CN106520615A - 快速降解玉米秸秆的复合菌系、其制备方法及预处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速降解玉米秸秆的复合菌系及其制备方法以及利用该复合菌系进行快速降解秸秆的预处理方法。本发明提供的降解玉米秸秆的微生物复合菌系，其组分为真菌、细菌与放线菌的优化组合，在组成上更具多样性，从而对玉米秸秆具有更好的降解效果。通过采用该复合菌系的预处理方法对玉米秸秆进行预处理，破坏秸秆的微观结构，加速水解进程，显著提高了木质纤维素的可及性，使降解秸秆的效率和稳定性得以显著提高，进一步促进玉米秸秆的资源化利用。

Description

快速降解玉米秸秆的复合菌系、其制备方法及预处理方法

技术领域

本发明涉及微生物筛选方法技术领域，具体涉及一种快速降解玉米秸秆的复合菌系及其制备方法以及利用该复合菌系进行快速降解秸秆的预处理方法。

背景技术

我国是农业大国，各类农作物秸秆资源十分丰富，而农作物秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素三大部分组成，自然状态下难以被微生物分解，所以秸秆直接还田后在土壤中被微生物分解转化的周期长，难以作为当季作物的肥源。以前，在农村能源短缺、薪材缺乏的情况下，大部分秸秆被农民用来作为燃料燃烧掉。但随着农村经济的发展和农村能源问题的解决，秸秆不再作为燃料，农作物在收割季节秸秆被集中焚烧的现象日益突出，不仅污染环境、危害人们的身体健康，而且烟雾弥漫，影响陆路交通和飞行安全。

目前，秸秆的主要利用方式有秸秆还田、饲料化利用、秸秆气化、固化及炭化、作生产食用菌的培养基料、工业应用等。

秸秆还田包括就地还田、快速沤肥和堆肥等。其中，秸秆就地还田可增加土壤有机质含量、培肥土壤，对农业的可持续发展有重要意义，但还有诸多问题尚未解决。首先，秸秆的碳氮比（C/N）高，不仅不利于土壤微生物降解，而且还可能导致作物缺氮而生长不良；其次，秸秆还可能传播部分病害，导致作物减产等。而快速沤肥和堆肥则存在纤维素难以降解问题。

饲料化利用技术主要包括青贮氨化、发酵法以及生产单细胞蛋白。在我国可用作饲料的农作物秸秆有多种，但具有共同的营养特点：蛋白质、可溶性碳水化合物、矿物质和胡萝卜素含量低，而粗纤维含量高，因此消化率低，适口性差。要改善适口性，提高消化率，存在纤维素的降解问题。工业应用包括造纸，生物降解生产淀粉、酒精、醋酸等，易造成严重的环境污染，而且同样存在纤维素的降解问题。

现阶段，对其生物质能源转化的研究很多，其中秸秆厌氧发酵制沼气是目前的研究热点之一。一般而言，在玉米秸秆成分中，木质素的含量为17.5%、纤维素的含量为37.3%、半纤维素的含量为20.6%、灰分含量为6.1%、有机酸盐含量为2.0%、其他物质含量为18.5%。其中纤维素和半纤维素是可发酵糖的来源，但由于木质素的存在使得玉米秸秆水解过程缓慢，水解程度低，进而影响了后续的酸化和产气过程。

因此，研究合适的预处理方法对玉米秸秆进行预处理，从而破坏秸秆的微观结构，加速水解进程，对提高以玉米秸秆为原料制取沼气的产气性能等资源化利用方面具有重要的意义，成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种可快速、高效降解玉米秸秆的复合菌系及其降解方法，使降解玉米秸秆的效率和稳定性得以显著提高。

为达到前述发明目的，本发明所采用的技术方案包括：

一种快速降解玉米秸秆的复合菌系，包括真菌、细菌和放线菌，其中真菌包括密粘褶菌、黄孢原毛平革菌、杂色云芝、绿色木霉和黑曲霉，细菌包括环状芽孢杆菌、铜绿假单胞菌，放线菌包括栗褐链霉菌。

