CN106520964A - 一种双识别microRNA的定量检测方法 - Google Patents

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CN106520964A CN201611033594.1A CN201611033594A CN106520964A CN 106520964 A CN106520964 A CN 106520964A CN 201611033594 A CN201611033594 A CN 201611033594A CN 106520964 A CN106520964 A CN 106520964A
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朱栋
胡玥
张小静
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection

Abstract

本发明公开了一种基于上转换荧光能量共振转移(UC‑LRET)技术并结合不同的杂交(hybridization)、连接(ligation)双识别过程，从而实现对microRNA单步、均相、高灵敏检测。主要应用于microRNA表达谱分析、microRNA临床诊断、microRNA研究检测及microRNA相关药物研究及筛选。本发明具有以下优点：(1)操作步骤少，属于“一步法”检测。(2)稳定性好，可以长时间保存，检测性能不下降。(3)由于在近红外区(980nm)激发，避免了背景荧光的产生。因此，具有很好的应用前景。

Description

一种双识别microRNA的定量检测方法
技术领域
本发明属于生物技术及临床医学诊断领域，涉及一种双识别检测microRNA的定量检测方法。基于上转换荧光能量共振转移(UC-LRET)技术并结合不同的杂交(hybridization)、连接(ligation)双识别检测，从而实现对microRNA单步、均相、高灵敏检测。主要应用于microRNA表达谱分析、microRNA临床诊断、microRNA研究检测及microRNA相关药物研究及筛选。
背景技术
microRNA(下文简称“miRNA”)是一类长度约为20-24个核苷酸(nt)的非编码RNA，它能调控超过一半的人类基因。[参见(a)D.P.Bartel，Cell，2009，136，215-233.(b)S.L.Ameres，M.D.Horwich，J.H.Hung，J.Xu，M.Ghildiyal，Z.Weng and P.D.Zamore，Science，2010，328，1534-1539.(c)Y.Chen，D.Y.Gao and L.Huang，Adv.Drug DeliveryRev.2015，81，128.(d)R.Devulapally，N.M.Sekar，T.V.Sekar，K.Foygel，T.F.Massoud，J.R.K.Willmann and R.Paulmurugan，ACS Nano，2015，9，2290.]相同的miRNA在不同的组织、器官和不同的细胞之间具有相似的调控功能，具有保守性。但不同组织器官、不同细胞以及细胞发育的不同阶段，其miRNA的表达谱并不相同，这一细胞及“时空”特异性使其可以作为某些组织器官、不同细胞以及细胞发育不同阶段的特异性分子标志。近年来，miRNA更是被认为是诊断及治疗某些疾病的新一代标志物及标靶。[参见(a)R.Ma，T.Jiang andX.Kang，J.Exp.Clin.Cancer Res.2012，31，38.(b)Y.Cao，R.A.DePinho，M.Ernst andK.Vousden，Nat.Rev.Cancer，2011，11，749.]miRNA已经成为近年来的研究热点，然而，由于miRNA具有的非常低浓度、易于降解、短链长度(18-24nt)以及很强的序列相似性这些特征使得灵敏、特异性检测miRNA变得非常困难。目前，微阵列芯片“杂交”(hybridization)及基于定量实时聚合酶链反应(PCR)技术是两种定量检测miRNA的最常见技术。[参见A.Git，H.Dvinge，M.Salmon-Divon，M.Osborne，C.Kutter，J.Hadfield，P.Bertone and C.Caldas，RNA，2010，16，991.]。然而，由序列多样性造成的miRNA熔点温度差异性使得hybridization为基础的技术很难应用于大规模的表达分析，而PCR为基础的技术又需要miRNA标记及互补DNA转化步骤等多个程序，使得检测miRNA耗时、耗力。[参见(a)Z.Gao，H.Deng，W.Shen andY.Ren，Anal.Chem.2013，85，1624-1630.(b)Y.Ren，H.Deng，W.Shen and Z.Gao，Anal.Chem.2013，85，4784-4789.]因此，发展快速、简单和灵敏的生物检测miRNA技术在生物研究和临床诊断上具有重要意义。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种基于上转换荧光能量共振转移(UC-LRET)技术的高灵敏检测miRNA的方法，它能够提供在生物环境下“无背景”均相检测，而且通过不同的杂交“hybridization”及融合“ligation steps”双识别步骤使得检测的专属性大大提高。
