CN106520865A - 一种链霉素的生物发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种链霉素的生物发酵新方法，包括在发酵过程中菌体浓度达到50％v/v时，停止改变动力条件，通过补水的方式来控制溶氧，以及在发酵后期加入CaCl₂，使链霉素的效价提高50％以上。本发明的方法，在不改变最佳培养基浓度和配比的前提下，仍然能够继续维持最佳溶氧浓度，而不增加动力负荷。同时通过加入CaCl₂，使产品的效价在发酵后期得到了进一步的提高。本发明方法可操作性强，稳定性良好，总体效价提高了50％‑60％，在后续提取中分离效率高，有显著地工业应用效益。

Description

一种链霉素的生物发酵方法

技术领域

本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种链霉素的生物发酵方法。

背景技术

链霉素是一种氨基糖苷类抗生素,1943年美国S.A.瓦克斯曼从灰色链霉菌属中首次析离得到，能有效地抵抗许多细菌。链霉素是由灰色链霉菌通过菌丝体发酵而产生的，链霉素发酵产业发展到今天已经有了相当长的历史，是继青霉素后第二个生产并用于临床的抗生素，链霉素的作用机理在于抑制细菌蛋白质的组装和合成从而呈现杀菌作用，具体作用点是细胞的核糖体，数十年来它是抗结核治疗中的首选用药，其抗结核杆菌的特效作用，开创了结核病治疗的新纪元。

链霉素的获得主要是通过对灰色链霉菌的发酵培养，灰色链霉菌从培养基获得足够的营养组分和能量来合成链霉素，在获得培养基的营养的同时，需要提供给灰色链霉菌良好的发酵条件，所以包括溶氧、pH、温度等发酵环境条件在内的控制尤为重要，作为一种高度需氧菌，物质代谢与能量代谢在发酵过程中是相辅相成的，灰色链霉菌在整个代谢过程中以葡萄糖作为主要碳源，只有以氧作为最终电子受体时才能获得大量能量，来满足菌体生长、繁殖和大量合成链霉素的需要，氧气在发酵液中的溶解度较低，而链霉素发酵过程中摄氧率较高，因此提高发酵液中的溶氧对链霉素发酵过程至为重要，溶氧可以从供应量和溶解量两个方面入手。

在现有的发酵技术中，发酵前期通过调节包括培养基浓度、搅拌、通气量和罐压等在内的条件来维持灰色链霉菌对溶氧的需求，当搅拌、通气量等动力条件提满至设备要求限度后，往往对发酵液中溶氧的进一步提高没有更好地办法，而是在较低溶氧下继续发酵，直至发酵液中的链霉素效价开始出现下降作为发酵结束。

发明内容

在现有技术中，调整培养基的浓度会使发酵的迟缓期加长，从而发酵周期变长，成本大大提高，发酵中后期动力条件提满至设备要求限度后无法继续维持发酵液中的最佳溶氧，严重影响了产品效价的进一步提高，放罐体积减小，发酵指数较低。而且在发酵中后期较低的溶氧条件下，菌体易衰老，菌丝体出现自溶而死亡。本发明发明人发现通过在发酵中后期继续维持最佳溶氧和提高磷酸酯酶活力的方式，来延缓菌丝体衰老自溶，提高链霉素产品的效价。

因此，本发明的第一目的在于提供一种链霉素的生物发酵方法，所述方法包括使用灰色链霉菌发酵生产链霉素的过程，其中当发酵过程中菌体浓度达到50％v/v时，停止改变动力条件；当发酵液中溶解氧下降至30％以后，通过补水的方式来控制溶氧。

即本发明的方法，可以在灰色链霉菌发酵生产链霉素的发酵过程中后期，待菌体浓度达到一定程度之后，动力输出已经达到了设备的要求上限，无法继续通过调节动力条件，使得溶解氧进一步提高；而发明人意外发现，通过向发酵液中补水的方式，可以使得溶解氧继续提高，从而解决了动力输送的瓶颈，并降低了生产动力输出的成本。

