CN106520114A - 一种荧光金纳米团簇探针的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种荧光金纳米团簇探针的制备方法和应用,属于荧光纳米材料领域。所述探针是以丝素蛋白作为模板和保护剂,在碱性环境中,利用“一锅法”制得大小均匀、稳定性好、对戊二醛(GA)响应的荧光金纳米团簇探针;该方法原料广泛易得,成本较低,操作简单,具有良好的重复性;而且制得的荧光金纳米团簇探针水溶性好、稳定性强,可应用于实际水样中GA的检测。
Description
技术领域
本发明涉及荧光纳米材料制备技术领域,具体涉及一种荧光金纳米团簇探针的制备方法,以及所制备的探针可用于检测实际水样中的戊二醛。
背景技术
金属纳米团簇通常是指由几个到几十个金属原子组成的一类新型的荧光纳米材料。它具有强的荧光发射、生物相容性好、稳定性强、抗光漂白性好以及高的量子产率等优点而备受广大研究者们的关注。在金属纳米团簇中,研究最多的是金纳米簇,由于其水溶性好、毒性低、光稳定性强以及发光效率高等优良的特点,被普遍用于检测离子、生物小分子、生物标记和成像方面。
戊二醛(GA)在室温下是一种无色、油性和非易燃的液体。它的应用范围很广泛,包括皮革行业的固定剂以及医疗器械的杀菌器等等。但是GA蒸汽暴露在空气中,会导致皮肤、呼吸道和眼睛过敏,并且由于它在临床和环境上的重要性,因此我们期望可以找寻一种简单、灵敏度和选择性好的方法来检测GA。
生物大分子如多肽和蛋白质,具有良好的生物相容性,自身具备多种生物功能,易于实现金纳米团簇的功能化,也常用作合成荧光金纳米团簇探针的优良模板。文献(Water-soluble gold nanoclusters prepared by protein-ligand interaction asfluorescent probe for real-time assay of pyrophosphatase activity,H.H.Deng,F.F.Wang,X.Q.Shi,H.P.Peng,A.L.Liu,X.H.Xia,W.Chen,Biosensors andBioelectronics 83(2016)1-8),用一种商业化的常见蛋白质----牛血清白蛋白,加入3-巯基丙酸作为模板,合成了高发光的金纳米团簇,对Fe3+有响应,加入PPi可以使其荧光恢复。但是,该方法合成过程需要两种模板,成本较高,因此我们迫切需要一种合成简单,成本低廉的新方法。
发明内容
本发明目的在于提供一种荧光金纳米团簇探针的制备方法,该方法操作简单,反应条件温和,所得荧光金纳米团簇探针粒径较小,分散性好,能用于实际水样中GA的检测。
为实现上述目的,本发明提供的一种荧光金纳米团簇探针的制备方法,步骤包括:
(1)将蚕茧剪成1-2cm2的小片,将蚕茧小片置于0.01-0.03mol/L碳酸钠溶液中,在90-110℃下加热脱胶0.5-2h,制得丝素蛋白;
(2)将步骤(1)得到的丝素蛋白用去离子水清洗2-4次,在CaCl2:水:乙醇=1:8:2的混合溶液中,在70-90℃下加热1-3h,使丝素蛋白溶解;
(3)向步骤(2)得到的丝素蛋白溶液冷却至室温,过滤,透析48h,置于4℃冰箱中备用;
(4)量取步骤(3)得到的丝素蛋白溶液,不断搅拌下,向丝素蛋白溶液中加入0.5-1.5mmol/L氯金酸,继续搅拌使两者充分混匀,氯金酸溶液与丝素蛋白水溶液的体积比为1-4:1;
(5)向步骤(4)得到的混合溶液中加入60μL浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液,在25-95℃下继续搅拌4-10h;
(6)将步骤(5)得到的混合溶液经过离心,最终得到荧光铜纳米团簇探针溶液。
步骤(1)中碳酸钠溶液的浓度优选为0.02mol/L。
步骤(1)中蚕茧小片与碳酸钠溶液优选在100℃下加热1h。