本发明是由信号产生单元和识别单元组成，上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)标记的寡核苷酸作为荧光的供体，而染料Cy3偶联的寡核苷酸作为荧光的接受体，供体-接受体共同组成了一对上转换荧光能量共振转移寡核苷酸对，作为信号产生单元；识别单元包括两段对目标miRNA具有特异性识别的序列。在近红外光激发下(980nm)，产生上转换荧光共振能量转移信号，能够实现对miRNA的高灵敏度、高选择性检测。
采用的技术方案：
一种用于定量检测miRNA的上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)标记的寡核苷酸(LRET-B)，其中所述的寡核苷酸序列从5’端开始为与识别单元互补配对的特异性序列、控制寡核苷酸长度的序列及3’端修饰C7氨基序列组成。
一种用于定量检测miRNA的染料分子Cy3标记的寡核苷酸(LRET-A)，其中所述的寡核苷酸序列从5’端开始标记有Cy3控制寡核苷酸长度的序列、与识别单元互补配对的特异性序列及3’端C6修饰。
一种用于定量检测miRNA的识别单元寡核苷酸(RD-REG-D)，其中所述的寡核苷酸序列从PO4修饰的5’端开始与目标miRNA互补配对的特异性序列、与寡核苷酸(LRET-B)互补配对的特异性序列及3’端组成。
一种用于定量检测miRNA的识别单元寡核苷酸(RA-REG-A)，其中所述的寡核苷酸序列从5’端开始与寡核苷酸(LRET-A)互补配对的特异性序列、与目标miRNA互补配对的特异性序列及修饰有-OH基团的3’端组成。
一种基于上转换荧光能量共振转移(UC-LRET)技术的高灵敏检测miRNA的方法，按以下步骤进行：
(1)、上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)标记寡核苷酸(LRET-B)：1～3ml浓度为0.2～2mg/ml羧基化的上转换纳米颗粒UCNPs溶液中添加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)2～6mg及1～4mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温下振荡60分钟，然后将50～150μL的0.5～2μM的寡核苷酸(LRET-B)溶液加入上述溶液中，在室温下反应12～24小时。反应完毕后，超滤离心，产物保存在含有0.1％牛血清蛋白BSA缓冲液中(pH7.4)。
(2)、基于双识别microRNA的定量检测：5～15nM上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)标记的寡核苷酸(LRET-B)、5～15nM染料分子Cy3标记的寡核苷酸(LRET-A)、5～15nM两种双识别单元寡核苷酸(RA-REG-A)、(RD-REG-D)、0.02～0.12CEU RNA连接酶以及一定浓度的目标miRNA混合在100μL miRNA缓冲液中，miRNA缓冲液组成为(25mM HEPES缓冲液，0.4mMATP，50mM NaCl，2mM MgCl2，100μg/ml single stranded salmon sperm DNA，pH7.4+0.1％BSA)。混合样品在20～40℃孵育60～120min，最后进行上转换荧光定量分析。激发光用980nm的激光光源激发，功率在0～3W间进行调节。
与现有的“微阵列杂交法”及“定量PCR扩增法”相比，本发明所提供的基于上转换荧光能量共振转移(UC-LRET)技术的高灵敏检测miRNA的方法具有以下优点：
(1)操作步骤少，属于“一步法”检测。而“微阵列杂交法”及“定量PCR扩增法”需要杂交反应、扩增及其染色及染色，分析步骤多，在此过程中容易出错。
(2)稳定性好，可以长时间保存，检测性能不下降。
(3)由于在近红外区(980nm)激发，避免了背景荧光的产生。
在完成发明的过程中，选择miRNA-21，miRNA-125a，miRNA-125b作为检测目标物，对所述的基于上转换荧光能量共振转移(UC-LRET)检测miRNAs的方法的各项性能指标进行了反复测试。结果表明，对于miRNAs检测的线性范围为200pM～1.4nM，七次测量重复性为3.9％，在对肿瘤细胞Hela提取液中miRNA-21的检测中，回收率为93-105％。
附图说明
图1为检测基于上转换荧光能量共振转移(UC-LRET)技术的高灵敏检测miRNAs示意图。
图2为上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)透射电镜图A和高分辨透射电镜图B；
图3(A)为测量miRNA-21的荧光光谱图及(B)线性关系曲线图。
具体实施方式
