CN106520543A - 一种高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的设备及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置及方法，属于生物技术领域。该高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置，包括：过滤模块；所述过滤模块包括过滤器、设置在过滤器内部并与过滤器内壁密封的滤膜、负压装置；所述负压装置连接在所述过滤器的出口一端，用于使所述过滤器的内部保持负压；所述滤膜用于当所述负压装置使所述过滤器的内部保持负压时，将循环肿瘤细胞截留，并经由所述试剂进样模块自动加入的试剂进行染色和清洗。该装置将样本液输入到过滤器以及负压装置都可以自动控制，进而使得滤膜截留并染色循环肿瘤细胞的过程具有自动化程度高，高通量(增加过滤器数量即可实现)等效果。

Description

一种高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的设备及方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的设备及方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTC，Circulating Tumor Cell)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。在肿瘤的发展过程中，因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，大部分CTC在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险，在肿瘤的侵袭转移中起着重要作用。
循环肿瘤细胞脱落进入循环***中，许多研究结果已经证实其在肿瘤转移的诊断和预后、药物研发、个体化治疗及其探索肿瘤转移机制等方面具有潜在的价值。因此，特异、敏感地检测循环肿瘤细胞非常重要，不仅能够更加准确地评估肿瘤患者的预后，还有利于制定个性化治疗方案。
根据肿瘤细胞转移的途径，在血液或***中循环的肿瘤细胞被定义为循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)，而其中若干细胞聚集形成的细胞团块被称为循环肿瘤微栓(circulating tumor mocroemboli,CTM)。CTM是肿瘤细胞的“集体迁移”行为，因其能够抵抗细胞凋亡、保持细胞增殖能力而具有更高的转移潜能。然而，外周血中循环肿瘤细胞的数目较少(1个CTC/106～107个单核细胞)，精确分离很困难。
CellSearch***是目前FDA唯一批准用于临床富集及检测分析的技术设备，是一种半自动技术，集合了免疫磁珠分选技术和免疫细胞化学法的分离检测技术。标记有抗EpCAM抗体的磁珠与靶细胞结合，在外加磁场作用下被保留下来，接着采用荧光标记(CK8/18/19，DAPI，CD45)来区别CTC与血细胞，随后采用半自动荧光显微镜检测分析细胞大小和形态，最终确定CTC。
但是，该法操作复杂，成本很高，通量低，限制了其在临床大规模筛选检测时的应用。另外，由于外周血中存在一定数量的非肿瘤性上皮细胞(循环上皮细胞)，加上大多数恶性循环肿瘤细胞由于上皮-间质转变，从而丢失了上皮抗原EpCAM，因而无法被检测到。因此当CTC计数用于评估肿瘤对治疗的反应、肿瘤复发风险以及肿瘤筛查时，这些问题就显得特别重要。此外，由于多步细胞标记和处理会使细胞团块离散，从而使得免疫磁性分离法无法用来检测转移风险更高的CTM。
另外一种CTC富集方法采用密度梯度分离原理，根据血液中的各种细胞的密度不同，利用一种特定密度且近于等渗的溶液(分层液)与标本加入同一试管后离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将血液中各种细胞加以分离。分离后可以进行细胞染色、免疫标记等进一步的分析。在此基础上建立起来的OncoQuick方法(德国Greiner公司)，用一种专用的50mL的试管，内置多孔屏障，其下为密度梯度分离液，使用时将标本置于屏障之上从而避免在离心之前与分离液混合，与前相比(CellSearch***)，更易从粒细胞中分离出肿瘤细胞，从而更有利于进一步的分析。