步骤(2)中得到的脱胶后的丝素蛋白用去离子水清洗优选3次,在CaCl2:水:乙醇=1:8:2的混合溶液中,优选在80℃下加热2h,使其溶解。
步骤(3)中透析是用截留分子量为8000-14000Da的透析袋。
步骤(4)中的氯金酸溶液的浓度优选为1mmol/L。
步骤(4)中的氯金酸溶液与丝素蛋白水溶液的体积比为2:1。
步骤(5)中,优选在37℃下搅拌8h。
步骤(6)中离心是以13000r/min转速离心10min。
本发明方法制备的荧光金纳米团簇探针可用于检测实际水样中的GA。
与现有技术相比,本发明的优点在于:
(1)以丝素蛋白为模板,原料广泛易得,绿色环保,制备方法简单,成本低廉。
(2)制得的荧光金纳米团簇探针具有良好的蓝色发光性能,将其用于构建实际水样中检测GA的传感体系,可以避免其它有机物的干扰。本发明制备的荧光金纳米团簇探针可检测实际水样中的GA。
(3)制得的荧光金纳米团簇探针尺寸小、光稳定性强、毒副作用小、水溶性好,荧光强度高,在生物成像、生物标记等领域有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明制备的荧光金纳米团簇探针的作用机理示意图
图2为本发明制备荧光金纳米团簇探针溶液分别在日光灯(1)和波长为365nm紫外灯(2)照射下的照片
图3为本发明制备荧光金纳米团簇探针溶液的荧光-紫外图,图中a为紫外-可见吸收光谱图,b为荧光光谱图
图4为本发明制备的荧光金纳米团簇探针溶液加入不同有机物时荧光峰强度的变化
图5本发明制备的荧光金纳米团簇探针溶液和加入GA后的溶液随pH的变化其荧光峰强度的变化
图6本发明制备的荧光金纳米团簇探针加入GA后的溶液随时间的变化其荧光峰强度的变化
图7本发明制备的荧光金纳米团簇探针溶液随离子强度(氯化钠的浓度)的变化其荧光峰强度的变化
图8本发明制备的荧光金纳米团簇探针溶液随GA浓度的变化其荧光峰强度的变化
图9(a)为荧光金纳米团簇探针溶液与浓度范围为0-80μM GA之间的线性关系
图9(b)为荧光金纳米团簇探针溶液与浓度范围为0-10μM GA之间的线性关系
图9(c)为荧光金纳米团簇探针溶液与浓度范围为20-80μM GA之间的线性关系
具体实施方式
本发明是以丝素蛋白为模板,在碱性环境中,通过“一锅法”制备荧光金纳米团簇探针溶液,并用于实际水样中GA的检测。下面通过实施例结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1
以丝素蛋白为模板的荧光金纳米团簇探针的制备:
(1)蚕茧脱胶制备丝素蛋白:将蚕茧剪成1-2cm2的小片,将蚕茧小片置于0.02mol/L碳酸钠溶液中,在100℃下加热1h;
(2)将步骤(1)得到的脱胶后的丝素蛋白用去离子水清洗3次,在CaCl2:水:乙醇=1:8:2的混合溶液中,在80℃下加热2h,使其溶解;
(3)向步骤(2)得到的丝素蛋白溶液冷却至室温,过滤,透析48h,置于4℃冰箱中备用;
(4)量取步骤(3)得到的丝素蛋白溶液,不断搅拌下,向丝素蛋白溶液中加入1mmol/L氯金酸,继续搅拌使两者充分混匀,氯金酸溶液与丝素蛋白水溶液的体积比为2:1;
(5)向步骤(4)得到的混合溶液中加入60μL浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液,在37℃下继续搅拌8h;
(6)将步骤(5)得到的溶液以13000r/min转速离心10min,最终得到荧光金纳米团簇探针溶液。
制备的荧光金纳米团簇探针的作用机理示意图见图1。
制备的荧光金纳米团簇探针溶液分别在日光灯和波长为365nm紫外灯照射下的照片见图2,图中1为荧光金纳米团簇探针溶液在日光灯照射下的图片,颜色为粉色,2为波长为365nm紫外灯照射下的图片,颜色为蓝色。
此外,制备的荧光金纳米团簇探针溶液的荧光-紫外图见图3,其中荧光图(b)表明制备的荧光金纳米团簇探针在固定激发波长为331nm条件下,发射峰位置在420nm左右。
实施例2