以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
下面结合附图，通过具体实施例对本发明进一步详述。
实施例1：上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)标记寡核苷酸(LRET-B)
实验材料：牛血清白蛋白，批号为140318，上海阿拉丁试剂有限公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，批号090M14531V，上海阿拉丁试剂有限公司；琥珀酰亚胺(NHS)，批号MKBG7914V，上海阿拉丁试剂有限公司；乙醇，批号为：14021710247，购自南京化学试剂有限公司。寡核苷酸序列(例如5’-TTGTGTTCCGATAGGCT-AAAAAAAA 3’ C7-NH2)从5’端开始为与识别单元互补配对的特异性序列、控制寡核苷酸长度的序列及3’端修饰C7氨基序列组成，其中TTGTGTTCCGATAGGCT为与识别单元互补配对的特异性序列，随检测的miRNA不同而改变。寡核苷酸序列为：
UC-LRET-B：5’ -TTGTGTTCCGATAGGCT-AAAAAAAA 3’ C7-NH2；
UC-LRET-A：Cy3-5’ AAAAAAAA-CGATCAGTCAGGCAA-3’ C6；
the adaptor oligos(for miRNA-21)：
3’ TCCCCAACACAAGGCTATCCGA-ATCGAATAGTCT-5’ -PO4
3’ OH-GACTACAACT-GCTAGTCAGTCCGTTTCGCC5’
(for miRNA-125a)：
3’ TCCCCAACACAAGGCTATCCGA-AGGGACTCTGGG-5’ -PO4
3’ OH-AAATTGGACACT-GCTAGTCAGTCCGTTTCGCC5’
(for miRNA-125b)：
3’ TCCCCAACACAAGGCTATCCGA-AGGGACTCTGGG-5’ -PO4
3’ OH-ATTGAACACT-GCTAGTCAGTCCGTTTCGCC5’
miRNA-125a：5’-UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA-3’
miRNA-125b：5’-UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-3’
miRNA-21：5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3
实验仪器及设备：KQ-500DE超声波清洗器、DHG-9143BS电热鼓风干燥箱、AY120电子分析天平、TGL-16C离心机。
实验过程：1ml浓度为1mg/ml羧基化的上转换纳米颗粒UCNPs溶液中添加2mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)及1mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温下振荡60分钟，然后将100μL的1μM的寡核苷酸(LRET-B)溶液加入上述溶液中，在室温下反应18小时。寡核苷酸序列(例如5’-TTGTGTTCCGATAGGCT-AAAAAAAA 3’C7-NH2)从5’端开始为与识别单元互补配对的特异性序列、控制寡核苷酸长度的序列及3’端修饰C7氨基序列组成，其中TTGTGTTCCGATAGGCT为与识别单元互补配对的特异性序列。反应完毕后，超滤离心，产物保存在含有0.1％牛血清蛋白BSA缓冲液中(pH7.4)。把标记后的上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)进行透射电镜及高分辨透射电镜检测。如图2所示。
实施例2：基于双识别microRNAs的定量检测miRNA-21
实验材料：乙醇，批号为：14021710247，购自南京化学试剂有限公司。HEPES缓冲液，批号为：E607018，购自上海生工生物试剂有限公司；5′三磷酸腺苷二钠盐三水(ATP)，批号为：A600020，购自上海生工生物试剂有限公司；single stranded salmon sperm DNA，批号为：C640031，购自上海生工生物试剂有限公司；RNA连接酶，批号为：B101801，购自上海生工生物试剂有限公司。
寡核苷酸序列为：
UC-LRET-B：5’-TTGTGTTCCGATAGGCT-AAAAAAAA 3’ C7-NH2；
UC-LRET-A：Cy3-5’ AAAAAAAA-CGATCAGTCAGGCAA-3’ C6；
the adaptor oligos(for miRNA-21)：
(RD-REG-A)：3’ TCCCCAACACAAGGCTATCCGA-ATCGAATAGTCT-5’ -PO4
(RD-REG-D)：3’ OH-GACTACAACT-GCTAGTCAGTCCGTTTCGCC5’
miRNA-21：5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3