一种所述复合菌系的制备方法，包括如下步骤：

配制液体培养基：其中，液体培养基包括营养肉汁培养基、LB培养基、PDA培养基以及酵母粉、淀粉培养基；

单一菌种扩大培养：对制备好的各液体培养基进行高温灭菌，冷却至室温后，用接种环取少量各菌种进行菌种培养；

生成复合菌系：将斜面保藏的各菌种分别通过固态培养进行活化，把活化后的不同单一菌种分别接种到不同液体培养基，并将其放在恒温震荡培养箱内培养；然后将不同菌种的菌液混合均匀。

优选地，配制营养肉汁培养基：取蛋白胨5克，牛肉膏30克，氯化钠5克，蒸馏水1000毫升，在121℃灭菌30分钟，用于环状芽孢杆菌的培养；配制LB培养基：取酵母提取物5克，蛋白胨10克，氯化钠10克，蒸馏水1000毫升，在121℃灭菌30分钟，用于铜绿假单胞菌的培养；配制酵母粉、淀粉培养基：取酵母提取物2克，可溶性淀粉10克，蒸馏水1000毫升，在121℃灭菌30分钟，用于栗褐链霉菌的培养；配制PDA培养基：取马铃薯提取液1000毫升，葡萄糖20克，在115℃灭菌30分钟，用于黄孢原毛平革菌、杂色云芝、绿色木霉、黑曲霉、密粘褶菌的培养。

优选地，单一菌种扩大培养是指将制备好的培养基，在高温下灭菌30分钟，冷却至室温后，用接种环取菌种1～2环于三角瓶内，并将其放在恒温震荡培养箱内，30℃恒温条件下120r/min连续培养2天。

优选地，生成复合菌系是指将斜面保藏的各菌种分别通过固态培养进行活化，把活化后的不同单一菌种分别接种到不同液体培养基，并将其放在恒温震荡培养箱内，30℃恒温条件下120r／min连续培养2天，然后将不同菌种的菌液混合均匀。

一种利用所述复合菌系快速降解玉米秸秆的预处理方法，取秸秆30克，置于250毫升三角瓶中，按照固液质量比1：5加入菌液，混合均匀后用封口膜封好，以维持三角瓶中基质的含水率；30℃恒温条件下培养14天，湿度控制在80%以上。

与现有技术相比，本发明的优点是：

（1）本发明提供的降解玉米秸秆的微生物复合菌系为真菌、细菌与放线菌的优化组合,能通过分泌降解酶对表面包裹层产生破坏性作用，经复合菌预处理后秸秆表面粗糙、膨松，粗糙结构的表面存在大量突起和孔洞，木质纤维素结构发生改变，增加了纤维素的暴露面积，有利于微生物菌丝能直接进入秸秆内部，通过分泌降解酶对内部木质纤维素进行降解。结果表明，复合菌预处理秸秆过程中，显著提高了木质纤维素的可及性，进一步显著提高木质纤维素的利用效率。

（2）本发明创造性地制备出复合菌系，研究表明，通过本发明的复合菌系对玉米秸秆进行预处理，从而破坏秸秆的微观结构，加速水解进程，使其降解效率比单一菌种或其他菌群显著提高。

（3）通过优化特定参数配制复合菌系，实现了快速、高效的预处理，进一步显著提高了以玉米秸秆为原料制取沼气的产气性能。

附图说明

图1为玉米秸秆预处理过程中微生物生长曲线。

图2为玉米秸秆预处理过程中pH值的变化。

图3为玉米秸秆预处理过程中COD值的变化。

图4为预处理前玉米秸秆扫描电镜图像。

图5为自然堆积预处理后玉米秸秆扫描电镜图像。

图6为复合菌预处理后玉米秸秆扫描电镜图像。

具体实施方式

为让本发明的上述及其他目的、特征及优点能更明显易懂，下文以本发明的较佳实施例为例，做详细说明如下。

本发明根据如表1所示的玉米秸秆主要成分，利用不同菌种的特性，创造性地制备出一种快速降解玉米秸秆的复合菌系，该复合菌系包括真菌、细菌和放线菌，其中真菌包括密粘褶菌、黄孢原毛平革菌、杂色云芝、绿色木霉和黑曲霉，细菌包括环状芽孢杆菌、铜绿假单胞菌，放线菌包括栗褐链霉菌。