该法的局限性在于由于部分肿瘤细胞可迁至血浆层或留于红细胞或中性粒细胞中，不仅容易造成在分离过程中肿瘤细胞的丢失，而且如果血液抗凝不完全，微小凝块则可能使肿瘤细胞落至梯度密度液的底部。因此该法敏感性较低且依赖于肿瘤细胞的特性、离心的时间、温度等多种因素。
2000年Vona等报道了一种依据细胞大小，通过过滤直接富集上皮性肿瘤细胞的方法(isolationby size of epithelial tumor cells,ISET)。该法可使较小的淋巴细胞和中性粒细胞通过，而较大的肿瘤细胞则被阻滞在膜上。该方法不仅操作简单，而且比较敏感，可避免烦琐的多步骤分离造成的稀少细胞的破坏和丢失，且具有高转移潜能的CTM也能被富集和计数。富集到的细胞可进行细胞学染色，或通过免疫标记、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)、TUNEL等方法分析其抗原、非整倍性和细胞凋亡等。但是，目前该法多采用实验室手动操作，自动化程度低，通量低，误差大，且容易引起交叉污染，特别易于在后续分子生物学检测时造成干扰。此外，长期手动操作对实验员的健康亦会造成潜在性的威胁。
综上所述，目前相关技术中常见的提纯循环肿瘤细胞的方法存在操作复杂、自动化程度低、通量低以及敏感性较低(依赖于肿瘤细胞的特性、离心的时间、温度等多种因素)等技术问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置，该装置用于快速捕获提纯循环肿瘤细胞，具有自动化程度高、高通量、不易引起交叉污染等效果。
本发明的第二目的在于提供一种利用所述的高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置提纯循环肿瘤细胞的方法，该方法操作简便，克服了现有技术中常见的循环肿瘤细胞提纯操作多依赖人工操作而存在的对实验人员会造成的潜在威胁。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置：所述高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置包括：过滤模块；
所述过滤模块包括过滤器、设置在过滤器内部并与过滤器内壁密封的滤膜、负压装置；所述负压装置连接在所述过滤器的出口一端，用于使所述过滤器的内部保持负压；所述滤膜用于当所述负压装置使所述过滤器的内部保持负压时，将循环肿瘤细胞截留。
本发明提供的这种高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置，其包括了过滤模块，而该过滤模块中，包括了过滤器、设置在过滤器内部并与过滤器内壁密封的滤膜以及连接在所述过滤器的出口一端负压装置；在捕获提纯循环肿瘤细胞的过程中，预先将样本液输入到过滤器内部，负压装置可以使得过滤器内部形成负压，并且使得样本液透过滤膜，从过滤器的出口端排出。在样本液透过滤膜的过程中，样本液所含的循环肿瘤细胞由于其体积较其他血液细胞大，进而会被滤膜截留，从而实现了高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的效果；由于将样本液输入到过滤器以及负压装置都可以自动控制，因此滤膜截留循环肿瘤细胞的过程具有自动化程度高，高通量(增加过滤器数量即可实现)等效果。且在同时操作多个过滤器时，每个过滤器及滤过液流经的管路均为独立管路，无交叉污染，滤过液可单独收集用于其他分析或直接排入所述废液收集装置。
可选的，所述高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置还包括：试剂进样模块和第一负压泵；
所述试剂进样模块与所述过滤器连通，且所述第一负压泵设置在所述试剂进样模块与所述过滤器的连通管路上。
在对过滤器中的样本液过滤之后，一般都会对截留在滤膜上的循环肿瘤细胞进行清洗、染色等操作，以满足后续实验分析的要求。因此，为了进一步地提高清洗以及染色的自动化程度，优选设置了试剂进样模块和第一负压泵。使用时，在第一负压泵的作用下，试剂进样模块中的试剂可被顺利的导入到过滤器中，从而非常便于实现样本液的清洗、染色操作。