实验仪器及设备：KQ-500DE超声波清洗器、DHG-9143BS电热鼓风干燥箱、AY120电子分析天平、TGL-16C离心机。
实验过程：5nM上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)标记的寡核苷酸(LRET-B)、5nM染料分子Cy3标记的寡核苷酸(LRET-A)、5nM两种双识别单元寡核苷酸(RA-REG-A)、(RD-REG-D)、0.10CEU RNA连接酶以及一定浓度的目标miRNA-21混合在100μL miRNA缓冲液中，miRNA缓冲液组成为(25mM HEPES缓冲液，0.4mM ATP，50mM NaCl，2mM MgCl2，100μg/ml singlestranded salmon sperm DNA，pH7.4+0.1％BSA)。混合样品在25℃孵育90min，最后进行上转换荧光定量分析。激发光用980nm的激光光源激发，功率在0～3W间进行调节。(测得的上转换荧光光谱图及校准曲线图如图3所示)
实施例3：基于双识别microRNAs的定量检测miRNA-125a
实验材料：乙醇，批号为：14021710247，购自南京化学试剂有限公司。HEPES缓冲液，批号为：E607018，购自上海生工生物试剂有限公司；5′-三磷酸腺苷二钠盐三水(ATP)，批号为：A600020，购自上海生工生物试剂有限公司；single stranded salmon sperm DNA，批号为：C640031，购自上海生工生物试剂有限公司；RNA连接酶，批号为：B101801，购自上海生工生物试剂有限公司；
寡核苷酸序列为：
UC-LRET-B：5’-TTGTGTTCCGATAGGCT-AAAAAAAA 3’ C7-NH2；
UC-LRET-A：Cy3-5’ AAAAAAAA-CGATCAGTCAGGCAA-3’ C6；
the adaptor oligos(for miRNA-125a)：
(RD-REG-A)：3’ TCCCCAACACAAGGCTATCCGA-AGGGACTCTGGG-5’ -PO4
(RD-REG-D)：3’ OH-AAATTGGACACT-GCTAGTCAGTCCGTTTCGCC 5’
miRNA-125a：5’-UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA-3
实验仪器及设备：KQ-500DE超声波清洗器、DHG-9143BS电热鼓风干燥箱、AY120电子分析天平、TGL-16C离心机。
实验过程：5nM上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)标记的寡核苷酸(LRET-B)、5nM染料分子Cy3标记的寡核苷酸(LRET-A)、5nM两种双识别单元寡核苷酸(RA-REG-A)、(RD-REG-D)、0.10CEU RNA连接酶以及一定浓度的目标miRNA-125a混合在100μL miRNA缓冲液中，miRNA缓冲液组成为(25mM HEPES缓冲液，0.4mM ATP，50mM NaCl，2mM MgCl2，100μg/mlsingle stranded salmon sperm DNA，pH7.4+0.1％BSA)。混合样品在25℃孵育90min，最后进行上转换荧光定量分析。激发光用980nm的激光光源激发，功率在0～3W间进行调节。
实施例4：基于双识别microRNAs的定量检测miRNA-125b
实验材料：乙醇，批号为：14021710247，购自南京化学试剂有限公司。HEPES缓冲液，批号为：E607018，购自上海生工生物试剂有限公司；5′-三磷酸腺苷二钠盐三水(ATP)，批号为：A600020，购自上海生工生物试剂有限公司；single stranded salmon sperm DNA，批号为：C640031，购自上海生工生物试剂有限公司；RNA连接酶，批号为：B101801，购自上海生工生物试剂有限公司；
寡核苷酸序列为：
UC-LRET-B：5’-TTGTGTTCCGATAGGCT-AAAAAAAA 3’ C7-NH2；
UC-LRET-A：Cy3-5’ AAAAAAAA-CGATCAGTCAGGCAA-3’ C6；
the adaptor oligos(for miRNA-125b)：
(RD-REG-A)：3’ TCCCCAACACAAGGCTATCCGA-AGGGACTCTGGG-5’ -PO4
(RD-REG-D)：3’ OH-ATTGAACACT-GCTAGTCAGTCCGTTTCGCC5’
miRNA-125b：5’-UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-3’
实验仪器及设备：KQ-500DE超声波清洗器、DHG-9143BS电热鼓风干燥箱、AY120电子分析天平、TGL-16C离心机。
