CN106520734A - 一种提高催化麦芽糖‑β环糊精合成的普鲁兰酶耐热性的方法 - Google Patents

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徐晓东
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Abstract

本发明涉及生物酶加工领域，特别涉及一种提高催化麦芽糖‑β环糊精合成的普鲁兰酶耐热性的方法。该提高催化麦芽糖‑β环糊精合成的普鲁兰酶耐热性的方法，以地衣芽孢杆菌产普鲁兰酶为原料，其特征为：将普鲁兰酶固体粉末干热预处理；之后将其溶解在戊二醛溶液中进行交联反应，控制普鲁兰酶的质量浓度为10‑15%，得到酶溶液；将酶溶液进行超滤处理，浓缩液体积为原酶溶液体积的1/4‑1/6时，向浓缩液中加入纯水，继续进行纳滤处理，如此循环得到产品。本发明通过超滤处理去除杂质提高了酶液的浓度与纯度，可以在80℃的条件下，利用该酶合成麦芽糖‑β环糊精，进而提高酶反应效率，减少操作时间，降低生产成本。

Description

一种提高催化麦芽糖-β环糊精合成的普鲁兰酶耐热性的方法
（一）技术领域
本发明涉及生物酶加工领域，特别涉及一种提高催化麦芽糖-β环糊精合成的普鲁兰酶耐热性的方法。
（二）背景技术
普鲁兰酶（Pullulanase，E.C.3.2.1.41）专一性地水解普鲁兰、淀粉、支链淀粉以及相应低聚糖中的α-1，6-糖苷键，生成短直链的糊精。和其他淀粉酶如糖化酶等复合使用可以大大提高淀粉原料利用率，因此广泛地应用于直链淀粉、麦芽糖、抗性淀粉、分支环糊精的制备，以及啤酒生产的糖化工艺。其中分支环糊精的制备有别于其他用途，其主要机理是普鲁兰酶在高底物浓度下具有较强的反向合成能力，可以将麦芽糖基等接枝到环糊精分子上，制备得到麦芽糖基环糊精等。但是在高浓度底物条件下，反应体系往往过于黏稠，导致反应传质传热能力较差，使得反应效率不高，很难提高麦芽糖基环糊精的得率。为了提高麦芽糖基环糊精的得率，可以使用高浓度的酶或提高反应的温度。高浓度的酶会增加生产成本，不利于商业化生产。提高温度不但可以加快反应速率，还能降低反应体系粘度，有利于传质传热，但是较高的反应温度会使普鲁兰酶失活，因此开发提高普鲁兰酶的耐热性能十分必要。
专利（CN201310610426.4；CN201210256804.9），采用基因工程、酶工程的方法提高了脱支芽孢杆菌普鲁兰酶的热稳定性，主要用于淀粉糖化过程中；专利（CN201010576835.3）公开了一种普鲁兰酶产生菌及其所产生的耐热普鲁兰酶及编码基因，主要是提高了厌氧芽孢杆菌普鲁兰酶的耐热性，主要用于水解特异水解普鲁兰糖；专利（CN201210214218.8）同样采用基因工程手段提高嗜热细菌普鲁兰酶的耐热性，主要在制备麦芽三糖、单糖葡萄糖中的应用。目前已公布的发明专利提供的热稳定性普鲁兰酶主要适用于水解α-1，6-糖苷键，而没有提出提高催化麦芽糖-β环糊精合成的普鲁兰酶耐热性的方法。
（三）发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种步骤简单、稳定性好的提高催化麦芽糖-β环糊精合成的普鲁兰酶耐热性的方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种提高催化麦芽糖-β环糊精合成的普鲁兰酶耐热性的方法，以地衣芽孢杆菌产普鲁兰酶为原料，包括如下步骤：
（1）将普鲁兰酶固体粉末干热预处理；
（2）将预处理的普鲁兰酶固体粉末溶解在戊二醛溶液中进行交联反应，控制普鲁兰酶的质量浓度为10-15%，得到酶溶液；
（3）将酶溶液进行超滤处理，浓缩液体积为原酶溶液体积的1/4-1/6时，向浓缩液中加入与滤过液体积相同的纯水，继续进行纳滤处理，如此循环1-2次，最后得到产品。
本发明乙地衣芽孢杆菌发酵产普鲁兰酶为原料，经过干热预处理、交联改性、超滤浓缩等步骤，制得用于生产麦芽糖-β环糊精的耐热普鲁兰酶。
本发明的更优技术方案为：
所述地衣芽孢杆菌产普鲁兰酶的水分含量为6-10%。
步骤（1）中，普鲁兰酶固体粉末在70-75℃、相对湿度为60-80%的条件下，加热12-16小时。
