表达zwf基因的过表达载体的构建
以实验室保存的表达载体pHY300PLK为初始载体构建zwf基因过表达载体，所述表达载体pHY300PLK可市场购买得到。先将P43启动子、6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf及淀粉酶基因amyL的终止子片段通过SOE-PCR的方法连到一起。通过EcoRI/XbaI双酶切，纯化回收后与同样经过EcoRI/XbaI双酶切的pHY300PLK空质粒酶连，酶连温度为16℃，时间为8h，酶连产物随后转化E.coli DH5α，挑转化子进行菌落PCR验证，将PCR验证正确的转化子挑菌接至含有5mL LB培养基的PA瓶中(50ug/mL氨苄抗生素)，抽质粒并测序。
所述zwf基因过表达载体质粒图谱如附图2所示，以表达质粒pHY300PLK为原始质粒，在其基础上加入来源于枯草芽胞杆菌168的启动子P43，来源于地衣芽胞杆菌WX-02中6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf及来源于地衣芽胞杆菌WX-02中淀粉酶基因amyL的终止子，构建了重组质粒pHY-zwf。
3地衣芽胞杆菌高产聚γ-谷氨酸工程菌株WX-02/pHY-zwf的构建将构建
好的过表达载体pHY-zwf转化地衣芽胞杆菌WX-02。首先做地衣芽胞杆菌WX-02感受态，在平板上活化菌种，然后挑菌至含有5mL LB的PA瓶中，37℃过夜培养，随后以5％的接种量转接至生长培养基中，37℃，200rpm培养至OD600到0.85左右，5500rpm离心6min收集菌体，用洗涤培养基重悬菌体，5500rpm离心6min，重复三次后加入1mL洗涤培养基重悬菌体，分装至灭过菌的1.5mLEP管中，-80℃保存。
将吹干后的电转杯在冰上预冷15min，然后将100ul的地衣芽胞杆菌WX-02感受态细胞与10ul重组载体混匀后加入电转杯中，冰上预冷3-5min后，2.4kV条件下电击，电击时间4.8-5.2ms，随后立即加入800ul恢复培养基并转移至1.5mLEP管中。37℃，100rpm培养3h后涂LB平板(20ug/mL四环抗生素)。待长出转化子后挑菌进行菌落PCR验证和抽质粒验证，验证正确后保存菌种，即得地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf。
重组载体转化地衣芽胞杆菌WX-02菌落PCR验证图如附图3所示，其中，泳道1为采用菌落PCR验证条带(2585bp)，通道2为5K marker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。
实施例2
本实施例提供了地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf产聚γ-谷氨酸的方法，通过地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在不同发酵条件下进行发酵实验，得到高产聚γ-谷氨酸的方法。
所述发酵实验得到的聚γ-谷氨酸均采用如下测定方法和定量方法：
在2.0mL发酵液中加入2倍体积的无水乙醇，震荡混合，在8000r/min离心10min。丢弃上清，其离心沉淀用2.0mL去离子水溶解，震荡均匀。取1.0mL溶液于比色管中，加入1mL浓盐酸，密封后于100℃下水解24h。水解结束后，用1mol/L NaOH定容10mL，再经0.22μm微孔滤膜过滤。HPLC测定采用Lichrospher C18色谱柱(25cm×4.6mm)。检测波长210nm。流动相为含5.0％甲醇的100mmol/L KH2PO4(用磷酸调pH值至2.5)。流速1.0mL/min。进样量为1.0μL。以聚γ-谷氨酸标准品作为对照，对发酵液产物进行定量分析。
一、地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在ME发酵培养基的发酵实验
挑取WX-02和WX-02/pHY-zwf菌落分别接种于5mL LB培养基中，37℃，240r/min振荡培养过夜。再以2％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中，直到OD600为1.0时，以1％的接种量接种到预先准备好的ME发酵培养基中，37℃，240r/min，发酵时间36h。
所述LB培养基：10g/L蛋白胨；5g/L酵母浸出粉；10g/L氯化钠；pH 7.0-7.2；固体培养基加琼脂18g/L。
所述ME发酵培养基：20g/L葡萄糖；20g/L谷氨酸钠；12g/L柠檬酸钠；7g/L NH4Cl；0.5g/LK2HPO4·3H2O；0.5g/LMgSO4·7H2O；0.5g/LZnSO4·7H2O；0.15g/LCaCl2；0.10g/LMnSO4·H2O；pH 7.2。
在ME培养基中，原始菌株WX-02和重组菌WX-02/pHY-zwf的聚γ-谷氨酸最高产量分别达到22.2g/L和28.8g/L，工程菌比原始菌株提高了27.1％。二、
地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在不同葡萄糖浓度下聚γ-谷氨酸的发酵