实验过程：8nM上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)标记的寡核苷酸(LRET-B)、8nM染料分子Cy3标记的寡核苷酸(LRET-A)、8nM两种双识别单元寡核苷酸(RA-REG-A)、(RD-REG-D)、0.10CEU RNA连接酶以及一定浓度的目标miRNA-125b混合在100μL miRNA缓冲液中，miRNA缓冲液组成为(25mM HEPES缓冲液，0.4mM ATP，50mM NaCl，2mM MgCl2，100μg/mlsingle stranded salmon sperm DNA，pH7.4+0.1％BSA)。混合样品在30℃孵育90min，最后进行上转换荧光定量分析。激发光用980nm的激光光源激发，功率在0～3W间进行调节。
得到的定量关系图如图3所示。结果表明，对于miRNAs检测的线性范围为0.2pM～1.4nM，7次测量重复性为3.9％。
以上实施例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，木发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代和改进等，其均应在本发明请求保护的技术方案范围之内。

Claims (2)

1.一种双识别检测microRNA的定量检测方法，其特征在于按以下步骤进行：
(1)、上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)标记寡核苷酸(LRET-B)：1～3ml浓度为0.2～2mg/ml羧基化的上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)溶液中添加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)2～6mg及1～4mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温下振荡60分钟，然后将50～150μL的0.5～2μM的寡核苷酸(LRET-B)溶液加入上述溶液中，在室温下反应12～24小时。反应完毕后，超滤离心，产物保存在含有0.1％牛血清蛋白BSA缓冲液中(pH7.4)。
(2)、基于双识别microRNA的定量检测：5～15nM上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)标记的寡核苷酸(LRET-B)、5～15nM染料分子Cy3标记的寡核苷酸(LRET-A)、5～15nM两种双识别单元寡核苷酸(RA-REG-A)、(RD-REG-D)、0.02～0.12CEU RNA连接酶以及一定浓度的目标miRNA混合在100μL miRNA缓冲液中，miRNA缓冲液组成为(25mM HEPES缓冲液，0.4mM ATP，50mM NaCl，2mM MgCl2，100μg/ml single stranded salmon sperm DNA，pH7.4+0.1％BSA)。混合样品在20～40℃孵育60～120min，最后进行上转换荧光定量分析。
2.根据权利要求1所述的一种双识别检测microRNA的定量检测方法，其特征在于：
(1)与上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)标记的寡核苷酸(LRET-B)，其序列为5’-TTGTGTTCCGATAGGCT-AAAAAAAA3’C7-NH2，其中3’端C7-NH2修饰，所述序列如SEQ ID NO：1所示。
(2)染料分子Cy3标记的寡核苷酸(LRET-A)，其序列为Cy3-5’AAAAAAAA-CGATCAGTCAGGCAA-3’C6，其中5’端Cy3修饰，3’端C6修饰，所述序列如SEQ ID NO：2所示。
(3)双识别单元寡核苷酸(RA-REG-A)，其序列为：
用以检测miRNA-21：5’PO4-TCTGATAAGCTA-AGCCTATCGGAACACAACCCCT-3’，其中5’端PO4修饰，所述序列如SEQ ID NO：3所示。
用以检测miRNA-125a：5’PO4-GGGTCTCAGGGA-AGCCTATCGGAACACAACCCCT-3’，其中5’端PO4修饰，所述序列如SEQ ID NO：4所示。
用以检测miRNA-125b：5’PO4-GGGTCTCAGGGA-AGCCTATCGGAACACAACCCCT-3’；其中5’端PO4修饰，所述序列如SEQ ID NO：5所示。
(4)双识别单元寡核苷酸(RA-REG-D)，其序列为：
用以检测miRNA-21：5’-CCGCTTTGCCTGACTGATCG-TCAACATCAG-OH3’；其中3’端OH修饰，所述序列如SEQ ID NO：6所示。
用以检测miRNA-125a：5’-CCGCTTTGCCTGACTGATCG-TCACAGGTTAAA-OH3’；其中3’端OH修饰，所述序列如SEQ ID NO：7所示。
用以检测miRNA-125b：5’-CCGCTTTGCCTGACTGATCG-TCACAAGTTA-OH3’；其中3’端OH修饰，所述序列如SEQ ID NO：8所示。
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