有机物对实施例1制备的荧光金纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响实验:
用pH=8的BR缓冲溶液和甲醛、乙醛、甲醇、乙醇、丙酮分别配制成浓度为800μmol·L-1的溶液,将GA配制成80μmol·L-1的溶液,分别将0.1mL实施例1制备的荧光金纳米团簇探针溶液加入到0.9mL上述含不同有机物的溶液中。固定激发波长为331nm,在室温下进行荧光光谱检测,根据420nm左右的荧光峰强度,检测有机物对荧光金纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响。
有机物对荧光金纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响见图4:在331nm激发下,从不含有机物的荧光金纳米团簇探针溶液的荧光强度F0与含有机物的荧光金纳米团簇探针溶液的荧光强度F的比值得出:GA变化最大,其他有机物变化相对较小,说明本发明制备的荧光金纳米团簇探针溶液能够定性检测GA。
实施例3
pH值对实施例1制备的荧光金纳米团簇探针溶液和加入GA后的荧光金纳米团簇溶液的荧光强度的影响实验:
分别将100μL实施例1制备的荧光金纳米团簇探针溶液和加入GA后的荧光金纳米团簇溶液分别加入到900μL不同pH值的BR缓冲溶液中,固定激发波长为331nm,在室温下进行荧光光谱检测,根据420nm左右的荧光峰强度,检测pH值对荧光金纳米团簇探针溶液和加入GA后的荧光金纳米团簇溶液的荧光强度的影响。
pH值对荧光金纳米团簇探针溶液和加入GA后的荧光金纳米团簇溶液的荧光强度的影响见图5:在331nm激发下,荧光金纳米团簇探针溶液和加入GA后的荧光金纳米团簇溶液的荧光强度在pH为8时,荧光强度变化较大,因而本发明制备的荧光金纳米团簇探针溶液选择pH=8。
实施例4
时间对实施例1制备的荧光金纳米团簇探针溶液加入GA后的影响实验:
将100μL实施例1制备的荧光金纳米团簇探针溶液加入GA后,加入到100μL BR缓冲溶液(pH=8.0)中,再加800μL去离子水,固定激发波长为331nm,在室温下0-10min内进行荧光光谱检测,根据420nm左右的荧光峰强度,检测时间对荧光金纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响。时间对荧光金纳米团簇探针溶液的荧光强度的影响见图6:在10min内,荧光金纳米团簇探针的荧光强度基本保持不变。
实施例5
离子强度对实施例1制备的荧光金纳米团簇探针溶液的荧光强度的影响实验:
将100μL实施例1制备的荧光金纳米团簇探针溶液加入到100μL BR缓冲溶液(pH=8.0)中,再加800μL去离子水,固定激发波长为331nm,加入不同浓度的氯化钠溶液(0~300mmol/L),根据420nm左右的荧光强度,检测离子强度对荧光金纳米团簇探针溶液的荧光强度的影响。
离子强度对荧光金纳米团簇探针溶液的荧光强度的影响见图7:在331nm激发下,荧光金纳米团簇探针溶液在不同浓度的氯化钠溶液(0~300mmol/L)范围内,荧光强度基本不变,说明本发明制备的荧光金纳米团簇探针溶液抗离子干扰性强。
实施例6
实施例1制备的荧光金纳米团簇探针溶液对GA检测的实验:
将实施例1制备的荧光金纳米团簇探针溶液稀释10倍,取稀释后的荧光金纳米团簇探针溶液100μL加入到900μL含GA的溶液中,固定激发波长为331nm,在室温下进行荧光光谱检测,根据420nm左右的荧光强度,检测GA对金纳米团簇探针溶液的荧光强度的影响。
GA对荧光金纳米团簇探针溶液的荧光强度的影响见图8:在331nm激发下,荧光金纳米团簇探针溶液在加入不同浓度的GA后,荧光强度逐渐减小,最后荧光峰基本趋于平滑;其中0-80μM分别是0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,40,50,60,70,80μmol/L的GA对荧光金纳米团簇探针溶液荧光强度影响的荧光光谱图,说明本发明制备的荧光金纳米团簇探针溶液能够实现对GA的检测。