挑取菌落WX-02/pHY-zwf接种于5mL LB培养基中，37℃，240r/min振荡培养过夜。再以1％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中，直到OD600为1.0时，以1％的接种量接种到预先准备好的葡萄糖浓度为20-100g/L的优化培养基中，37℃，240r/min，发酵时间36h。
所述优化培养基：20-100g/L葡萄糖；20g/L谷氨酸钠；12g/L柠檬酸钠；7g/LNH4Cl；0.5g/LK2HPO4·3H2O；0.5g/LMgSO4·7H2O；0.5g/LZnSO4·7H2O；0.15g/LCaCl2；0.10g/LMnSO4·H2O；pH 7.2。
地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf的聚γ-谷氨酸最高产量达到38.6g/L，工程菌比原始菌株提高了39.2％。
三、地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在不同NH4Cl浓度下聚γ-谷氨酸的发酵
挑取菌落WX-02/pHY-zwf接种于5mL LB培养基中，37℃，240r/min振荡培养过夜。再以1％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中，直到OD600为1.0时，以1％的接种量接种到预先准备好的NH4Cl浓度为5-15g/L的优化培养基中，37℃，240r/min，发酵时间36h。
所述优化培养基：20g/L葡萄糖；20g/L谷氨酸钠；12g/L柠檬酸钠；5-15g/L NH4Cl；0.5g/LK2HPO4·3H2O；0.5g/LMgSO4·7H2O；0.5g/LZnSO4·7H2O；0.15g/LCaCl2；0.10g/LMnSO4·H2O；pH 7.2。
地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf的聚γ-谷氨酸最高产量达到36.2g/L，工程菌比原始菌株提高了38.6％。
四、地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在不同柠檬酸钠浓度下聚γ-谷氨酸的发酵
挑取菌落WX-02/pHY-zwf接种于5mL LB培养基中，37℃，240r/min振荡培养过夜。再以1％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中，直到OD600为1.0时，以1％的接种量接种到预先准备好的柠檬酸钠浓度5-15g/L的优化培养基中，37℃，240r/min，发酵时间36h。
所述优化培养基：20g/L葡萄糖；20g/L谷氨酸钠；5-15g/L柠檬酸钠；7g/L NH4Cl；0.5g/LK2HPO4·3H2O；0.5g/LMgSO4·7H2O；0.5g/LZnSO4·7H2O；0.15g/LCaCl2；0.10g/LMnSO4·H2O；pH 7.2。
地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf的聚γ-谷氨酸最高产量达到34.5g/L，工程菌比原始菌株提高了36.4％。
五、地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在不同谷氨酸钠浓度下聚γ-谷氨酸的发酵
挑取菌落WX-02/pHY-zwf接种于5mL LB培养基中，37℃，240r/min振荡培养过夜。再以1％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中，直到OD600为1.0时，以1％的接种量接种到预先准备好的谷氨酸钠浓度10-50g/L的优化培养基中，37℃，240r/min，发酵时间36h。
所述优化培养基：20g/L葡萄糖；10-50g/L谷氨酸钠；12g/L柠檬酸钠；7g/L NH4Cl；0.5g/LK2HPO4·3H2O；0.5g/LMgSO4·7H2O；0.5g/LZnSO4·7H2O；0.15g/LCaCl2；0.10g/LMnSO4·H2O；pH 7.2。
地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf的聚γ-谷氨酸最高产量达到44.8g/L，工程菌比原始菌株提高了43.6％。
六、地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在优化培养基中聚γ-谷氨酸的发酵挑取
菌落WX-02/pHY-zwf接种于5mL LB培养基中，37℃，240r/min振荡培养过夜。再以1％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中，直到OD600为1.0时，以1％的接种量接种到预先准备好的优化培养基中，37℃，240r/min，发酵时间36h。
所述优化培养基：30-100g/L葡萄糖；5-12g/L NH4Cl；5-15g/L柠檬酸钠；10-50g/L谷氨酸钠；0.1-1.5g/LK2HPO4·3H2O；0.1-1.5g/LMgSO4·7H2O；0.1-1.5g/LZnSO4·7H2O；0.1-1.5g/LCaCl2；0.10g/LMnSO4·H2O；pH 6.0-8.0.