优选地，在本发明链霉素的生物发酵方法中，所述补水的速率为发酵罐装液体积的1％(V/V)/h～1.5％(V/V)/h，可以将溶氧控制在30％-50％。

优选地，本发明链霉素的生物发酵方法中，在链霉素的发酵过程之前还包括灰色链霉菌种子液的培养过程；更优选地，在链霉素的发酵过程之前，还包括如在平板分离获得单孢子、将灰色链霉菌单孢子进行摇瓶培养，以及在种子罐中发酵获得种子液的过程。

最优选地，所述分离获得单孢子的培养基的组成(g/L)：葡萄糖10g、蛋白胨3.5g、氯化钠5g、豌豆粉30g、琼脂25g；所述摇瓶培养的培养基的组成(g/L)：葡萄糖30g、低温黄豆饼粉25g、硫酸铵4g、碳酸钙5g、硫酸二氢钾0.4g、氯化钠2g；所述种子液的培养基组成(g/L)：葡萄糖40g、低温黄豆饼粉30g、硫酸铵7g、碳酸钙7g、磷酸二氢钾0.6g、玉米浆3ml。

平板培养、摇瓶培养以及种子罐的发酵可以采用本领域常规方法进行，优选地，平板培养条件为：通过稀释涂布平板法获得单菌落，从甘油管保藏的菌株出发，稀释10000倍(10-4的稀释液)，涂布平板，培养箱温度设定在27℃，湿度不大于50％，培养7天，获得丰满白色的梅花状单菌落孢子。

摇瓶培养的条件为选取边缘齐整的梅花状中型单菌落孢子，在无菌条件下用接种针接种于摇瓶中，然后在27℃的恒温摇瓶间内振荡培养68h，摇床转速为220-240rpm，摇瓶间湿度不大于50％。最终获得pH大于7.5，菌体浓度大于15％v/v的种子液

种子液的培养条件为温度27℃，罐压0.03MPa，pH自然，起始搅拌为0，通气量为1:0.8VVM。当溶氧低于30％时提高搅拌速度，每次提50rpm。培养48h，获得菌体浓度大于20％v/v的种子液。

优选地，在本发明链霉素的生物发酵方法中，所述发酵过程中的动力条件包括罐压、搅拌速度与通气量。

更优选地，在本发明链霉素的生物发酵方法中，所述发酵过程中的初始动力条件为罐压0.03MPa，起始搅拌为200转/分，通气量为1:0.5VVM。

更优选地，在本发明链霉素的生物发酵方法中，在所述发酵过程开始时，溶氧逐渐下降，当溶氧低于30％时开始提高动力条件，所述提高动力条件包括提高搅拌转速、通气量和罐压。

更优选地，在本发明链霉素的生物发酵方法中，还包括在所述发酵过程中补料的过程；最优选地，在本发明链霉素的生物发酵方法中，所述补料过程为用氨水控制，通过补葡萄糖将发酵液糖浓度控制在3％(W/V)左右，放罐残糖控制在0.8％(W/V)以下，通过补硫酸铵将氨基氮控制在800mg/L。

更优选地，在本发明链霉素的生物发酵方法中，还包括在所述发酵进行到120小时左右，菌体浓度在60％v/v时，补入发酵罐装液体积的0.2％(W/V)的氯化钙。

发明人意外发现，当发酵进行到120小时左右，菌体浓度在60％v/v时，通过加入CaCl₂，通过镜检发现，加入适当浓度的CaCl₂后，使得菌丝呈网状，菌丝顶端有球形孢子，这延缓了菌体自溶，促进了链霉素的生物合成，使产品的效价在发酵后期得到了进一步的提高。

优选地，随着发酵的继续进行，当镜检出现少量菌丝自溶，不呈网状，游离孢子及断片增多，此现象大约出现在发酵进行到170h之后，此时发酵单位增长缓慢，pH也会有上升趋势，停止补糖，取样检测残糖降到0.8％以下时可认为是发酵终点，可进行放罐处理，整个发酵周期在180h左右。

在本发明的链霉素的生物发酵方法，发明人意外地发现如下现象：

1)发酵开始后，溶氧逐渐下降，可适当提高包括搅拌转速、流量和罐压在内的动力条件，当进行到发酵中期菌体浓度达到50％v/v后，通常会使得动力输出设备达到输出功率瓶颈，这时难以继续加大动力负荷。