可选的，所述过滤器为多个，且所有所述过滤器与所述第一负压泵的连通管路上设置有一试剂分配器。
为了实现批量处理样本液的效果，过滤器可优选为多个，而且所有所述过滤器与所述第一负压泵的连通管路上设置有一试剂分配器；通过试剂分配器可以将从试剂进样模块输入的试剂分配到多个过滤器中。更为优选的，多个过滤器(一般为8-10个)可以通过一个固定支架实现一体设置，形成一组固定的过滤器。当处理量较大时，可以并行设置多组过滤器。
对于过滤器的结构，优选的，过滤器包括管体、密封圈、可放置滤膜的支架，滤膜设置在滤膜支架上，密封圈使得滤膜和滤膜支架、管体的内壁密封。
可选的，所述试剂进样模块包括清洗液储样瓶、染色液储样瓶和保存液储样瓶；
所述清洗液储样瓶、所述染色液储样瓶和所述保存液储样瓶通过一个多通道连接头与所述第一负压泵连接。
一般来说，对于过滤后被截留的循环肿瘤细胞，多会进行清洗、染色以及封闭保存(如果不立即使用)的操作，因此，对于试剂进样模块，其优选包括清洗液储样瓶、染色液储样瓶和保存液储样瓶；且清洗液储样瓶、染色液储样瓶和保存液储样瓶通过一个多通道连接头(便于将多个储样瓶与试剂分配器连接)与第一负压泵连接。
可选的，所述清洗液储样瓶、所述染色液储样瓶和所述保存液储样瓶与所述多通道连接头的连通管路上分别设置有通道阀门。
通过多个通道阀门可以方便地控制多个储样瓶内部试剂的流向，进一步地提高了自动化程度。
可选的，还包括废液收集装置和第二负压泵；所述过滤器的出口与所述废液收集装置连通；且所述过滤器的管壁上还设置有溢流口，所述溢流口与所述废液收集装置通过溢流管连通；所述第二负压泵设置在所述溢流管上。
由于滤器的出口与所述废液收集装置连通，因此经过过滤后的样本液以及从储样瓶流出试剂使用完毕后可被废液收集装置收集。而且，由于溢流管以及第二负压泵(较优为蠕动泵、真空泵)的设置，在操作开始时，启动第二负压泵，可主动预防由于滤膜堵塞引起的样本液和试剂液溢出，从而最大限度的避免了高通量操作时样本间的污染，同时避免了有毒有害物质对仪器和操作人员的不良影响。
可选的，还包括可编程式逻辑控制器；
所述可编程式逻辑控制器与所有的所述通道阀门、所述负压装置、所述第一负压泵、所述第二负压泵、所述多通道连接头以及所述试剂分配器相连，并用于控制所述通道阀门、所述负压装置、所述第一负压泵、所述第二负压泵、所述多通道连接头以及所述试剂分配器的开/关状态。
通过可编程式逻辑控制器控制所述通道阀门、所述负压装置、所述第一负压泵、所述第二负压泵、所述多通道连接头以及所述试剂分配器的开/关状态，进一步地提高了整个循环肿瘤细胞捕获过程中的自动化程度，减少了手动操作可能会导致的误差以及试剂可对人体造成潜在危害的缺陷。
可选的，所述滤膜为高分子聚合微孔膜(更具体的，为聚碳酸酯膜，聚酯膜；孔径生产模式较优为蚀刻法)，且其孔径为5-10μm。
对于过滤器连接有负压装置的出口端，优选设置有锥形的滤过头，每个过滤器的滤过头都通过独立的滤过液输送管与滤过液收集管或废液收集装置相连，若滤过液收集在滤过液收集管中，由于每个样本间及每批次样本间均为独立操作，最大限度的避免同批次样本间和不同批次样本间的交叉污染，因此滤过液收集管中的滤过液仍可用于进行其他实验分析。此外，对于滤膜优选为透明或半透明的高分子聚合微孔膜，也可为黑色无荧光背景的高分子聚合微孔膜，微孔膜的平均孔径介于5-10μm，样本液或试剂在过滤器内的流动，均通过负压装置(较优为蠕动泵、真空泵、柱塞泵、注射泵)形成负压实现，而且5-10μm的高分子聚合微孔膜可以实现很好的循环肿瘤细胞截留。
利用所述的高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置提纯循环肿瘤细胞的方法，包括如下步骤：
将血液样本输送至过滤器内，启动负压装置使所述过滤器形成负压，并使血液样本穿过滤膜的过程中，所含的肿瘤细胞截留在滤膜上。
优选的，该方法具体包括以下步骤：
1)、将样本液固定后，加入至过滤器中，启动负压装置，使得样本液经过滤膜，且所含的循环肿瘤细胞被截留；
2)、将被截留在滤膜上的循环肿瘤细胞依次利用磷酸盐缓冲液清洗、利用染色液染色、利用磷酸盐缓冲液清洗以及利用保存液保存，即得，其中，染色液是DAPI、AO、PI、hoechst、syb green、荧光标记抗体、伊红美蓝以及瑞氏-姬姆萨中的任意一种。
