CN106520813A - 一种预防日本血吸虫病免疫疫苗的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种预防日本血吸虫病免疫疫苗的合成方法，将日本血吸虫SJFCA基因通过PCR技术扩增出来，然后用表达载体pET‑28a(+)与目的基因进行连接，对基因亚克隆，并且在大肠杆菌BL21(DE3)中对连接成功的片段进行诱导表达；对表达的重组蛋白SJFCA/His进行纯化，运用Western blot（蛋白质印迹法）的技术方法检测重组蛋白的免疫原性。结果显示它能被小鼠免疫血清识别，具有良好的免疫原性。本发明是诱导产生细胞毒性T细胞应答的方法之一；稳定性好，大量的变异可能性小，易于质量监控；生产成本较低；可以通过多种质粒的混合物或者构建复杂的质粒来实现多价疫苗。

Description

一种预防日本血吸虫病免疫疫苗的合成方法
技术领域
本发明属于生物制品的合成制备领域，具体涉及一种预防日本血吸虫病免疫疫苗的合成方法。
背景技术
日本血吸虫（Schistosoma japonicum）也叫日本分体吸虫，寄生在动物门静脉***的小血管内，例如：人、某些野生哺乳动物、牛、羊等。除人体外，还有40多种家畜和野生动物自然感染日本血吸虫病，黄牛是所有动物之中感染率最高的，水牛第二。
防治血吸虫病的工作比较复杂，因为外界环境与血吸虫病的发生息息相关，目前主要以流行病学为基础，实施综合防治措施相结合的方法，来有效控制或消灭血吸虫病。该病的综合防治措施主要包括:(1)控制传染源：采取一定措施让患血吸虫病的人和家畜很少或者不排出虫卵。目前主要措施为通过药物治疗病人病畜，捕杀患病野生动物。(2)加强对***物的管理以及杀卵。目前对粪便的处理常采用粪尿合贮、发酵、建造分隔粪池等方法。(3)中间宿主钉螺的消灭。目前主要有物理方法和化学方法来杀死钉螺。（4）防止感染。日本血吸虫的终末宿主有40多种哺乳动物，目前采取的主要措施为提供安全用水、杀灭尾蚴、研制血吸虫疫苗等。
目前，血吸虫病防治仍以药物治疗为主。至今,防治血吸虫病基本药物包括治疗性药物吡喹酮、硝硫氰胺和敌百虫,预防性药物蒿甲醚和青蒿琥酯。中药成分青蒿素及其衍生物也具有抗日本血吸虫的作用等。虽然药物的治疗具有成本低廉、效果显著的特征，但是，某些药物因受到宿主的代谢机制及药理毒理限制而影响其疗效，长期使用某一药物会导致对药物敏感性下降的虫株出现。此外，治疗的药物多少都存在毒副作用，长期使用会影响人畜的健康，而某些药物的疗效受代谢机制和作用机制的影响，会使疗效降低甚至不发挥作用，需使用联合用药才能发挥药效。除此之外，虽然药物治疗能够降低感染率和发病率，但对宿主肝脏形成的肉芽肿并没有作用，再次接触病原后会发生重复感染，这就需要重复的治疗。因此，发展血吸虫疫苗是综合防治血吸虫病的一项具有前瞻性的工作。
流行病学的研究表明，人体对血吸虫再次感染具有一定的免疫性保护能力[18]。基因工程疫苗已成为当今我国研究血吸虫病疫苗的主流方向[19]。同时，混合疫苗、多价抗原融合疫苗的构建及其与佐剂的联合使用[20]，新的血吸虫疫苗候选分子的筛选鉴定，及其与不同佐剂的配伍和优化，对疫苗免疫保护效果的提高提供了新思路。
发明内容
本发明的目的在于提供一种预防日本血吸虫病免疫疫苗的合成方法。
基于上述目的，本发明采取了如下技术方案：
将日本血吸虫SJFCA基因通过PCR技术扩增出来，然后用表达载体pET-28a(+)与目的基因进行连接，对基因亚克隆，并且在大肠杆菌BL21(DE3)中对连接成功的片段，进行诱导表达。对表达的重组蛋白SJFCA/His进行纯化，运用Western blot的技术方法检测重组蛋白的免疫原性。结果显示它能能被小鼠免疫血清识别，具有良好的免疫原性。
上述的日本血吸虫SJFCA基因克隆，主要是引物的设计与合成，根据GenBank上收录的日本血吸虫SJFCA2593.002|FSA001-P00010-C21核苷酸序，设计PCR引物。
上述的一种重组质粒pET-28a(+)-SJFCA的构建与鉴定，其特征在于重组质粒的提取，用限制性内切酶BamHⅠ、SacⅠ将提取的重组T载体质粒及pET-28a(+)空载体双酶切；
上所述的重组蛋白rSJFCA的制备，其特征在于根据SDS-PAGE鉴定结果分析重组蛋白表达形式，采用HisBind Resin树脂柱层析,分离纯化目的蛋白；
上述的Western-blot检测重组蛋白的抗原性，其特征在于其特征在于以纯化的重组蛋白rSJFCA为抗原，用日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清作为一抗，进行Western blotting 分析。
结果显示该免疫疫苗能被兔子免疫血清识别，具有良好的免疫原性。本发明是诱导产生细胞毒性T细胞应答的为数不多的方法之一；可以克服蛋白亚基疫苗易发生错误折叠和糖基化不完全的问题；稳定性好，大量的变异可能性很小，易于质量监控；生产成本较低；可以通过多种质粒的混合物或者构建复杂的质粒来实现多价疫苗；抗原合成稳定性好将减少加强注射剂量，非常少量（有时是毫微克级）的DNA就可以很好的活化细胞毒性T细胞。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述，但本发明的保护范围并不局限于此。
实施例1
一种预防日本血吸虫病免疫疫苗的合成方法。
具体步骤如下：
准备实验材料：6周龄雄性BALB/c小鼠（雄性）、日本血吸虫中国大陆株阳性尾蚴、质粒pMD®19-T、宿主菌DH5α、BL21(DE3)、表达质粒pET-28a(+)、日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清等
实验步骤：将小鼠以腹部贴片法接种日本血吸虫尾蚴300条，对培养16天后的小鼠进行剖杀来收集虫体，将收集的小鼠体内的虫体用灭菌的1×PBS充分洗涤，在液氮保存。取一定量的保存于液氮中的日本血吸虫虫体，根据GenBank上收录的日本血吸虫SJFCA2593.002|FSA001-P00010-C21核苷酸序，设计PCR引物，并送到河南省生物工程技术研究中心有限公司合成，引物序列如下：Sense primer(F1):5'- GCGGATCCATGAGTCTCGTAACTCCT-3' （下划线为BamHⅠ内切酶酶切位点），Antisense primer(R1): 5' GCGAGCTCTCATTTGAAGCCTAGACG-3' （下划线为SacⅠ内切酶酶切位点），通过PCR技术扩增出来，重组质粒的提取用B型质粒小量快速提取试剂盒。用限制性内切酶BamHⅠ、SacⅠ将提取的重组T载体质粒及pET-28a(+)空载体双酶切，在37 ℃水浴锅中酶切反应30min。在pET-28a(+)载体中连入我们试验中要的基因片段，构建出重组质粒。在连接仪的16°C条件下连接过夜，然后转入到宿主菌BL21(DE3)中。将单个克隆的菌落挑取出来摇菌进行PCR鉴定，将鉴定成功的单克隆进行测序鉴定。在鉴定成功的阳性克隆的菌液中提取质粒，然后用上述的酶切体系进行鉴定。将测序正确的重组菌液接种于500 mL的LB液体培养基中，然后进行摇菌培养，经过重组蛋白rSJFCA的原核表达，根据SDS-PAGE鉴定结果分析重组蛋白表达形式，采用HisBind Resin树脂柱层析,分离纯化目的蛋白，以纯化的重组蛋白rSJFCA为抗原，用日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清作为一抗，进行Western blotting 分析。Western blotting显示，免疫抗原血清能识别表达出来的重组蛋白，表明该蛋白抗原性良好，这为进一步的免疫保护实验奠定基础，为新的免疫候选疫苗抗原的研究提供重要依据。