地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf的聚γ-谷氨酸最高产量达到51.13g/L，见附图4，工程菌比原始菌株提高了49％。
实施例3
本实施例提供了地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在优化培养基中产聚γ-谷氨酸的方法，具体步骤包括：
挑取菌落WX-02/pHY-zwf接种于5mL LB培养基中，37℃，240r/min振荡培养过夜。再以1％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中，直到OD600为1.0时，以1％的接种量接种到预先准备好的优化培养基中，40℃，240r/min，发酵时间36h。
所述优化培养基：100g/L葡萄糖；12g/L NH4Cl；5g/L柠檬酸钠；10g/L谷氨酸钠；1.5g/LK2HPO4·3H2O；1.5g/LMgSO4·7H2O；1.5g/LZnSO4·7H2O；1.5g/LCaCl2；0.15g/LMnSO4·H2O；pH 8.0。
所得发酵结果与实施例2基本一致，聚γ-谷氨酸产量相比于原始菌株有明显提高。
实施例4
本实施例提供了地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在优化培养基中产聚γ-谷氨酸的方法，具体步骤包括：
挑取菌落WX-02/pHY-zwf接种于5mL LB培养基中，37℃，240r/min振荡培养过夜。再以1％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中，直到OD600为1.0时，以1％的接种量接种到预先准备好的优化培养基中，30℃，240r/min，发酵时间36h。
所述优化培养基：50g/L葡萄糖；8g/L NH4Cl；10g/L柠檬酸钠；10g/L谷氨酸钠；0.8g/LK2HPO4·3H2O；0.8g/LMgSO4·7H2O；0.8g/LZnSO4·7H2O；0.8g/LCaCl2；0.15g/LMnSO4·H2O；pH 7.0.
所得发酵结果与实施例2基本一致，聚γ-谷氨酸产量相比于原始菌株有明显提高。
实施例5
本实施例提供了地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在优化培养基中产聚γ-谷氨酸的方法，具体步骤包括：
挑取菌落WX-02/pHY-zwf接种于5mL LB培养基中，37℃，240r/min振荡培养过夜。再以1％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中，直到OD600为1.0时，以1％的接种量接种到预先准备好的优化培养基中，34℃，240r/min，发酵时间36h。
所述优化培养基：30g/L葡萄糖；10g/L NH4Cl；5g/L柠檬酸钠；50g/L谷氨酸钠；0.8g/LK2HPO4·3H2O；0.8g/LMgSO4·7H2O；0.8g/LZnSO4·7H2O；0.8g/LCaCl2；0.15g/LMnSO4·H2O；pH 6.0.
所得发酵结果与实施例2基本一致，聚γ-谷氨酸产量相比于原始菌株有明显提高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖北大学
<120> 一株高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌工程菌
<130> 2016
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 305
<212> DNA
<213> 枯草芽胞杆菌168中P43启动子
<400> 1
tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60
taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120
tttgcgtttt taccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180
aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240
gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300
atgaa 305
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgataggtgg tatgttttcg 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttcatgtgta cattcctc 18
<210> 4
<211> 1479
<212> DNA
<213> 地衣芽胞杆菌WX-02中6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf
<400> 4
ttgaaaaaag atcaaatgga accaaaagca gttatcgtaa tatttggcgc aacaggggat 60
ttggcaaaac gaaaactata tccttctatc cacaggctct acgaaaacgg acaaatcggg 120
aatgaattcg cggttgtcgg agtcggcaga cgcccttgga caaatgaaga ctttcgcagt 180
actgtacagc aatcggtttc gaagtttccg ttaaacgaaa aggatgtaga cgagtttaca 240
tctcacttct actatcatcc ttttgatgtt acaaattccg gctcataccg ggaattgaac 300
gaacttttag agaagctgga aagtacatat gatattccga ataaccggat gttttactta 360
gcgatggctc ctgaattttt cggaacgatt gcaaagttcc taaaatcaga gggtgtcact 420
tcaacaacag gctggtcaag gctcgtgatc gagaagcctt tcggacatga tctgccgagc 480
gcaaaatcct tgaatcagga aattcgtgaa gcctttacag aagatcaaat ctatcggatt 540
gaccattatc taggaaagca aatggtgcag aacatcgaag tcatccgctt tgccaacgcg 600
atttttgagc cgctttggac aaacagatac atctcgaata ttcaaatcac gtcaagtgaa 660
gatttgggtg tggaagacag agcgagatat tatgaaaaat ccggtgcgct tcgagacatg 720