该方法通过负压抽滤的方式实现了循环肿瘤细胞的截留和染色，整个操作简单易行，可控性强。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)、该装置整体结构连贯紧凑，为快速有效地捕获提纯循环肿瘤细胞的提供了保障，基于该装置的结构优势，可实现循环肿瘤细胞高自动化捕获。
(2)、通过自动控制整个装置即可实现循环肿瘤细胞的分离、清洗以及染色和保存等操作，克服了现有技术中整个捕获过程需要大量人工手动操作而可能存在的对实验人员的潜在危害以及捕获效率低等缺陷。
(3)由于过滤器、管路及负压装置的特殊设计，使得每个样本间及每批次样本间均为独立操作，最大限度的避免同批次样本间和不同批次样本间的交叉污染，因此滤过液重新收集后，仍可用于进行其他实验分析，极大的拓宽了设备的应用范围，使得1管样本进行多项检测分析成为可能。
(4)、该装置和方法的结合，克服了现有技术中常见的手动捕获循环肿瘤细胞的操作所具有的通量低、误差大，且容易引起交叉污染，特别是易于在后续分子生物学检测时造成干扰的缺陷。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明提供的高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置的结构示意图
附图标记：
0-试剂储样瓶，1-试剂进样模块，2-过滤模块，3-主动防溢出模块，4-自动控制模块，5-废液收集装置；01为清洗液储样瓶，02为染色液储样瓶，03为保存液储样瓶，0X为可扩充试剂瓶，111-11X为试剂输送管，121-12X为通道阀门，13多通道连接头，14为第一负压泵，15试剂分配器；21为过滤器固定支架，22为过滤器，23为滤膜，24滤过液输送管，25为负压装置，26为滤过液输送管密封夹，27为密封塞，221为管体，223为密封圈，224为可放置滤膜的支架，225为滤过头，222为溢流口，31为溢流管，32为第二负压泵，41为可编程式逻辑控制器，42为控制板；
图2为利用本发明的设备获取和提纯循环肿瘤细胞的结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明制备厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
请参考图1，本发明提供的这种高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置，包括过滤模块2；过滤模块2包括过滤器22、设置在过滤器22内部并与过滤器22内壁密封的滤膜23、负压装置25；负压装置25连接在过滤器22的出口一端，用于使过滤器22的内部保持负压；滤膜23用于当负压装置25使过滤器22的内部保持负压时，将循环肿瘤细胞截留。
在较为优选的方案中，该高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置还包括：试剂进样模块1和第一负压泵14；试剂进样模块1与过滤器22连通，且第一负压泵14设置在试剂进样模块1与过滤器22的连通管路上。过滤器22为多个，且所有过滤器22与第一负压泵14的连通管路上设置有一试剂分配器15。
为了进一步地提高过滤后对截留的循环细胞的清洗以及染色的自动化程度，优选设置了试剂进样模块1和第一负压泵14。使用时，在第一负压泵14的作用下，试剂进样模块1中的试剂可被顺利的导入到过滤器22中，从而非常便于实现样本液的清洗、染色操作。为了实现批量处理样本液的效果，过滤器22可优选为多个，而且所有过滤器22与第一负压泵14的连通管路上设置有一试剂分配器15；通过试剂分配器15可以将从试剂进样模块1输入的试剂分配到多个过滤器22中。
在上述较为优选方案的基础之上，优选的，试剂进样模块1包括清洗液储样瓶01、染色液储样瓶02和保存液储样瓶03；
清洗液储样瓶01、染色液储样瓶02和保存液储样瓶03通过一个多通道连接头13与第一负压泵14连接。清洗液储样瓶01、染色液储样瓶02和保存液储样瓶03与试剂分配器15的连通管路上分别设置有通道阀门。通过多个通道阀门可以方便地控制多个储样瓶内部试剂的流向，进一步地提高了装置的自动化程度。