2)当停止加大动力条件后，采取补水的方式可增加氧气的溶解量，满足菌体生长和链霉素合成所需要的溶氧，补水速率控制为1-1.5％(V/V)/h。

3)当发酵进行到120h左右时，通过加入CaCl₂可以延缓了菌体自溶，促进了链霉素的生物合成，加入量为发酵罐装液体积的0.2％(W/V)。

而通过上述意外发现，本发明至少有以下优点：

1.本发明的实施，在不改变最佳培养基浓度和配比的前提下，满足发酵中后期由于菌丝体大量生长和产物合成对溶氧的大量需求，通过补水的方式，仍然能够继续维持最佳溶氧浓度，而不是采用继续增加动力负荷的方式，这样既满足了溶氧需求，提高了效价，又降低了动力成本。

2.通过加入CaCl₂，意外地发现延缓了菌体自溶，促进了链霉素的生物合成，使产品的效价在发酵后期得到了进一步的提高。

3.通过发酵中后期补水的方式所获得的发酵液，在后续提取使用板框进行固液分离时阻力较小，分离效率高，利于提取操作。

总之，通过后续实施例所示的溶氧控制方式和补CaCl₂操作，链霉素产品的发酵效价通过补水方法，使得效价由8000u/ml提高到了11000u/ml、补加CaCl₂后使得效价由11000u/ml提高到13000u/ml，总体效价提高了50％-60％。本发明方法可操作性强，稳定性良好。

附图说明

图1为本发明一个实施例的发酵过程的示意图。

具体实施方式

在本发明的一个实施例中，提供了一种链霉素的生物发酵方法，包括使用灰色链霉菌发酵生产链霉素的步骤，其中当发酵过程中菌体浓度达到50％v/v时，停止改变动力条件；当发酵液中溶解氧下降至30％以后，通过补水的方式来控制溶氧。

在本发明的另一个实施例中，所述补水的速率为发酵罐装液体积的1％(V/V)/h～1.5％(V/V)/h，可以将溶氧控制在30％-50％。

在本发明的另一个实施例中，在链霉素的发酵过程之前还包括灰色链霉菌种子液的培养过程；在本发明的再一个实施例中，在链霉素的发酵过程之前，还包括如在平板分离获得单孢子、将灰色链霉菌单孢子进行摇瓶培养，以及在种子罐中发酵获得种子液的过程。

在本发明中，对链霉素的发酵菌种没有特别的要求，只要其属于灰色链霉菌(Streptomyces griseus)，能够发酵产生链霉素即可，在本发明的一个实施例中，所述链霉素的发酵菌种购自山东鲁抗医药股份有限公司。

在本发明的另一个实施例中，所述分离获得灰色链霉菌单孢子的培养基的组成(g/L)：葡萄糖10g、蛋白胨3.5g、氯化钠5g、豌豆粉30g、琼脂25g；所述摇瓶培养的培养基的组成(g/L)：葡萄糖30g、低温黄豆饼粉25g、硫酸铵4g、碳酸钙5g、硫酸二氢钾0.4g、氯化钠2g；所述种子液的培养基组成(g/L)：葡萄糖40g、低温黄豆饼粉30g、硫酸铵7g、碳酸钙7g、磷酸二氢钾0.6g、玉米浆3ml。

平板培养、摇瓶培养以及种子罐的发酵可以采用本领域常规方法进行，优选地，平板培养条件为：通过稀释涂布平板法获得单菌落，从甘油管保藏的菌株出发，稀释10000倍(10-4的稀释液)，涂布平板，培养箱温度设定在27℃，湿度不大于50％，培养7天，获得丰满白色的梅花状单菌落孢子。

摇瓶培养的条件为选取边缘齐整的梅花状中型单菌落孢子，在无菌条件下用接种针接种于摇瓶中，然后在27℃的恒温摇瓶间内振荡培养68h，摇床转速为220-240rpm，摇瓶间湿度不大于50％。最终获得pH大于7.5，菌体浓度大于15％v/v的种子液

种子液的培养条件为温度27℃，罐压0.03MPa，pH自然，起始搅拌为0，通气量为1:0.8VVM。当溶氧低于30％时提高搅拌速度，每次提50rpm。培养48h，获得菌体浓度大于20％v/v的种子液。