表1 玉米秸秆的主要成分

原料

C/%

N/%

C/N

纤维素/%

半纤维素/%

木质素/%

总固体TS/%

挥发性固体VS/%

秸秆

49.41±1.87

1.48±0.14

33.39

36.53±1.27

27.93±1.62

15.38±0.92

90.92±0.73

87.49±0.31

玉米秸秆主要由纤维素、半纤维素以及木质素这些成分组成。对于这些物质的降解需要多种微生物的协同作用。本实施例中的白腐菌（复合菌中的黄孢原毛平革菌和杂色云芝）对木质素具有良好的降解能力，能使包裹在纤维素外的木质素降解，有利于纤维素裸露，从而增强其他微生物对纤维素的降解效率。同时，本实施例中的黑曲霉和绿色木霉对玉米秸秆中的纤维素和半纤维素具有较好的降解能力。另外本实施中的放线菌和细菌能从结构上改变木质纤维素的结构，提高纤维素的可及性。

本发明优选地提供了一种复合菌系快速降解玉米秸秆的方法，包括以下步骤：

液体培养基的配制方法如下：营养肉汁培养基：蛋白胨5g，牛肉膏30g，氯化钠（NaCl）5g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌30min用于环状芽孢杆菌的培养；LB培养基：酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化钠（NaCl）10g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌30 min，用于铜绿假单胞菌的培养；酵母粉、淀粉培养基：酵母提取物2g，可溶性淀粉10g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌30min，用于栗褐链霉菌的培养；PDA培养基：马铃薯提取液1000ml，葡萄糖20g，115℃灭菌30min，用于黄孢原毛平革菌、杂色云芝、绿色木霉、黑曲霉、密粘褶菌的培养。

单一菌种扩大培养：将制备好的各液体培养基，在高温下灭菌30min，冷却至室温后置于三角瓶内，用接种环取各菌种1～2环于三角瓶内，并将其放在恒温震荡培养箱内，30℃、120r/min连续培养2d，将扩大培养后的各菌种进行斜面保藏。

复合菌预处理：将斜面保藏的经扩大培养后得到的各菌种分别通过固态培养进行活化，把活化后的不同单一菌种分别接种到不同液体培养基，并将其放在恒温震荡培养箱内，30℃恒温条件下120r／min连续培养2d。然后将不同菌种的菌液混合均匀，取备用秸秆30g，置于250mL三角瓶中，按照固液质量比1:5加入菌液，混合均匀后用封口膜封好，以维持三角瓶中基质的含水率。30℃恒温培养14d，湿度控制在80%以上。

其中，单一菌种扩大培养中所述的高温为121℃以上。

采用对照试验的方法研究利用上述预处理方法对玉米秸秆的降解效率的影响。试验过程中以玉米秸秆自然堆积预处理作为对照组。每隔2d取样测定不同预处理过程中物料中的微生物生长量、pH值以及COD值，对预处理前后秸秆中木质素、纤维素、半纤维素的含量进行测定，并用扫描电镜观察微观结构变化，对比分析物料特性变化原因。

其中，木质纤维素测定方法：采用范式水洗法对秸秆中的纤维素、半纤维素和木质素含量进行测定。微生物生长量的测定：采用HP8453型（上海安捷伦科技有限公司生产）分光光度计在600nm处测定样品的OD值，作为微生物细胞浓度。pH值的测定：采用PHS-3C型（南京科环分析仪器有限公司）pH计进行测定。COD值的测定：取发酵液静置后的上清液，采用KHCN-200A型COD氨氮测定仪（南京科环分析仪有限公司生产）进行测定。

扫描电镜分析：取少量预处理前后的秸秆样品，用S-3400N II型扫描电镜（日本HITACHI生产）进行观察，放大倍数为1500倍。

试验例：以下通过试验例来具体说明用本发明所述的方法构建的复合菌系所具有的有益效果，本试验例中将复合菌系接入所述的培养基中30℃培养。以自然堆积预处理作为对照，分别测定微生物生长量、pH值、COD值、扫描电镜图像和木质纤维素含量。