在上述方法的基础之上，更为优选的，该高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置进一步包括废液收集装置5和第二负压泵32；过滤器22的出口与废液收集装置5连通；且过滤器22的管壁上还设置有溢流口222，溢流口222与废液收集装置5通过溢流管31连通；第二负压泵32设置在溢流管31上。
这样，经过过滤后的样本液以及从储样瓶流出试剂使用完毕后可被废液收集装置5收集或被重新收集到滤过液收集管中。而且，由于溢流管31以及第二负压泵32(较优为蠕动泵、真空泵)的设置，在操作开始时，启动第二负压泵32，可主动预防由于滤膜23堵塞引起的样本液和试剂液溢出，从而最大限度的避免了高通量操作时样本间的污染，同时避免了有毒有害物质对仪器和操作人员的不良影响。
另外，为了实现进一步的自动化控制，在上述最为优选的方案的基础之上，优选的，还设置可编程式逻辑控制器41；可编程式逻辑控制器与所有的通道阀门、负压装置25、第一负压泵14、第二负压泵32、多通道连接头13以及试剂分配器15相连，并用于控制通道阀门、负压装置25、第一负压泵14、第二负压泵32、多通道连接头13以及试剂分配器15的开/关状态。基于以上的优选设置，进一步地提高了整个循环肿瘤细胞捕获过程中的自动化程度，减少了手动操作可能会导致的误差以及试剂可对实验人员造成潜在危害的缺陷。
此外，在上述所有的方案中，为了实现对循环重量细胞的大量截留，优选的，滤膜为高分子聚合微孔膜(聚碳酸酯膜，聚酯膜)，且其孔径为5-10μm。
请参考图1，在本发明的另一技术方案中，该高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞设备包括：试剂储样瓶0、试剂进样模块1、过滤模块2、主动防溢出模块3、自动控制模块4、废液收集装置5；
试剂储样瓶0由多个试剂瓶组成，分别用以储存样品处理、染色、清洗、固定、保存时需要的试剂；附图1中所示(但不仅限于此)，其中，01为清洗液储样瓶，02为染色液储样瓶，03为保存液储样瓶，0X为可扩充试剂瓶(例如为固定液储样瓶、保存液储样瓶等)，可根据提取染色需要增添若干相关试剂瓶(最多可扩充至10个储样瓶)。
试剂进样模块1包括：试剂输送管111-11X、通道阀门121–12X、多通道连接头13、第一负压泵14、试剂分配器15。试剂输送管111-11X有多条，用以连通试剂储样瓶0与过滤器22，且每条试剂输送管上分别设置有通道阀门121–12X，通过多个通道阀门121–12X可以方便地控制多个试剂储样瓶(01-0X)内部试剂的流向，进一步地提高了自动化程度。
使用时，在第一负压泵14的作用下，试剂储样瓶(01–0X)中的试剂可按顺序被顺利的分别导入到单个或多个过滤器22中，从而自动化地实现样本液的清洗、染色操作。由于从样本液过滤以截留循环肿瘤细胞，到将各种试剂输入多个过滤器22对截留的循环肿瘤细胞进行清洗、固定、染色的所有步骤均可以自动控制，因此滤膜截留染色循环肿瘤细胞的全过程具有自动化程度高，高通量(增加过滤器数量即可实现)等效果。
试剂进样模块1与试剂储样瓶(01–0X)相连，每种试剂从独立试剂输送管(111-11X)，通过多通道连接头13进入试剂分配器15；试剂流动通过第一负压泵14(较优为蠕动泵、柱塞泵、真空泵、注射泵)形成负压推动试剂液体流动；每种试剂的独立试剂输送管路上均设有通道阀门(121–12X，较优为电磁阀)，用以控制通过该通道的试剂的开放和关闭时间；试剂分配器15具有定位和分配功能，可将进入分配器中的试剂均匀分配到过滤模块2的多个过滤器22中；
在染色液通道112上设有颗粒过滤器1121，用以过滤染色液中由于结晶形成的颗粒物，最大限度降低对染色后细胞的干扰；所有通道阀门、负压泵、多通道连接头13以及试剂分配器15均与可编程式逻辑控制器41相连，并受编程程序控制。
过滤模块2包括：过滤器固定支架21、过滤器22、滤膜23、滤过液输送管24、负压装置25；一组过滤器固定支架21上可同时固定8-10个过滤器22，多组过滤器固定支架21通过组合形式方便增加；过滤器22由管体221、密封圈223、可放置滤膜的支架224、滤过头225组成；过滤器22的管体上设有溢流口222，该溢流口222与主动防溢流模块3相连，用以防止由于滤膜23堵塞引起的样本和试剂液溢出。
