CN106497858B - 一种生产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌 - Google Patents

一种生产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生产5‑氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌，属于代谢工程和微生物发酵领域。本发明在使用载体pRSFDuet‑1‑hemA过量表达5‑氨基乙酰丙酸C4合成途径关键酶5‑氨基乙酰丙酸合酶hemA的基础上，将来源于大肠杆菌CoA合成途径中编码泛酸激酶的的基因coaA、编码磷酸泛酰半胱氨酸合成酶和脱羧酶的基因dfp、编码磷酸CoA焦磷酸化酶的基因coaD，使用pUC19和pETDuet‑1载体共表达三个基因，构建重组菌株。通过摇瓶培养验证，共表达CoA途径基因的重组菌ALA产量均明显提高，其中产量最高为700mg/L，相对于对照提高约46％。

Description

一种生产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌
技术领域
本发明涉及一种生产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌，属于代谢工程和微生物发酵领域。
背景技术
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)，分子式为C5O3NH9，分子量为131.13，熔点为149-151℃，它是生物体合成叶绿素、血红素、维生素B12等的关键前体物质。ALA作为一种安全、选择、渗透性好的光动力学药物在医学领域逐渐受到重视，已经成功应用于皮肤癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌等的诊断和光动力治疗中。另外，ALA作为一种环境相容性及选择性很高的新型光活化农药，在农药领域应用非常广泛，如作为一种无公害的绿色农药、除草剂以及植物生长调节剂等。
目前，ALA合成主要采用化学法合成，最早出现在上世纪50年代，直到20世纪90年代，相关研究才大量开展，并取得了一定的成绩。但是由于化学合成反应步骤繁琐，副产物多，分离提纯困难，ALA的得率也较低，并且环境污染严重等问题，近年来，微生物发酵生产ALA已成为研究的热点。自然界中，ALA的生物合成存在两条途径，一条是C4途径，由5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS，hemA编码)催化琥珀酰-CoA和甘氨酸生成ALA的一步酶促反应组成，主要存在于一些光合细菌、真菌以及动物体内。另外一条是C5途径，首先谷氨酸在谷氨酰-tRNA合成酶(GluRS，gltX编码)催化下，生成谷氨酰-tRNA，然后，谷氨酰-tRNA在谷氨酰-tRNA还原酶(GluTR，hemA编码)作用下生成谷氨酸-1-半醛(GSA)，最后GSA由谷氨酸-1-半醛-2,1-氨基转移酶(GSA-AM，hemL编码)催化生成ALA。该途径广泛存在于植物、藻类以及细菌(如大肠杆菌)中。
早期，人们筛选到产ALA的光合细菌类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，通过诱变育种法对其进行诱变，筛选ALA的高产菌株，并通过发酵优化等使得ALA的产量达到7.2g/L。但由于光合细菌的特殊性，其成本较高，不适合大规模的工业化生产。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌株，是以大肠杆菌为宿主，在表达C4途径关键基因hemA(编码5-氨基乙酰丙酸合酶)的基础上，共表达大肠杆菌辅酶A途径的相关基因即编码泛酸激酶的的基因coaA、编码磷酸泛酰半胱氨酸合成酶和脱羧酶的基因dfp、和编码磷酸CoA焦磷酸化酶的基因coaD。
在本发明的一种实施方式中，所述基因hemA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述基因coaA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述基因dfp的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述基因coaD的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
在本发明的一种实施方式中，所述基因hemA以pRSFDuet-1为表达载体进行共表达。
在本发明的一种实施方式中，所述基因coaA、dfp、coaD共用一个表达载体，所述表达载体包括pUC19和pETDuet-1。
本发明要解决的第二个问题是提供所述大肠杆菌工程菌株的构建方法，所述方法是以大肠杆菌为宿主，以pRSFDuet-1为表达载体表达hemA基因。
在本发明的一种实施方式中，所述方法还以pUC19或pETDuet-1载体，并表达coaA、dfp、coaD基因。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将coaA、dfp和coaD基因通过同源重组方法连接载体pUC19和pETDuet-1载体。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：