步骤（2）中，普鲁兰酶固体粉末溶解在质量浓度为0.6-1.0%的戊二醛溶液中，溶解普鲁兰酶后的溶液pH值控制在5.0-6.0，温度控制在30-40℃，交联反应时间为1-2h。
步骤（3）中，超滤处理的压力为1.0-2.0MPa，温度为室温，pH控制在5.0-6.0，超滤膜分子量为30000，去除多余水分及小分子物质。
将所制得的浓缩酶液进行耐热实验，80℃加热2小时，酶活保持95%以上，90℃加热2小时，酶活保持70%以上，由此可见，本发明通过固态微变性手段，使得普鲁兰酶分子部分伸展，从而利于戊二醛在单分子普鲁兰酶内部发生交联反应，从而可以有效提高地衣芽孢杆菌产普鲁兰酶的热稳定性，保证其能在高温条件下完成催化反应，缩短反应时间，提高麦芽糖-β环糊精得率。
本发明通过超滤处理去除杂质提高了酶液的浓度与纯度，可以在80℃的条件下，利用该酶合成麦芽糖-β环糊精，进而提高酶反应效率，减少操作时间，降低生产成本。
（四）具体实施方式
实施例1：
本发明以地衣芽孢杆菌发酵产普鲁兰酶为原料，经过干热预处理、交联改性、超滤浓缩等步骤，可制得用于生产麦芽糖-β环糊精的耐热普鲁兰酶，具体操作过程如下：
（1）酶制剂的干热预处理：将水分含量为6%的地衣芽孢杆菌产普鲁兰酶固体粉末在70℃，相对湿度为60%的条件下，加热12小时；
（2）交联改性：将步骤（1）中干热处理的普鲁兰酶固体粉末，溶解浓度为0.6%的戊二醛溶液中，使得普鲁兰酶的浓度控制在10%，溶液pH值控制在5.0，温度控制为30℃，交联反应时间控制在1小时；
（3）超滤浓缩：将步骤（2）处理的酶液进行超滤处理，处理压力为1.0MPa，处理温度在室温条件下，pH控制在5.0，超滤膜分子量30000，去除多余水分及小分子物质，当浓缩液体积为原液体积的1/4时，向浓缩液中加入与滤过液体积相同的纯水，继续进行纳滤处理，如此循环1次。
将所制得的浓缩酶液进行耐热实验，80℃加热2小时，酶活保持96%，90℃加热2小时，酶活保持72%，显著的提高了地衣芽孢杆菌发酵产普鲁兰酶的热稳定性。
实施例2：
本发明以地衣芽孢杆菌发酵产普鲁兰酶为原料，经过干热预处理、交联改性、超滤浓缩等步骤，可制得用于生产麦芽糖-β环糊精的耐热普鲁兰酶，具体操作过程如下：
（1）酶制剂的干热预处理：将水分含量为10%的地衣芽孢杆菌产普鲁兰酶固体粉末在75℃，相对湿度为80%的条件下，加热16小时；
（2）交联改性：将步骤（1）中干热处理的普鲁兰酶固体粉末，溶解浓度为1.0%的戊二醛溶液中，使得普鲁兰酶的浓度控制在15%，溶液pH值控制在6.0，温度控制为40℃，交联反应时间控制在2小时；
（3）超滤浓缩：将步骤（2）处理的酶液进行超滤处理，处理压力为2.0MPa，处理温度在室温条件下，pH控制在6.0，超滤膜分子量30000，去除多余水分及小分子物质，当浓缩液体积为原液体积的1/6时，向浓缩液中加入与滤过液体积相同的纯水，继续进行纳滤处理，如此循环2次。
将所制得的浓缩酶液进行耐热实验，80℃加热2小时，酶活保持97%，90℃加热2小时，酶活保持76%，显著的提高了地衣芽孢杆菌发酵产普鲁兰酶的热稳定性。
实施例3：
本发明以地衣芽孢杆菌发酵产普鲁兰酶为原料，经过干热预处理、交联改性、超滤浓缩等步骤，可制得用于生产麦芽糖-β环糊精的耐热普鲁兰酶，具体操作过程如下：
（1）酶制剂的干热预处理：将水分含量为8%的地衣芽孢杆菌产普鲁兰酶固体粉末在72℃，相对湿度为70%的条件下，加热14小时；
（2）交联改性：将步骤（1）中干热处理的普鲁兰酶固体粉末，溶解浓度为0.8%的戊二醛溶液中，使得普鲁兰酶的浓度控制在12%，溶液pH值控制在5.5，温度控制为35℃，交联反应时间控制在1.5小时；
（3）超滤浓缩：将步骤（2）处理的酶液进行超滤处理，处理压力为1.5MPa，处理温度在室温条件下，pH控制在5.5，超滤膜分子量30000，去除多余水分及小分子物质，当浓缩液体积为原液体积的1/5时，向浓缩液中加入与滤过液体积相同的纯水，继续进行纳滤处理，如此循环2次。
将所制得的浓缩酶液进行耐热实验，80℃加热2小时，酶活保持96%，90℃加热2小时，酶活保持74%，显著的提高了地衣芽孢杆菌发酵产普鲁兰酶的热稳定性。