管体221与滤膜23、可放置滤膜的支架224、滤过头225拼装组合形成滤器22；密封圈223用以密封管体221与滤膜23、可放置滤膜的支架224之间的空隙，便于后续负压操作；每个过滤器22的滤过头225都与独立的滤过液输送管24相连，最大限度的避免同批次样本间和不同批次样本间的交叉污染，滤过液输送管24最终与废液收集装置5相连，或与其他滤过液收集管相连；滤膜23为透明或半透明的高分子聚合微孔膜，也可为黑色无荧光背景的高分子聚合微孔膜，微孔膜的平均孔径介于5-10μm；样本试剂过滤及滤过液流动，均通过负压装置25(较优为蠕动泵、真空泵)形成负压推动试剂液体流动；负压装置25与可编程式逻辑控制器41相连，并受编程程序控制。
主动防溢出模块3包括溢流管31、第二负压泵32。溢流管31与过滤器22的管体221上的溢流口222相连，最终与废液收集装置5相连；溢流管路上接有第二负压泵32(较优为蠕动泵、真空泵)，在样本操作开始时即启动负压操作，主动预防由于滤膜23堵塞引起的样本和试剂液溢出，从而最大限度的避免了高通量操作时样本间的污染，同时避免了有毒有害物质对仪器和操作人员的不良影响；第二负压泵32与可编程式逻辑控制器41相连，并受编程程序控制。
废液收集装置5与滤过液输送管24，溢流管31相连，内装病原微生物灭活试剂(较优为次氯酸钠、酒精溶液等)用以灭活进入废液收集装置的滤过液或溢流液中的病原微生物，从而对操作环境和人员进行有效保护。
自动控制模块4用以控制试剂进样模块1、过滤模块2、主动防溢出模块3的可编程式逻辑控制器41，可编程式逻辑控制器4.1可与电脑或控制板42相连，用以按照编程程序按顺序和时间调控各个控制器，或按具体要求更改操作程序及时间。
接下来，结合以上的内容，对本发明的利用高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞设备快速捕获循环肿瘤细胞的方法举出以下具体实施例：
本发明提供的这种快速捕获循环肿瘤细胞的方法具体包括如下的步骤：
1、血液样本(样本液)的过滤：
a)在2ml外周血液样本中加入3ml 4％多聚甲醛溶液，处理10分钟，对外周血中的细胞进行固定，同时对可能的病原微生物进行灭活。
b)一次性或分批加入组装好的过滤器22中，每次加入后过滤器2.2中的液面应低于过滤器22的溢流口222的最下端；
c)启动负压装置25，并持续运行10-15分钟，使血液样本在负压作用下全部穿过滤膜23，使循环肿瘤细胞得以被微孔膜截留在膜表面。
在该步骤中，由于循环肿瘤细胞的直径大于红细胞及绝大部分血液有核细胞，因此，循环肿瘤细胞得以被微孔膜截留在滤膜23表面，而红细胞及血液有核细胞则穿过微孔膜通过独立的滤过液输送管24最终进入废液收集装置5，并被病原微生物灭活试剂将滤过液中可能存在的病原微生物灭活，或将滤过液收集入其他滤过液收集管，用于其他检测分析。固定液可为任何有固定细胞样本作用的试剂，较优为多聚甲醛、甲醛等醛类固定液；或者，较优为甲醇、乙醇、及无醛类固定液。
2、微孔膜上循环肿瘤细胞的清洗：
a)在血液样本过滤步骤完成后，立即启动第二负压泵32(其后始终开启)，同时第一负压泵14；
b)开启清洗液通道阀门121，清洗液磷酸盐缓冲液(pH7.4)在第一负压泵14作用下，从清洗液储样瓶01进入清洗液输送管道111，清洗液再经过多通道连接头13和试剂分配器15均匀分配到多个过滤器22中；
c)在第一负压泵14开启1-2分钟后，再次开启负压装置25，使过滤器22中的清洗液穿过滤膜，起到对滤膜23及其上所截留的细胞的清洗作用。
其中，在上述的步骤中，清洗液通道阀门121和第一负压泵14的开启时长为5分钟，随后清洗液通道阀门121关闭，第一负压泵14停止；而负压装置25开启，时长为10-15分钟，直至过滤器22中的所有清洗液排空。
此外，清洗液除了选择磷酸盐缓冲液(pH7.4)外，还可为生理盐水、5％葡萄糖溶液等。
3、滤膜上循环肿瘤细胞的染色：
a)在清洗步骤完成后，暂停负压装置25，再次开启第一负压泵14，同时开启染色液通道阀门122；
b)染色液即瑞氏-姬姆萨染色液(染色液类别根据实际情况进行选择)在第一负压泵14作用下，从染色液储样瓶02进入染色液输送管道112，随后经过颗粒过滤器1121，经多通道连接头13和试剂分配器15均匀分配到多个过滤器22中；
c)在负压装置25暂停15-20分钟后，再次开启负压装置25，使过滤器22中的染色液穿过滤膜23，起到对滤膜23上的细胞染色的作用，直至过滤器22中的所有染色液排空。