试验例1：预处理过程中微生物生长曲线的变化

秸秆预处理过程中OD₆₀₀值的变化如图1所示，其中，图1中横轴代表时间（d），纵轴代表OD₆₀₀值，曲线中圆点代表自然堆积预处理，方块点代表复合菌预处理。复合菌预处理过程中0~2d为延滞期，菌体增长缓慢；2~6d是对数增长期；6~10d为稳定期，物料OD₆₀₀值始终处在较高水平，在第8d达到最大值1.521；10d后进入衰亡期，物料OD₆₀₀值缓慢降低。秸秆预处理过程中OD₆₀₀值都呈现先增高后降低的趋势，复合菌预处理过程中微生物延滞期较短，说明自然堆积过程中微生物的繁殖较慢，而复合菌可以较快的适应生长环境，使秸秆能在较短时间内就开始降解；预处理过程中复合菌OD₆₀₀值始终高于自然堆积预处理，说明复合菌预处理秸秆过程中的菌体浓度比较大，菌体生长代谢比较旺盛。

试验例2：预处理过程中pH值的变化

秸秆预处理过程中pH值的变化如图2所示，其中，图2中横轴代表时间（d），纵轴代表pH值，曲线中圆点代表自然堆积预处理，方块点代表复合菌预处理。复合菌预处理在发酵开始后快速进入酸化期，pH值在第2d达到最小值5.18；在2~6d内pH值快速回升到6.81；6d后物料的pH值一直呈现缓慢升高的趋势。复合菌预处理后秸秆的pH值始终高于自然堆积预处理，且秸秆在自然堆积预处理过程中经历较长的酸化期，不利于微生物的生长；经复合菌预处理后的物料在6d后基本能恢复到中性水平。一般非产甲烷微生物对酸碱度的适应范围较广，而产甲烷菌对环境变化极为敏感，只有在pH 6.8~7.5的环境中才能正常生长代谢。复合菌在秸秆降解过程中具有较强的pH调控能力，从pH值的角度分析，经过复合菌预处理后的秸秆更适合后续的厌氧发酵。

试验例3：预处理过程中COD的变化

秸秆预处理过程中COD值的变化如图3所示，其中，图3中横轴代表时间（d），纵轴代表COD（mg·L^-1），曲线中圆点代表自然堆积预处理，方块点代表复合菌预处理。秸秆复合菌预处理过程中的COD值在0~8d呈现增高趋势，在第8d达到最大值12865 mg·L^-1；经历高峰期后，物料的COD值开始缓慢降低，最后趋于稳定状态。通过数据对比发现，随着预处理过程的进行，经复合菌预处理后的物料中有机质含量升高，说明复合菌对秸秆的降解逐步进行，积累了大量有机质；随后又减少，说明微生物在秸秆预处理的过程中同时消耗了部分有机质；秸秆自然堆积预处理过程中的有机质含量变化趋势，说明秸秆在水解过程中降解速率较慢，降解不够完全。在预处理过程中，时间短则秸秆降解不完全，时间过长有机物会被消耗，而秸秆降解后产生的有机物是后续厌氧发酵过程中的碳源，从利用有机物的目的分析，经复合菌预处理8d后，可溶性有机物含量达到最高值，比较适合厌氧发酵。

试验例4：秸秆结构变化分析

预处理前后秸秆扫描电镜图像如图4-6所示，预处理前的秸秆表面平整光滑，结构致密有规则。自然堆积预处理后的秸秆结构成块状，部分结构表面出现脱落层，说明自然堆积预处理能改变部分木质纤维素的结构，但降解效率还有待提高；结构表面的碎屑残渣减少，并出现少许缝隙和孔洞，说明预处理过程中小粒径秸秆较先降解，对秸秆结构的破坏作用较小。经复合菌预处理后秸秆表面粗糙、膨松，粗糙结构的表面存在大量突起和孔洞，说明复合菌能通过分泌降解酶对表面包裹层产生破坏性作用；木质纤维素结构发生改变，增加了纤维素的暴露面积，有利于微生物菌丝直接进入秸秆内部，通过分泌降解酶对内部木质纤维素进行降解。结果表明，复合菌预处理秸秆过程中，提高了木质纤维素的可及性，有利于提高木质纤维素的利用效率。