Claims (5)

1.一种提高催化麦芽糖-β环糊精合成的普鲁兰酶耐热性的方法，以地衣芽孢杆菌产普鲁兰酶为原料，其特征为，包括如下步骤：（1）将普鲁兰酶固体粉末干热预处理；（2）将预处理的普鲁兰酶固体粉末溶解在戊二醛溶液中进行交联反应，控制普鲁兰酶的质量浓度为10-15%，得到酶溶液；（3）将酶溶液进行超滤处理，浓缩液体积为原酶溶液体积的1/4-1/6时，向浓缩液中加入与滤过液体积相同的纯水，继续进行纳滤处理，如此循环1-2次，最后得到产品。
2.根据权利要求1所述的提高催化麦芽糖-β环糊精合成的普鲁兰酶耐热性的方法，其特征在于：所述地衣芽孢杆菌产普鲁兰酶的水分含量为6-10%。
3.根据权利要求1所述的提高催化麦芽糖-β环糊精合成的普鲁兰酶耐热性的方法，其特征在于：步骤（1）中，普鲁兰酶固体粉末在70-75℃、相对湿度为60-80%的条件下，加热12-16小时。
4.根据权利要求1所述的提高催化麦芽糖-β环糊精合成的普鲁兰酶耐热性的方法，其特征在于：步骤（2）中，普鲁兰酶固体粉末溶解在质量浓度为0.6-1.0%的戊二醛溶液中，溶解普鲁兰酶后的溶液pH值控制在5.0-6.0，温度控制在30-40℃，交联反应时间为1-2h。
5.根据权利要求1所述的提高催化麦芽糖-β环糊精合成的普鲁兰酶耐热性的方法，其特征在于：步骤（3）中，超滤处理的压力为1.0-2.0MPa，温度为室温，pH控制在5.0-6.0，超滤膜分子量为30000。
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