(1)将来源于荚膜红细菌的基因hemA通过扩增利用同源重组方法连接到同样通过扩增得到的载体pRSFDuet-1中，获得重组表达载体pRSFDuet-1-hemA；(2)将来源于大肠杆菌的coaA、dfp、coaD基因通过同源重组方法连接到载体pUC19和pETDuet-1载体中，分别得到表达载体pUC19-coaA-dfp-coaD和pETDuet-1-coaA-dfp-coaD；(3)将构建的重组质粒pRSFDuet-1-hemA转化E.coli BL21(DE3)；或将构建的重组质粒pRSFDuet-1-hemA与pUC19-coaA-dfp-coaD共转化至E.coli BL21(DE3)；或将构建的重组质粒pRSFDuet-1-hemA与pETDuet-1-coaA-dfp-coaD共转化E.coli BL21(DE3)。
本发明要解决的第三个技术问题是提供一种发酵生产5-氨基乙酰丙酸的方法，所述方法是将所述大肠杆菌工程菌株接种至发酵培养基中37℃，200～220r/min培养24-32h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基含有：(NH4)2SO415g/L，KH2PO45.0g/L，Na2HPO4·12H2O 15g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，酵母提取物1.0g/L，葡萄糖20g/L。
本发明还提供所述大肠杆菌工程菌在制备含5-氨基乙酰丙酸的产品中的应用。
有益效果：本发明在表达C4途径关键基因hemA的基础上，共表达大肠杆菌辅酶A途径的相关基因即编码泛酸激酶的的基因coaA、编码磷酸泛酰半胱氨酸合成酶和脱羧酶的基因dfp、编码磷酸CoA焦磷酸化酶的基因coaD，取得了意料不到的技术效果：共表达coA途径关键基因的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pRSFDuet-1-hemA pETDuet-1-coaA-dfp-coaD在250m L摇瓶培养中能够积累5-氨基乙酰丙酸700mg/L，相比于对照菌株提高了46％，有效地利用C4途径促进5-氨基乙酰丙酸的合成，实现了微生物发酵法直接发酵葡萄糖合成5-氨基乙酰丙酸，缩短发酵周期、降低生产成本。
附图说明
图1为大肠杆菌中ALA C4合成途径；
图2为大肠杆菌中辅酶A合成途径；
图3为重组质粒pRSFDuet-1-hemA构建菌落PCR电泳图；M：DL 5000Marker；
图4为重组质粒pUC19-coaA-dfp-coaD和pETDuet-1-coaA-dfp-coaD构建菌落PCR电泳图；M：DL 5000Marker；1-12：pUC19-coaA-dfp-coaD质粒构建菌落PCR结果；13-24：pETDuet-1-coaA-dfp-coaD质粒构建菌落PCR结果；M：DL 5000Marker；
图5为重组菌摇瓶发酵ALA产量；从左至右分别为E.coli BL21(DE3)pRSFDuet-1-hemA，E.coli BL21(DE3)pRSFDuet-1-hemA pUC19-coaA-dfp-coaD，E.coli BL21(DE3)pRSFDuet-1-hemA pETDuet-1-coaA-dfp-coaD。
具体实施方式
ALA分析方法：采用Mauzerall和Granick的分光光度法：将样品稀释至2mL，加入1mL的乙酸盐缓冲液，0.5mL的乙酰丙酮，然后煮沸15min。冷却至室温，取2mL的反应液至新管中，然后加入2mL的改良Ehrlich’s试剂，反应20min，利用分光光度计554nm下检测。
培养基：
斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5.0，琼脂20，pH 7.0；
种子培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5.0，pH 7.0，装液量20mL/250mL；
发酵培养基(g/L)：(NH4)2SO415，KH2PO45.0，Na2HPO4·12H2O 15，MgSO4·7H2O 1.0，酵母提取物1.0，葡萄糖20，pH 7.0，装液量30mL/250mL。
培养条件：
菌种培养：甘油管划线，然后挑取单菌落划线平板37℃培养，作为种子来源；
种子培养：平板挑取菌体，37℃，220r/min，根据要求添加卡那霉素100μg/mL和氨苄霉素100μg/mL，培养约12h，转接发酵培养基；
发酵培养：以2％(按体积比)接种量转接，0h时添加0.1-0.5mM IPTG诱导基因表达，根据转入质粒的抗性添加卡那霉素(100μg/mL)或氨苄霉素(100μg/mL)，37℃，220r/min培养，周期24-32h。
实施例1重组质粒的构建及鉴定
(1)重组质粒pRSFDuet-1-hemA，pUC19-coaA-dfp-coaD，pETDuet-1-coaA-dfp-coaD的构建。
引物如下：
RSF-F:TGTTTAACTTTAATAAGGAGGAAAATATATGGACTACAATCTCGCGCTCGAC
RSF-R:CTCCTTATTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTACAG
hemA-F:TGTTTAACTTTAATAAGGAGGAAAATATATGGACTACAATCTGGCACTCG
hemA-R:CGAGCTCGGCCACGAAGTGCTCAGGCAGAGGCCTCGGCGCGA
pUC19-F:TGATGGCGAAGTTAGCGTAGGTCATAGCTGTTTCCT
pUC19-R:CTCTTTTATACTCATTACGAGCCGGAAGCATAAAG
pET-F:GATGGCGAAGTTAGCGTAGGGCGCGCCTGCAGGTCGACAAGCTTG
pET-R:GTTTGCTCTTTTATACTCATGAATTCGGATCCTGGCTGTGGTG
coaA-19F:TGCTTCCGGCTCGTAATGAGTATAAAAGAGCAAACGTTAAT