上述步骤中，染色液通道阀门122和第一负压泵14的开启时长为5分钟，随后染色液通道阀门122关闭，第一负压泵14停止；而负压装置25在第一负压泵14停止后，继续停止15-20分钟，随后负压装置25开启，时长为1-2分钟，直至过滤器22中的所有染色液排空。
需指出的是，除了瑞氏-姬姆萨染色液，该步骤中的染色液也可以是细胞核或/及细胞浆荧光染色液，较优为DAPI、AO、PI、hoechst、syb green等染色液，还可以是各种真核细胞染色液，如，伊红美蓝染色液。
4、滤膜上循环肿瘤细胞荧光标记抗体染色(可选)
为进一步区分滤膜上白细胞及循环肿瘤细胞，可选用荧光标记的CD45抗体对滤膜上的循环肿瘤细胞进行负选染色。
a)在步骤3之前或完成后，暂停负压装置25，再次开启第一负压泵14，同时开启荧光标记CD45抗体染色液通道阀门12X；
b)荧光标记CD45抗体染色液在第一负压泵14作用下，从荧光标记CD45抗体染色液储样瓶0X进入染色液输送管道11X，经多通道连接头13和试剂分配器15均匀分配到多个过滤器22中；
c)在负压装置25暂停60-90分钟后，再次开启负压装置25，使过滤器22中的荧光标记CD45抗体染色液穿过滤膜23，起到对滤膜23上的细胞抗体标记染色的作用，直至过滤器22中的所有染色液排空。
上述步骤中，染色液通道阀门122和第一负压泵14的开启时长为1分钟，随后染色液通道阀门12X关闭，第一负压泵14停止；负压装置25在第一负压泵14停止后，继续停止60-90分钟，随后开启，时长为1-2分钟，直至过滤器22中的所有染色液排空。
需指出的是，除了荧光标记CD45抗体染色液，该步骤的荧光标记抗体染色液还可以根据待分析组织特性或癌细胞类型进行选择。
5、染色后清洗步骤：
该步骤的具体操作与步骤2一致，且清洗次数为两次，在此不作赘述。
6、膜上细胞保存步骤(可选)：
a)若染色后细胞并不马上用于后续分析，为保证细胞结构、染色结果及细胞内核酸的稳定，可采用本步骤；
b)在染色后清洗步骤完成后，暂停负压装置25，再次开启第一负压泵14，同时开启保存液通道阀门(图中标号为123)；
c)保存液在第一负压泵14作用下，从保存液储样瓶03进入保存液输送管道113，保存液经过多通道连接头13和试剂分配器15均匀分配到多个过滤器22中；
d)在保存液进入过滤器22并可覆盖滤膜23后，关闭所有负压泵以及负压装置，用滤过液输送管密封夹26和溢流管密封夹33进行封闭，封闭后，将整个过滤器22取下，在过滤器顶部塞入密封塞27后，将过滤器22置于4-25℃保存；
e)上述步骤中，保存液可为任何可溶于水或乙醇的封片剂，较优为抗荧光淬灭封片液、甘油、甘油与水或其他缓冲液按不同比例混合的溶液、聚乙烯醇、聚乙烯醇与水或其他缓冲液按不同比例混合的溶液等；
f)采用本步骤保存后的细胞，在进行后续计数及提纯分析前，可优选再次采用清洗步骤1次，所用清洗液可为清洗步骤中给的中性等渗透缓冲液或乙醇，以降低保存液对后续分析造成干扰的可能性。
7、膜上循环肿瘤细胞计数及提纯步骤：
a)为了对循环肿瘤细胞进行计数分析，将染色后的滤膜23从过滤器22中取出，平铺在干净的载玻片或衬膜上，然后放入数字病理扫描设备中，选用合适波长对滤膜进行扫描，由于染色后的循环肿瘤细胞与血液中有核血细胞的细胞核形态及表面荧光标记上存在很大差异，可方便区分，因此可对扫描后的结果进行计数分析；
b)扫描结束后将滤膜放在衬膜上，然后在激光显微切割仪下将循环肿瘤细胞用激光切割下来，并分别收集在不同离心管中，用于后续分子生物学分析；
c)对于循环肿瘤细胞周围的可疑有核血细胞，为防止其对切割后的循环肿瘤细胞分子生物学分析造成干扰(有核血细胞非常容易对循环肿瘤细胞分子生物学分析造成显著干扰)，创新性的采用切割前单光束大功率激光击穿技术，破坏可疑细胞及核酸分子，最大限度的防止非特异性扩增和干扰。
试验例
对以上述的高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的方法同时处理多个样本液，测定循环肿瘤细胞的截留率及平行性，具体操作方法如下：
S1：将预定量的1000个人***HeLa细胞投加到2ml磷酸缓冲液中，然后按本发明操作方法上机过滤，同时测定10个相同样本；
S2：过滤后用数字病理***和计数分析软件对膜上细胞进行拍照计数，细胞截留率＝(膜上计数结果/1000)×100％.
