CN106526203B - 一种用于左半结肠癌检测的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于左半结肠癌检测的试剂盒，其包含能检测KLK6蛋白的适配子，可用于左半结肠癌的筛查。本发明的试剂盒，具有高灵敏、成本低的特点，适合大规模的筛查。

Description

一种用于左半结肠癌检测的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于左半结肠癌检测的试剂盒。

背景技术

结直肠癌是世界上仅次于肺癌和乳腺癌的第三大常见肿瘤。在发达国家和地区处于较高水平.20世纪70年代以来，随着社会经济的发展，我国居民生活习惯、饮食结构的改变以及人口老龄化的进程加快，我国结直肠癌发病率和死亡率呈逐步上升趋势，成为危害我国居民健康的主要恶性肿瘤之一，给社会经济造成沉重的负担，严重地影响我国社会经济的健康发展。

结直肠癌是消化***肿瘤中可获得较好防治效果的癌种，筛查方法安全，有效，临床治疗效果较佳。研究显示，大便潜血试验在45-74岁人群中每2年开展筛查能降低结直肠癌15％死亡风险。国外研究结果显示在55-64岁人群中使用乙状结肠镜开展筛查，能降低人群33％的发病率及43％死亡率。

但是由于结直肠癌在医学上又分为右半结肠癌、左半结肠癌、直肠癌，这三种癌症在表面上都属于结直肠癌，但是其实质上病程各不相同。右半结肠的主要临床症状为食欲不振、恶心、呕吐、贫血、疲劳、腹痛。右半结肠癌导致缺铁性贫血，表现疲劳、乏力、气短等症状。右半结肠因肠腔宽大，肿瘤生长至一定体积才会出现腹部症状，这也是肿瘤确诊时，分期较晚的主要原因之一。左半结肠肠腔较右半结肠肠腔窄，左半结肠癌更容易引起完全或部分性肠梗阻。肠阻塞导致大便习惯改变，出现便秘、便血、腹泻、腹痛、腹部痉挛、腹胀等。带有新鲜出血的大便表明肿瘤位于左半结肠末端或直肠。病期的确诊常早于右半结肠癌。直肠癌的主要临床症状为便血、排便习惯的改变及梗阻。癌肿部位较低、粪块较硬者，易受粪块摩擦引起出血，多为鲜红或暗红色，不与成形粪便混和或附于粪柱表面，误诊为“痔”出血。病灶刺激和肿块溃疡的继发性感染，不断引起排便反射，易被误诊为“肠炎”或“菌痢”。癌肿环状生长者，导致肠腔缩窄，早期表现为粪柱变形、变细，晚期表现为不全性梗阻。而且三种癌症在治疗上也是采用不同的方式和药物，因此，在诊断早期就特异性的区分三种类型的癌症的种类，对于医生的治疗能够提供更加精确的指导。而现有技术的检测方法都不能达到这种要求，因此，开发一种能够区分三种癌症的手段变得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够特异性区分右半结肠癌、左半结肠癌、直肠癌，并且能够准确检测左半结肠癌的方法。

本发明另外提供一种筛选用于检测左半结肠癌的标志物的筛选方法，所述标志物是通过直肠癌患者与右半结肠癌、左半结肠癌和健康患者之间，通过基因组测序比对筛选，获得差异表达的标志物，通过优化以及实际检测而获得的。所述标志物为KLK6蛋白，血液中的含量大于0.08ug/ml即能够鉴定为左半结肠癌。

本发明另外提供一种特异结合KLK6蛋白的核酸适体及其试剂盒或者是特异性结合该蛋白的单克隆抗体及其试剂盒。

本发明提供的核酸适体，是序列表的序列1-16所示的单链DNA。

所述核酸适体与KLK6蛋白具有较好的亲和能力。

还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。

利用本发明的核酸适体，可以捕获血液中的KLK6蛋白，通过定量测定KLK6蛋白的含量，既可以准确的用于鉴定患者是否是左半结肠癌。利用本发明的核酸适体，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点，适宜于推广使用。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、直肠癌标志物的筛选及鉴定

1.样本采集

采集了15例临床鉴定为直肠癌患者、13例子临床鉴定为右半结肠癌患者、10例左半结肠癌患者的外周血样本5mL，抗凝，-80摄氏度保存。所述患者均来自天津医科大学肿瘤医院，并且与患者签订了知情同意书，也符合伦理要求。