此外,本发明制备的荧光金纳米团簇探针溶液的荧光强度的变化与GA的浓度呈线性关系,如图9(a)所示,金纳米团簇的荧光强度和GA的浓度成两段线性。如图9(b)所示,GA的线性方程为F0/F=0.976+0.07C(R2=0.994);如图9(c)所示,GA的线性方程为F0/F=1.303+0.0247C(R2=0.994)
实施例7
实施例1制备的荧光金纳米团簇探针溶液用于实际水样中GA的检测实验:
采用标准加入法用于实施例1制备的荧光金纳米团簇探针溶液在实际水样中生物GA检测应用的实验。如表1所示,用实际水样配制浓度分别为3,6,9μmol/L的GA溶液,将实施例1制备的荧光金纳米团簇探针溶液稀释10倍,取稀释后的荧光金纳米团簇探针溶液100μL分别加入到900μL含GA的溶液中,固定激发波长为331nm,在室温下进行荧光光谱检测,并记录相应的荧光强度。
利用图9(b)中的线性方程计算出实际水样中GA的回收率。本实验中多组平行测定并计算GA的回收率,如表1所示,说明实施例1制备的荧光金纳米团簇探针溶液能够用于水样中GA的检测。
表1为本发明制备的荧光金纳米团簇探针溶液用于实际水样中GA的检测
Claims (10)
1.一种荧光金纳米团簇探针的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将蚕茧剪成1-2cm2的小片,将蚕茧小片置于0.01-0.03mol/L碳酸钠溶液中,在90-110℃下加热脱胶0.5-2h,制得丝素蛋白;
(2)将步骤(1)得到的丝素蛋白用去离子水清洗2-4次,在CaCl2:水:乙醇=1:8:2的混合溶液中,在70-90℃下加热1-3h,使丝素蛋白溶解;
(3)向步骤(2)得到的丝素蛋白溶液冷却至室温,过滤,透析48h,置于4℃冰箱中备用;
(4)量取步骤(3)得到的丝素蛋白溶液,不断搅拌下,向丝素蛋白溶液中加入0.5-1.5mmol/L氯金酸,继续搅拌使两者充分混匀,氯金酸溶液与丝素蛋白水溶液的体积比为1-4:1;
(5)向步骤(4)得到的混合溶液中加入60μL浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液,在25-95℃下继续搅拌4-10h;
(6)将步骤(5)得到的混合溶液经过离心,最终得到荧光金纳米团簇探针溶液。
2.如权利要求1所述的一种荧光金纳米团簇探针的制备方法,其特征在于,所述的步骤(1)中碳酸钠溶液的浓度为0.02mol/L。
3.如权利要求1所述的一种荧光金纳米团簇探针的制备方法,其特征在于,所述的步骤(1)中蚕茧小片与碳酸钠溶液在100℃下加热1h。
4.如权利要求1所述的一种荧光金纳米团簇探针的制备方法,其特征在于,所述的步骤(2)中得到的脱胶后的丝素蛋白用去离子水清洗3次,在CaCl2:水:乙醇=1:8:2的混合溶液中,在80℃下加热2h,使其溶解。
5.如权利要求1所述的一种荧光金纳米团簇探针的制备方法,其特征在于,所述的步骤(3)中透析是用截留分子量为8000-14000Da的透析袋透析。
6.如权利要求1所述的一种荧光金纳米团簇探针的制备方法,其特征在于,所述的步骤(4)中的氯金酸溶液的浓度为1mmol/L。
7.如权利要求1所述的一种荧光金纳米团簇探针的制备方法,其特征在于,所述的步骤(4)中的氯金酸与丝素蛋白水溶液的体积比为2:1。
8.如权利要求1所述的一种荧光金纳米团簇探针的制备方法,其特征在于,所述的步骤(5)中,在37℃下搅拌8h。
9.如权利要求1所述的一种荧光金纳米团簇探针的制备方法,其特征在于,所述的步骤(6)中离心是以13000r/min转速离心10min。
10.如权利要求1-9所述任一方法制备的荧光金纳米团簇探针用于水中戊二醛的检测。
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