Claims (6)

1. 一种预防日本血吸虫病免疫疫苗的合成方法，其特征在于将日本血吸虫SJFCA基因通过PCR技术扩增出来，然后表达载体pET-28a(+)与目的基因进行连接，对基因亚克隆，并且在大肠杆菌BL21(DE3)中对连接成功的片段进行诱导表达、纯化，运用Western blot的技术方法检测重组蛋白的免疫原性。
2.根据权利要求1所述的一种预防日本血吸虫病免疫疫苗的合成方法，其特征在于对日本血吸虫SJFCA基因进行引物的设计与合成和目的基因的扩增。
3.根据权利要求1所述的一种预防日本血吸虫病免疫疫苗的合成方法，其特征在于对重组质粒pET-28a(+)-SJFCA进行构建与鉴定，对重组蛋白rSJFCA进行制备。
4.根据权利要求1所述的一种预防日本血吸虫病免疫疫苗的合成方法，其特征在于提取重组质粒后，双酶切目的基因和空载体，然后纯化目的片段与空载体酶切产物，构建重组质粒pET-28a(+)-SJFCA。
5.根据权利要求1所述的一种预防日本血吸虫病免疫疫苗的合成方法，其特征在于通过表达重组蛋白rSJFCA、纯化、浓度测定来制备重组蛋白rSJFCA。
6. 根据权利要求1所述的一种预防日本血吸虫病免疫疫苗的合成方法，其特征在于以纯化的重组蛋白rSJFCA为抗原，用日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清作为一抗，进行Westernblotting 分析，来检测重组蛋白的抗原性。
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