2.RNA提取

按照Trizol Reagent试剂盒操作说明提取大肠癌组织和正常对照组织的总RNA，DEPC处理水溶解，Nanodrop-1000核酸蛋白测定仪测定总RNA的浓度和纯度，-80℃保存。通过检测，RNA浓度总体整体在100ug-250ug/mL之间，能够用于后续文库的建立。

3.测序文库的建立

用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA后，用片段化缓冲剂(Fragment buffer)将其打断成短片段，以mRNA为模板用6碱基随机引物(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)合成第1条cDNA链，再加入缓冲液、RNaseH、dNTPs和DNA polymerase I合成第2条cDNA链，再用QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱；在做末端修复和加poly(A)并连接测序接头后，用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建立测序文库。所述方法为本领域常规的方法，在此不一一赘述。

4.测序及标志物的筛选获得

用Illumina HiSeqTM 2000进行文库的测序，由深圳华大基因科技有限公司测序。用组装软件Trinity对样本的基因组序列转录组从头组装。差异基因的筛选首先用FCFold-change倍数变化和统计检测P值初选,然后用FDRFalsediscovery ratio校验方法对P值进行假阳性检验.通过筛选获得如下较大的差异基因。分别如下表1所示。

从以上结果可以看出，MUT基因的超量表达与直肠癌患者直接相关，而TPP1基因的超量表达与右半结肠癌患者直接相关，KLK6的超量表达与左半结肠癌患者直接相关。并且在三种癌症患者中：MUT蛋白血液中的含量大于0.05ug/ml即能够鉴定为直肠癌；TPP1蛋白血液中的含量大于0.07ug/ml即能够鉴定为右半结肠癌；KLK6蛋白血液中的含量大于0.08ug/ml即能够鉴定为左半结肠癌。

为了验证所述超量表达与癌症直接相关，分别另外各取三种癌症患者5例，以正常患者为对照，随机混合样本，通过检测发现，MUT蛋白血液中的含量大于0.05ug/ml即全部鉴定为直肠癌；TPP1蛋白血液中的含量大于0.07ug/ml即全部鉴定为右半结肠癌；KLK6蛋白血液中的含量大于0.08ug/ml即全部鉴定为左半结肠癌，与临床结果一致。这充分说明所述标记物可以用于快速检测。

实施例2KLK6蛋白核酸适体的筛选和制备

设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括36个核苷酸的随机核酸文库如下：

5’-TCAAGCATGAATTGCAGAATGAC(N36)AGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA-3’；N36代表36个随机核苷酸。

(1)首先对原始随机寡核苷酸库进行全库扩增，以增加其拷贝数，便于筛选的进行。以上游引物和生物素修饰的下游引物对原始随机寡核苷酸库进行PCR扩增，使用购于上海生工公司PCR试剂盒。反应体系如下：

上游引物100pmol(5，-TCAAGCATGAATTGCAGAATGAC-3，)

下游引物100pmol(5，-biotin-TGCTTACTGGCTACTCACTTGCT-3，)

模板DNA 10μg(5’-TCAAGCATGAATTGCAGAATGAC(N36)AGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA-3’)

其中，所述下游引物是生物素修饰的下游引物。

PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，热循环共22次，热循环条件为94℃变性1分钟，56℃复性52秒，72℃延伸53秒，最后72℃延伸10分钟。

得到PCR扩增的产物，将所述产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行胶回收并定量，根据DNA的量决定表面具有链霉亲和素修饰的顺磁性磁珠加入量，所述DNA与磁珠的摩尔比为1：2.5。将DNA与磁珠孵育35分钟后，用PBS-T缓冲液清洗磁珠2遍，然后用200μL 100mM的NaOH使dsDNA(双链DNA)变性，磁力分离，去除磁珠，得到ssDNA溶液，将所述ssDNA溶液用酸中和后，得到用作筛选的ssDNA随机文库。