结果显示(请参见表1)，利用本发明设备和方法可对多个样本进行处理，细胞截留率均高于75％，且样本间平行性好。
表1：同时处理多个样本时肿瘤细胞的截留率及平行性
过滤器编号 1# 2# 3# 4# 5# 6# 7# 8# 9# 10#
细胞截留率 78.2％ 75.9％ 79.3％ 80.6％ 76.7％ 76.1％ 78.9％ 79.1％ 81.3％ 75.1％
此外，在图2中，示出了利用本发明的设备获取和提纯循环肿瘤细胞的结果：被黑色曲线圈出的部分是截留在滤膜上的循环肿瘤微栓；右侧小图是采用切割前单光束大功率激光击穿技术破坏了周边可疑有核血细胞后，用显微切割技术提纯的循环肿瘤微栓；通过图2可以看出，本发明提供的这种提纯循环肿瘤细胞的装置及其方法对循环肿瘤细胞实现了较好的分离提纯效果。
综上，本发明提供的该装置以及方法，在样本液透过滤膜的过程中，样本液所含的循环肿瘤细胞由于其体积较其他血液细胞大，进而会被滤膜截留，实现了高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的效果；由于将样本液输入到过滤器以及负压装置(可优选为一负压泵)都可以自动控制，因此滤膜截留循环肿瘤细胞的过程具有自动化程度高，高通量(通过增加过滤器数量即可实现)等效果。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置，其特征在于，所述高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置包括：过滤模块；
所述过滤模块包括过滤器、设置在过滤器内部并与过滤器内壁密封的滤膜、负压装置；所述负压装置连接在所述过滤器的出口一端，用于使所述过滤器的内部保持负压；所述滤膜用于当所述负压装置使所述过滤器的内部保持负压时，将循环肿瘤细胞截留。
2.根据权利要求1所述的高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置，其特征在于，所述高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置还包括：试剂进样模块和第一负压泵；
所述试剂进样模块与所述过滤器连通，且所述第一负压泵设置在所述试剂进样模块与所述过滤器的连通管路上。
3.根据权利要求2所述的高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置，其特征在于，所述过滤器为多个，且所有所述过滤器与所述第一负压泵的连通管路上设置有一试剂分配器。
4.根据权利要求3所述的高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置，其特征在于，所述试剂进样模块包括清洗液储样瓶、染色液储样瓶和保存液储样瓶；
所述清洗液储样瓶、所述染色液储样瓶和所述保存液储样瓶通过一个多通道连接头与所述第一负压泵连接。
5.根据权利要求4所述的高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置，其特征在于，所述清洗液储样瓶、所述染色液储样瓶和所述保存液储样瓶与所述多通道连接头的连通管路上分别设置有通道阀门。
6.根据权利要求5所述的高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置，其特征在于，还包括废液收集装置和第二负压泵；
所述过滤器的出口与所述废液收集装置连通；且所述过滤器的管壁上还设置有溢流口，所述溢流口与所述废液收集装置通过溢流管连通；所述第二负压泵设置在所述溢流管上。
7.根据权利要求6所述的高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置，其特征在于，还包括可编程式逻辑控制器；
所述可编程式逻辑控制器与所有的所述通道阀门、所述负压装置、所述第一负压泵、所述第二负压泵、所述多通道连接头以及所述试剂分配器相连，并用于控制所述通道阀门、所述负压装置、所述第一负压泵、所述第二负压泵、所述多通道连接头以及所述试剂分配器的开/关状态。
8.根据权利要求1-6任一项所述的高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置，其特征在于，所述滤膜为高分子聚合微孔膜，且其孔径为5-10μm。
9.权利要求1-8任一项所述的高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置提纯循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将血液样本输送至过滤器内，启动负压装置使所述过滤器形成负压，并使血液样本穿过滤膜的过程中，所含的肿瘤细胞截留在滤膜上。
10.根据权利要求9所述的高通量快速捕获提纯循环肿瘤细胞的装置提纯循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
1)、将样本液固定后，加入至过滤器中，启动负压装置，使得样本液经过滤膜，且所含的循环肿瘤细胞被截留；
2)、将被截留在滤膜上的循环肿瘤细胞依次利用磷酸盐缓冲液清洗、利用染色液染色、利用磷酸盐缓冲液清洗以及利用保存液保存，即得，其中，所述染色液是DAPI、AO、PI、hoechst、syb green、荧光标记抗体、伊红美蓝以及瑞氏-姬姆萨中的任意一种。
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