试验例5：预处理前后木质纤维素含量的变化

预处理前后木质纤维素含量的变化如表2所示，秸秆预处理过程中显著降低了秸秆中中性洗涤纤维、纤维素以及半纤维素的含量（P<0.05），说明玉米秸秆中中性洗涤纤维、纤维素以及半纤维素比较容易降解；与自然堆积预处理比较，复合菌预处理过程中玉米秸秆的酸性洗涤纤维和木质素含量显著降低（P<0.05），说明复合菌对酸性洗涤纤维和木质素具有较强的降解能力。

表2预处理前后玉米秸秆的化学成分

玉米秸秆	中性洗涤纤维/%	酸性洗涤纤维/%	纤维素/%	半纤维素/%	木质素/%
						未处理	73.76±0.39a	45.83±0.14a	36.53±1.27a	27.93±1.62a	15.38±0.92a
自然堆积预处理	65.38±1.12b	43.02±0.54a	31.17±1.52b	22.36±0.58b	13.46±1.35a
						复合菌预处理	54.13±2.08c	38.61±1.05b	23.78±0.63c	15.52±0.76c	9.35±1.21b

注：表中同行数字不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而做出的些许改动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所做的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种快速降解玉米秸秆的复合菌系，其特征在于：

复合菌系包括真菌、细菌和放线菌，其中真菌包括密粘褶菌、黄孢原毛平革菌、杂色云芝、绿色木霉和黑曲霉，细菌包括环状芽孢杆菌、铜绿假单胞菌，放线菌包括栗褐链霉菌。

2.一种如权利要求1所述的复合菌系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1）配制液体培养基：其中，液体培养基包括营养肉汁培养基、LB培养基、PDA培养基以及酵母粉、淀粉培养基；

S2）单一菌种扩大培养：对制备好的各液体培养基进行高温灭菌，冷却至室温后，用接种环取少量各菌种进行菌种培养；

S3）生成复合菌系：将斜面保藏的各菌种分别通过固态培养进行活化，把活化后的不同单一菌种分别接种到不同液体培养基，并将其放在恒温震荡培养箱内培养；然后将不同菌种的菌液混合均匀。

3.根据权利要求2所述的复合菌系的制备方法，其特征在于：

配制营养肉汁培养基：取蛋白胨5克，牛肉膏30克，氯化钠5克，蒸馏水1000毫升，在121℃灭菌30分钟，用于环状芽孢杆菌的培养；

配制LB培养基：取酵母提取物5克，蛋白胨10克，氯化钠10克，蒸馏水1000毫升，在121℃灭菌30分钟，用于铜绿假单胞菌的培养；

配制酵母粉、淀粉培养基：取酵母提取物2克，可溶性淀粉10克，蒸馏水1000毫升，在121℃灭菌30分钟，用于栗褐链霉菌的培养；

配制PDA培养基：取马铃薯提取液1000毫升，葡萄糖20克，在115℃灭菌30分钟，用于黄孢原毛平革菌、杂色云芝、绿色木霉、黑曲霉、密粘褶菌的培养。

4.根据权利要求2或3所述的复合菌系的制备方法，其特征在于：

单一菌种扩大培养是指将制备好的培养基，在高温下灭菌30分钟，冷却至室温后，用接种环取菌种1～2环于三角瓶内，并将其放在恒温震荡培养箱内，30℃恒温条件下120r/min连续培养2天。

5.根据权利要求4所述的复合菌系的制备方法，其特征在于：

生成复合菌系是指将斜面保藏的各菌种分别通过固态培养进行活化，把活化后的不同单一菌种分别接种到不同液体培养基，并将其放在恒温震荡培养箱内，30℃恒温条件下120r／min连续培养2天，然后将不同菌种的菌液混合均匀。

6.一种利用权利要求1-5所述的复合菌系快速降解玉米秸秆的预处理方法，其特征在于：

取秸秆30克，置于250毫升三角瓶中，按照固液质量比1：5加入菌液，混合均匀后用封口膜封好，以维持三角瓶中基质的含水率；30℃恒温条件下培养14天，湿度控制在80%以上。