coaA-ETF:CACAGCCAGGATCCGAATTCATGAGTATAAAAGAGCAAAC
coaA-R:ACCGGCCAGGCTCATTTATTTGCGTAGTCTGACCTCTTCT
dfp-F:AGACTACGCAAATAAATGAGCCTGGCCGGTAAAAAAATCG
dfp-R:CGCCCGTTTTTGCATTTAACGTCGATTTTTTTCATCATAA
coaD-F:AAAAATCGACGTTAAATGCAAAAACGGGCGATTTATCCGG
coaD-19R:CAGCTATGACCTACGCTAACTTCGCCATCAGCGCC
coaD-ETR:CACCACAGCCAGGATCCGATAACTTCGCCATCAGCGCC
以pRSFDuet-1质粒为模板，以引物RSF-F和RSF-R进行扩增，获得pRSFDuet-1线性载体；以荚膜红细菌ATCC 11166基因组为模板，以引物hemA-F和hemA-R扩增hemA基因，获得hemA基因片段，将pRSFDuet-1线性载体与hemA基因片段通过同源重组反应进行连接，获得重组质粒pRSFDuet-1-hemA。
以pUC19质粒为模板，以引物pUC19-F和pUC19-R进行扩增，获得pUC19线性载体；以大肠杆菌基因组为模板，以引物coaA-19F和coaA-R扩增coaA基因，以引物dfp-F和dfp-R扩增dfp基因，以引物coaD-F和coaD-19R扩增coaD基因，分别获得coaA-19、dfp、coaD-19基因片段，将pUC19线性载体、coaA-19、dfp、coaD-19片段通过同源重组反应进行连接，获得重组质粒pUC19-coaA-dfp-coaD。
以pETDuet-1质粒为模板，以引物pET-F和pET-R进行扩增，获得pETDuet-1线性载体；以大肠杆菌基因组为模板，以引物coaA-ETF和coaA-R扩增coaA基因，以引物dfp-F和dfp-R扩增dfp基因，以引物coaD-F和coaD-ETR扩增coaD基因，分别获得coaA-ET、dfp、coaD-ET基因片段，将pETDuet-1线性载体、coaA-ET、dfp、coaD-ET片段通过同源重组反应进行连接，获得重组质粒pETDuet-1-coaA-dfp-coaD。
反应条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min/kb(32个循环)；72℃10min进行PCR反应，并以1％琼脂糖凝胶电泳验证并回收PCR扩增产物，将片段(0.04ng/bp)和载体(0.02ng/bp)混于同一PCR管中，加入4μl重组酶缓冲液和2μl重组酶，加ddH2O补齐至20μl，在37度反应30min。将反应产物化转至E.coli JM109，挑选阳性克隆子提取质粒并送上海生工测序验证，菌落PCR结果电泳图如图3和图4(箭头所示为目的条带)。
(2)ALA发酵重组菌株的构建
基本方法是将构建的重组质粒pRSFDuet-1-hemA转化E.coli BL21(DE3)，获得重组菌A1。将构建的重组质粒pRSFDuet-1-hemA，pUC19-coaA-dfp-coaD共转化E.coli BL21(DE3)，获得重组菌A2。将构建的重组质粒pRSFDuet-1-hemA，pETDuet-1-coaA-dfp-coaD共转化E.coli BL21(DE3)，获得重组菌A3。
实施例2重组菌摇瓶发酵验证
菌株：
A1:E.coli BL21(DE3)pRSFDuet-1-hemA
A2:E.coli BL21(DE3)pRSFDuet-1-hemA pUC19-coaA-dfp-coaD
A3:E.coli BL21(DE3)pRSFDuet-1-hemA pETDuet-1-coaA-dfp-coaD
将重组菌A2和A3分别进行种子培养和发酵，以未共表达CoA相关基因的菌株A1为对照，37℃，220r/min发酵24-32h，测定ALA产量。结果显示(图5)，通过高拷贝质粒和中拷贝质粒组合表达coaA、dfp、coaD，与对照菌株A1相比，ALA产量均有提高。使用pUC19表达CoA相关基因的重组菌A2的ALA产量为654mg/L,比对照菌株A1提高了约37％；使用质粒pETDuet-1表达CoA相关基因的重组菌A3的ALA产量为700mg/L,比对照菌株A1提高了约46％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种生产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1230
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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cagcacccgg tcgttctggc cgcgatgcat gaggcgctgg aagcggtcgg ggccggttcg 240
ggcggcaccc gcaacatctc gggcaccacg gcctatcacc gccgtctgga agccgagatc 300
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atcaaccgtt ttctgaaatt ccgcgaaggg gcttttaccg acccggattc ctattttcat 780
aactacgcga aattaactaa agaagaagcg attaagactg ccatgacatt gtggaaagag 840
atcaactggc tgaacttaaa gcaaaatatt ctacctactc gtgagcgcgc cagtttaatc 900