按磁珠的使用说明书将KLK6蛋白(货号：RPA691Ra01，购买自钰博生物)以共价结合形式固定在甲苯磺酰基修饰的磁珠上，得到共价结合KLK6的甲苯磺酰基修饰的磁珠，以所述共价结合TPP1蛋白的甲苯磺酰基修饰的磁珠为靶目标进行KLK6蛋白核酸适配子的第1轮SELEX筛选：将所述共价结合KLK6蛋白的甲苯磺酰基修饰的磁珠与步骤(1)中所述用作筛选的ssDNA随机文库在37℃下孵育3小时，之后进行磁力分离，并用PBS缓冲液清洗磁珠3遍，加入150μL PBS缓冲液，在95℃水浴锅中静置12分钟，之后行磁力分离磁珠，获得100μL含有ssDNA的PBS溶液，将所述含有ssDNA的PBS溶液为模板，以上游引物(5，-TCAAGCATGAATTGCAGAATGAC-3，)和生物素修饰的下游引物(5，-biotin-TGCTTACTGGCTACTCACTTGCT-3，)进行PCR，并进行电泳检测，得到82bp的目标条带后切胶回收，再次进行ssDNA的制备，所述ssDNA的制备方法同步骤(1)中对目标条带进行胶回收之后的操作方法，得到第1轮SELEX筛选出的ssDNA文库；以所述第1轮SELEX筛选出的ssDNA文库为模板进行第2轮SELEX筛选。

之后每一轮SELEX筛选均按照所述步骤中第1轮SELEX筛选的方法进行，不同的是随着筛选的进行，PCR中引物的用量和热循环次数逐渐减少，具体的为：第1轮-第4轮引物用量l00pmol，热循环28次；第5轮～第8轮引物用量80pmol，热循环22次；第9轮～第14轮引物用量55pmol，热循环19次。其中，每隔4轮SELEX筛选，要进行1次反筛选，即使用未固定KLK6蛋白的甲苯磺酰基磁珠为靶目标，与前一轮SELEX筛选得到的ssDNA文库进行孵育，2小时后磁力分离去除磁珠，这样便可将与磁珠特异性结合的ssDNA除去，避免磁珠对筛选的影响。经过14轮的SELEX的筛选，KLK6蛋白与ssDNA的结合力不再升高，达到饱和状态，所以在第14轮筛选之后，终止SELEX筛选。

在得到第14轮SELEX筛选出的ssDNA之后，对所述第14轮SELEX筛选出的ssDNA进行PCR扩增，所有产物的条带都显示在82bp处，产物条带明亮清晰。使用pEASY-Tl克隆试剂盒将第14轮SELEX筛选出的ssDNA经PCR扩增的产物克隆至DH5a感受态细胞中，经过热激、孵育后，均勻的将其涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养12小时，菌株生长出，菌株菌落呈白色圆斑状，清晰明显，挑选其中的单个菌落，置于LB液体培养基中，37℃培育8小时，然后进行测序，最终得到本发明所述的一组KLK6蛋白核酸适配子的核苷酸序列，所述核苷酸序列为核苷酸序列表中SEQ ID No.1-SEQ ID No.16所述核苷酸序列之一，所述核酸适配子与KLK6蛋白具有高特异性和高亲和力。

实施例3蛋白结合适配子的性能测定

基于氧化石墨烯氧化具有吸附单链DNA的特性，构建了寡核苷酸适配子亲和性验证方法。将固定浓度的KLK6蛋白靶标(1μΜ)分别与与其对应一系列不同浓度(10，25，50，75，100，150，200uΜ)的候选寡核苷酸适配子进行孵育，总体积为300uL，37℃避光孵育2h，并以BB缓冲液代替靶标作为阴性对照组。孵育结合后加入最佳用量比的GO吸附未与靶标结合的适配子，离心操作后采用F-7000荧光光度计测定上清液490nm激发下520nm发射的荧光强度，实验设置三次平行重复，实验采用避光处理。以实验组相对阴性对照组的荧光强度作为纵坐标，以适配子浓度作为横坐标，采用GraphPad Prism 5.0软件进行非线性回归拟合计算适配子的解离常数Kd值。结果如下：

名称	解离常数Kd(单位nM)
		KLK6-1	8.7
KLK6-2	8.9
		KLK6-3	10.5
KLK6-4	11.3
		KLK6-5	12.5
KLK6-6	7.9
		KLK6-7	14.6
KLK6-8	16.7
		KLK6-9	15.0
KLK6-10	9.3
		KLK6-11	8.4
KLK6-12	10.0
		KLK6-13	11.4
KLK6-14	8.9
		KLK6-15	12.5
KLK6-16	13.4
		BB缓冲液空白对照	无结合能力