在本发明的另一个实施例中，所述发酵过程中的动力条件包括罐压、搅拌速度与通气量。在本发明的再一个实施例中，在本发明链霉素的生物发酵方法中，所述发酵过程中的初始动力条件为罐压0.03MPa，起始搅拌为200转/分，通气量为1:0.5VVM。

在本发明的另一个实施例中，在所述发酵过程开始时，溶氧逐渐下降，当溶氧低于30％时开始提高动力条件，所述提高动力条件包括提高搅拌转速、通气量和罐压。

在本发明的另一个实施例中，还包括在所述发酵过程中补料的过程；在本发明的再一个实施例中，所述补料过程为用氨水控制，通过补葡萄糖将发酵液糖浓度控制在3％(W/V)左右，放罐残糖控制在0.8％(W/V)以下，通过补硫酸铵将氨基氮控制在800mg/L。

在本发明的另一个实施例中，还包括在所述发酵进行到120小时左右，菌体浓度在60％v/v时，补入发酵罐装液体积的0.2％(W/V)的氯化钙。

以下通过具体实施例进一步对本发明的技术方案进行说明，应理解以下仅为本发明的示例性说明，并不用于限制本发明权利要求的保护范围。

实施例1链霉素发酵补水控制溶氧实验及补CaCl₂实验

(1)平板分离获得单孢子

培养基的组成(g/L)：葡萄糖10g、蛋白胨3.5g、氯化钠5g、豌豆粉30g、琼脂25g。

操作步骤：通过稀释涂布平板法获得单菌落，从甘油管保藏的菌株(灰色链霉菌购自山东鲁抗医药股份有限公司)出发，稀释10000倍(10^-4的稀释液)，涂布平板，培养箱温度设定在27℃，湿度不大于50％，培养7天，获得丰满白色的梅花状单菌落孢子。

(2)摇瓶种子培养

培养基的组成(g/L)：葡萄糖30g、低温黄豆饼粉25g、硫酸铵4g、碳酸钙5g、硫酸二氢钾0.4g、氯化钠2g。

培养基的制备：先用蒸馏水溶解无机盐类，然后边搅拌边加入黄豆饼粉、碳酸钙和葡萄糖，搅拌均匀，pH自然，115℃灭菌30min。

种子培养：选取边缘齐整的梅花状中型单菌落孢子，在无菌条件下用接种针接种于摇瓶中，然后在27℃的恒温摇瓶床内振荡培养68h，摇床转速为220rpm-240rpm，摇瓶间湿度不大于50％。最终获得pH大于7.5，菌体浓度大于15的种子液。

(3)种子罐培养

培养基组成(g/L)：葡萄糖40g、低温黄豆饼粉30g、硫酸铵7g、碳酸钙7g、磷酸二氢钾0.6g、玉米浆3ml。

培养条件：温度27℃，罐压0.03MPa，pH自然，起始搅拌为0，通气量为1:0.8VVM。当溶氧低于30％时提搅拌，每次提50rpm。培养48h，获得菌体浓度大于20的种子液。

(4)发酵培养

基础培养基组成(g/L)：葡萄糖50g、低温黄豆饼粉24g、硫酸铵4.5g、碳酸钙3g、磷酸二氢钾0.84g、玉米浆5ml。

补料培养基：50％葡萄糖、30％硫酸铵、工业无菌氨水

起始条件：温度27℃，罐压0.03MPa，pH自控7.0，起始搅拌为200，通气量为1:0.5VVM。

发酵前种子培养过程：见图1所示，通过步骤1)平板分离获得单孢子，实现菌种(菌株)分离，然后接入摇瓶中，通过步骤2)获得菌体浓度大于15的种子液；在种子罐中，通过步骤3获得菌体浓度大于20的种子液，转入发酵罐中进行链霉素的发酵过程。