ctgacgaaaa gtgctaatca tgcggtagaa gaggtcagac tacgcaaata a 951
<210> 3
<211> 1221
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgagcctgg ccggtaaaaa aatcgttctc ggcgttagcg gcggtattgc tgcctataaa 60
acccctgaac tggtgcgtcg tttgcgcgat cgcggggccg acgtccgcgt agccatgacc 120
gaagcggcaa aagcctttat caccccactt agcttgcagg cggtttctgg ttatcccgtt 180
tccgacagtc tgctggaccc ggcagccgaa gccgctatgg gccatattga gctgggtaaa 240
tgggctgatt tagtgattct cgcccctgcc acggcagatt tgattgcccg tgttgctgcc 300
ggaatggcga atgacctggt atcgacgatt tgtctggcta cacctgcgcc tgtagccgtg 360
ctccccgcca tgaaccagca gatgtaccgt gccgctgcca cgcagcataa tttagaggtg 420
cttgcttccc gtggtttgct catctggggg ccagacagtg gcagtcaggc ttgtggtgat 480
atcggtcctg ggcgaatgct cgatccgtta accattgtgg atatggcggt agcgcatttt 540
tcgcccgtca acgacctgaa acatctgaac attatgatta ccgccggccc gacgcgtgaa 600
ccgctcgatc cggtgcgtta tatctctaat cacagctccg gcaagatggg ttttgctatc 660
gccgccgccg ctgcccgtcg tggcgcgaac gtcacgctgg tatcaggtcc ggtttcacta 720
ccgacgccac cgtttgttaa acgtgttgat gtgatgaccg cgctggaaat ggaagccgcc 780
gtgaatgctt ctgtacagca gcaaaatatt tttatcggct gcgccgccgt ggcggattat 840
cgcgcagcta ccgtggcccc agagaaaatc aaaaagcagg ccacgcaggg tgatgaatta 900
acaataaaaa tggttaaaaa ccccgatatc gtcgcaggcg ttgccgcact aaaagaccat 960
cgaccctacg tcgttggatt tgccgccgaa acaaataatg tggaagaata cgcccggcaa 1020
aaacgtatcc gtaaaaacct tgatctgatc tgcgcgaacg atgtttccca gccaactcaa 1080
ggatttaaca gcgacaacaa cgcattacac cttttctggc aggacggaga taaagtctta 1140
ccgcttgagc gcaaagagct ccttggccaa ttattactcg acgagatcgt gacccgttat 1200
gatgaaaaaa atcgacgtta a 1221
<210> 4
<211> 480
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgcaaaaac gggcgattta tccgggtact ttcgatccca ttaccaatgg tcatatcgat 60
atcgtgacgc gcgccacgca gatgttcgat cacgttattc tggcgattgc cgccagcccc 120
agtaaaaaac cgatgtttac cctggaagag cgtgtggcac tggcacagca ggcaaccgcg 180
catctgggga acgtggaagt ggtcgggttt agtgatttaa tggcgaactt cgcccgtaat 240
caacacgcta cggtgctgat tcgtggcctg cgtgcggtgg cagattttga atatgaaatg 300
cagctggcgc atatgaatcg ccacttaatg ccggaactgg aaagtgtgtt tctgatgccg 360
tcgaaagagt ggtcgtttat ctcttcatcg ttggtgaaag aggtggcgcg ccatcagggc 420
gatgtcaccc atttcctgcc ggagaatgtc catcaggcgc tgatggcgaa gttagcgtag 480
<210> 5
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgtttaactt taataaggag gaaaatatat ggactacaat ctcgcgctcg ac 52
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctccttatta aagttaaaca aaattatttc tacag 35
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgtttaactt taataaggag gaaaatatat ggactacaat ctggcactcg 50