实施例3所述适配子特异性分析以及稳定性分析

分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，MUT蛋白，TPP1蛋白，与16条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与KLK6结合保持较高的特异性。

将所述的适配子，取0.5ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置四周。通过RT-PCR检测，发现三周的放置其结构稳定，没有被降解。

实施例4所述适配子疾病的诊断

将16个适配子分别与右半结肠癌、左半结肠癌、直肠癌患者各10例进行检测。

在酶标板孔中加入10个血清样品以及对照健康样本包被，并加入通过生物素标记的适配子16个，加入HRP标记的链酶亲和素，37℃孵育1.5小时；PBS洗三次后加入TMB进行显色5分钟；2M硫酸终止反应后酶标仪读数；进行检测，结果所示，与健康志愿者相比，右半结肠癌和直肠癌患者血清中TPP1蛋白的0D450均没有明显变化，左半结肠癌患者血清中KLK6蛋白的0D450均明显升高(p＝0.0022)。结果证明16个适配子在左半结肠癌诊断中具有应用前景。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

〈110〉郎秀玲

〈120〉一种用于左半结肠癌检测的试剂盒

〈160〉16

〈210〉1

〈211〉82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉KLK6-1

TCAAGCATGAATTGCAGAATGACACCTCCTAAAACATTGTAACACTTAAAATATACCTTAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA

〈210〉2

〈211〉 82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉KLK6-2

TCAAGCATGAATTGCAGAATGACAACTTACATCTAACACGTCTATCTCAAACCTTTTTAAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA

〈210〉3

〈211〉 82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉KLK6-3

TCAAGCATGAATTGCAGAATGACCAACTTTATATATTACTGTCTTCATTCATAATACCAAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA

〈210〉4

〈211〉 82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉KLK6-4

TCAAGCATGAATTGCAGAATGACTACCCTTTTACCACAATGATACTAATACCCATAAACAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA

〈210〉5

〈211〉 82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉KLK6-5

TCAAGCATGAATTGCAGAATGACATCCCACTACCTATAAAGTACTACTTCTCTTCTATTAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA

〈210〉6

〈211〉 82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉KLK6-6

TCAAGCATGAATTGCAGAATGACCCTACCACATACCATACAGCCCCTTTACTAATCCACAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA

〈210〉7

〈211〉 82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉KLK6-7

TCAAGCATGAATTGCAGAATGACACCCATTCTCTACACACCGTTTACATCCTCATTTACAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA

〈210〉8

〈211〉 82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉KLK6-8

TCAAGCATGAATTGCAGAATGACACATATATCTCAACTCTATGCCACTCTCTCAACTCTAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA

〈210〉9

〈211〉 82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉KLK6-9

TCAAGCATGAATTGCAGAATGACCTTCTTCAACTCAATATCGTTCCCTTAACTTATCCCAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA

〈210〉10

〈211〉 82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉KLK6-10

TCAAGCATGAATTGCAGAATGACATACCTCTATCTCACTTGTCCCTTTCCCTACAATCCAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA

〈210〉11

〈211〉 82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉KLK6-11

TCAAGCATGAATTGCAGAATGACTTCCCAACTTCAACCCGCACCCCCACCTATTAACACAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA

〈210〉12

〈211〉 82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉KLK6-12

TCAAGCATGAATTGCAGAATGACTATTCCTTTATACTATAGATTTTACCTATAAAATAAAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA

〈210〉13

〈211〉 82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉KLK6-13

TCAAGCATGAATTGCAGAATGACAACCTCACTATCGCACCCTCTATCTCTTAATAACCTAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA

〈210〉14

〈211〉 82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉KLK6-14

TCAAGCATGAATTGCAGAATGACTCATACCATTATCGAATCCCATACCATCCATAACCTAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA

〈210〉15

〈211〉 82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉KLK6-15

TCAAGCATGAATTGCAGAATGACCAAACAAACTTTGTTTACCCTTCACATCCCTATTCAAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA

〈210〉16

〈211〉 82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉KLK6-16

TCAAGCATGAATTGCAGAATGACACCATTAACTCTAGACACTTTCCCCCCCTCATCACAAGCAAGTGAGTAGCCAGTAAGCA

Claims (1)

1.能检测KLK6蛋白的适配子在制备用于左半结肠癌检测的试剂盒中的用途，所述适配子序列如SEQ ID No：6所述。