发酵过程：具体见图1所示，分为发酵、动力调整、补水过程、加入氯化钙、以及放罐过程。具体如下：

a.发酵开始后，溶氧逐渐下降，当低于30％时开始提动力条件，包括搅拌转速、流量和罐压，先提搅拌，每次提50rpm，搅拌提高满额后再提流量，从1:0.5VVM提至1:0.8VVM，控制罐压不超过0.08MPa。

b.当菌浓达到50％后，为了控制动力成本，不再进行提高动力条件，但是随着菌体生长和链霉素的产生对溶氧的需求会继续增加，溶解氧浓度会继续下降，当下降至30％以下后，采取补水的方式来控制溶氧高于30％，蒸馏水提前121℃下灭菌30min，补水速率为发酵罐装液体积的1-1.5％(V/V)/h，将溶氧控制在30％-50％。

c.发酵过程中，每8h取一次无菌样和生化样，测pH、糖浓和氨基氮浓度。取完样后，及时用少量蒸汽灭菌取样管。发酵过程控制pH在7.0，用氨水控制，通过补葡萄糖将糖浓度控制在3％左右，放罐残糖控制在0.8％以下。通过补硫酸铵将氨基氮控制在800mg/L。

d.在发酵进行到第120h左右时，一次性补入发酵罐装液体积的0.2％(W/V)的氯化钙，此时菌体浓度大约在60％左右，镜检菌丝呈网状，菌丝顶端有球形孢子，链霉素分泌增多。

e.随着发酵的继续进行，当镜检出现少量菌丝自溶，不呈网状，游离孢子及断片增多，此现象大约出现在发酵进行到170h之后，此时发酵单位增长缓慢，pH也会有上升趋势，停止补糖，取样检测残糖降到0.8％以下时可认为是发酵终点，可进行放罐处理，整个发酵周期在180h左右。

链霉素产品的发酵效价的检测：

采用分光光度法，利用链霉素特有的麦芽酚反应进行检测。首先将发酵液进行适当的稀释，取15ml置于离心管中，加入草酸酸化，酸化至pH＝3左右，于水浴锅中75℃保温10分钟，冷却至室温，于离心机中5000rpm离心20min，准备两支干净的试管，分别吸取5ml离心后的上清液置于试管中，向其中一支试管加入1滴4％盐酸羟胺作为空白对照，再向两支试管中分别加入1ml氢氧化钠溶液(2mol/L)，振荡摇匀，于水浴锅中85℃保温15分钟，冷却至室温，再加入1％硫酸铁铵2ml，振荡摇匀，静置10min，在分光光度计中设定520nm波长下测定吸光度。以链霉素标准品绘制标准曲线，计算发酵液链霉素的效价。

分别检测依照上述实施例方法制备的发酵液链霉素的效价、与不补水、不补加CaCl₂操作方法制备的发酵液链霉素的对照例进行比较发现：通过补水溶氧控制方式和补CaCl₂操作，链霉素产品的发酵效价通过补水方法，使得效价由8000u/ml提高到了11000u/ml、补加CaCl₂后使得效价由11000u/ml提高到13000u/ml，总体效价提高了50％-60％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种链霉素的生物发酵方法，包括使用灰色链霉菌发酵生产链霉素的过程，其特征在于，当发酵过程中菌体浓度达到50％v/v时，停止改变动力条件；当发酵液中溶解氧下降至30％以后，通过补水的方式来控制溶氧。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述补水的速率为发酵罐装液体积的1％(V/V)/h～1.5％(V/V)/h，将溶氧控制在30％-50％。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵过程之前还包括灰色链霉菌种子液的培养过程。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中的动力条件包括罐压、搅拌速度与通气量。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中的初始动力条件为罐压0.03MPa，起始搅拌为200转/分，通气量为1:0.5VVM。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述发酵过程开始时，溶氧逐渐下降，当溶氧低于30％时开始提高动力条件，所述提高动力条件包括提高搅拌转速、通气量和罐压。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括在所述发酵过程中补料的过程。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述补料过程为用氨水控制，通过补葡萄糖将发酵液糖浓度控制在3％(W/V)左右，放罐残糖控制在0.8％(W/V)以下，通过补硫酸铵将氨基氮控制在800mg/L。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括在所述发酵进行到120小时左右，补入发酵罐装液体积的0.2％(W/V)的氯化钙。

10.根据权利要求1-9任意一项所述的方法，其特征在于，所述发酵进行到170h之后，镜检出现少量菌丝自溶，发酵单位增长缓慢，取样检测残糖降到0.8％(W/V)以下时可认为是发酵终点。