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgagctcggc cacgaagtgc tcaggcagag gcctcggcgc ga 42
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgatggcgaa gttagcgtag gtcatagctg tttcct 36
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ctcttttata ctcattacga gccggaagca taaag 35
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gatggcgaag ttagcgtagg gcgcgcctgc aggtcgacaa gcttg 45
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gtttgctctt ttatactcat gaattcggat cctggctgtg gtg 43
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tgcttccggc tcgtaatgag tataaaagag caaacgttaa t 41
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cacagccagg atccgaattc atgagtataa aagagcaaac 40
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
accggccagg ctcatttatt tgcgtagtct gacctcttct 40
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
agactacgca aataaatgag cctggccggt aaaaaaatcg 40
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cgcccgtttt tgcatttaac gtcgattttt ttcatcataa 40
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
aaaaatcgac gttaaatgca aaaacgggcg atttatccgg 40
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cagctatgac ctacgctaac ttcgccatca gcgcc 35
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
caccacagcc aggatccgat aacttcgcca tcagcgcc 38

Claims (9)

1.一种产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，在表达C4途径关键基因hemA的基础上，共表达大肠杆菌辅酶A途径的相关基因即编码泛酸激酶的基因coaA、编码磷酸泛酰半胱氨酸合成酶和脱羧酶的基因dfp、和编码磷酸CoA焦磷酸化酶的基因coaD。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述基因hemA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述基因coaA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述基因dfp的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述基因coaD的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述基因hemA以pRSFDuet-1为表达载体进行表达。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述基因coaA、dfp、coaD共用一个表达载体，所述表达载体包括pUC19和pETDuet-1。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
6.权利要求1所述大肠杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于，所述方法是以大肠杆菌为宿主，以pRSFDuet-1为表达载体表达hemA基因，所述方法还以pUC19或pETDuet-1载体，并表达coaA、dfp、coaD基因。
7.一种发酵生产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1-5任一所述大肠杆菌工程菌株接种至发酵培养基中37℃，200～220r/min培养24-32h。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基含有：(NH4)2SO4 15g/L，KH2PO4 5.0g/L，Na2HPO4·12H2O 15g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，酵母提取物1.0g/L，葡萄糖20g/L。
9.权利要求1-5任一所述大肠杆菌工程菌在制备含5-氨基乙酰丙酸的产品中的应用。
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