gttcaaaacc acattcttca aatggtggcg ctgcttgcga tggaaccgcc gatcaagctg 780
aacacggaag agatccgcag cgaaaaagtg aaggtgctca gagcccttcg tccgattcga 840
aaagacgaag tcgatcagtt ttttgtgcgc ggccagtatg acgcgggtgt cgttgacgaa 900
aaacaggttc cggcttatcg cgatgagcaa aatgtagcaa aagagtcgaa tacggaaacg 960
ttcgttgccg gcaaactgct gatcgacaac ttcagatggg ccggtgtgcc gttctacatc 1020
cggacaggga aacggatgca gaaaaaatca acgcagattg tcgtccaatt taaagacatt 1080
ccgatgaatc tttattacgg aaacggcaac acgatgcatc ctaacctgct ggtgatccat 1140
attcaacctg atgaaggcat cacccttcat ttaaacgcaa ggaagcttgg aggcggcact 1200
tttgcccagc cgatcaagct cgactactgc cataactgcg gggacggcat caacacgcct 1260
gaagcttatg aaaagctgat tttggactgt ttgcacggag acgcgacaaa ctttgcccac 1320
tgggatgaag ttgcgctttc ctggagtttt gttgatgcga tttctcaaaa ctgggaggaa 1380
aacaaaaccc tttcccctaa ctatgaggcg ggctctatgg gaccgaaagc ttctgatgac 1440
ctgctcgcaa aagacggctt tcattggtgg ccgctttaa 1479
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttgaaaaaag atcaaatgga 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttaaagcggc caccaatga 19
<210> 7
<211> 501
<212> DNA
<213> 地衣芽胞杆菌WX-02中淀粉酶基因amyL的终止子
<400> 7
aagagcagag aggacggatt tcctgaagga aatccgtttt tttattttgc ccgtcttata 60
aatttctttg attacatttt ataattaatt ttaacaaagt gtcatcagcc ctcaggaagg 120
acttgctgac agtttgaatc gcataggtaa ggcggggatg aaatggcaac gttatctgat 180
gtagcaaaga aagcaaatgt gtcgaaaatg acggtatcgc gggtgatcaa tcatcctgag 240
actgtgacgg atgaattgaa aaagcttgtt cattccgcaa tgaaggagct caattatata 300
ccgaactatg cagcaagagc gctcgttcaa aacagaacac aggtcgtcaa gctgctcata 360
ctggaagaaa tggatacaac agaaccttat tatatgaatc tgttaacggg aatcagccgc 420
gagctggacc gtcatcatta tgctttgcag cttgtcacaa ggaaatctct caatatcggc 480
cagtgcgacg gcattattgc g 501
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aagagcagag aggacggatt 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cgcaataatg ccgtcgcact g 21

Claims (6)

1.一种地衣芽胞杆菌，其特征在于：所述地衣芽胞杆菌的保藏编号为CCTCC No:M2016439，命名为地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis(WX-02)/pHY-zwf。
2.权利要求1所述地衣芽胞杆菌在产聚γ-谷氨酸中的应用。
3.一种如权利要求1所述的地衣芽胞杆菌的构建方法，其步骤包括：在过表达质粒pHY300PLK基础上，构建过表达质粒pHY-zwf，重组质粒转化地衣芽胞杆菌WX-02后得到地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf；所述地衣芽胞杆菌WX-02，该菌保藏编号为CCTCC No:M208065，命名为地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformisWX-02。
4.如权利要求3所述的地衣芽胞杆菌的构建方法，其特征在于：所述过表达质粒pHY-zwf，其启动子为枯草芽胞杆菌168中P43启动子，zwf为地衣芽胞杆菌WX-02中6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因，终止子为地衣芽胞杆菌WX-02中amyL终止子。
5.权利要求1所述地衣芽胞杆菌发酵产聚γ-谷氨酸的方法，其步骤包括：
(1)种子培养：将地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf接至LB培养基中进行种子培养得到发酵菌种；
(2)发酵培养：将发酵菌种接至发酵培养基中进行发酵培养，所述发酵培养基配方为：30-100g/L葡萄糖；5-15g/L NH4Cl；5-15g/L柠檬酸钠；10-50g/L谷氨酸钠；0.1-1.5g/LK2HPO4·3H2O；0.1-1.5g/LMgSO4·7H2O；0.1-1.5g/LZnSO4·7H2O；0.1-1.5g/LCaCl2；0.10g/LMnSO4·H2O；pH 6.0-8.0；所述发酵培养条件为：发酵温度为30-40℃，装液量为容器体积的10-30％，摇床转速200-260r/min，发酵周期30-38h。
6.如权利要求5所述地衣芽胞杆菌发酵产聚γ-谷氨酸的方法，其特征在于：所述种子培养的条件为：培养温度为30-39℃，装液量为容器体积的15-25％，摇床转速160-200r/min，培养时间为8-12h。
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