CN106467517B - 氘修饰的Abemaciclib衍生物 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物化学领域，具体涉及氘修饰的Abemaciclib衍生物、其制备方法、含氘修饰的Abemaciclib衍生物的药物组合物、氘修饰的Abemaciclib衍生物及其药物组合物在制备治疗细胞增殖性疾病药物中的用途。与Abemaciclib相比，本发明的某些化合物(尤其是实施例化合物)具有更优异的药代动力学性质，有望降低临床使用剂量，从而降低治疗成本以让更多患者受益。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及一类新颖的氘修饰的Abemaciclib衍生物、其制备方法、含氘修饰的Abemaciclib衍生物的药物组合物、氘修饰的Abemaciclib衍生物及其药物组合物在制备治疗细胞增殖性疾病的药物中的用途。
背景技术
周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，作为细胞内重要的信号转导分子，和周期素(cyclin)形成的CDK-cyclin复合物参与细胞的生长、增殖、休眠或者凋亡。
CDK家族包括1-13，cyclin分为A-L，不同的CDK分别联接不同的cyclin。其中，cyclin D家族在G1期开始表达，结合并激活CDK4和CDK6，形成CDK4/6-cyclin D复合物，使包括视网膜母细胞瘤蛋白在内的一系列底物磷酸化。CDK4/6特异性的激活与一些肿瘤的增殖密切相关，因此开发CDK4/6抑制剂成为一种靶向***的有效手段。2015年刚上市的新药Palbociclib就是一个口服有效的CDK4/6抑制剂，现用于晚期的妇女乳腺癌的治疗。
Abemaciclib(LY-2835219)是由礼来制药公司开发的新型靶向性乳腺癌治疗药物，它能够选择性抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4和6(CDK4/6)以及Pim-1激酶，恢复细胞周期控制，阻断肿瘤细胞增殖，临床二期效果显著，是一类新型的乳腺癌和肺癌治疗药物。
很多药物由于较差的吸收、分布、代谢性质从而限制了它们的在某些疾病上的使用。较差的ADME性质也是导致许多候选药物未能通过临床试验的原因。尽管采用特殊的制剂工艺或前药技术在某些情况下可以改善一些药物的ADME性质，但是对大多数候选药物存在的ADME问题仍不能有效解决，特别是针对药物的快速代谢问题，导致许多本来可以高效治疗疾病的药物由于过快的从体内代谢清除掉而难以成药。
氘代修饰是改进药物代谢性质的一种非常有潜力的新药开发技术。在该方法中，设法通过将一个或多个氢原子进行氘原子取代从而减慢CYP介导的药物代谢或减少不期望的代谢物的生成，结果可能会明显地延长其药物代谢循环、减少有毒代谢物的产生和药物间的相互作用、提高安全性以及获得更佳的疗效。然而，即使氘原子掺入了已知的代谢位置，氘修饰对于药物的代谢性质的影响仍然是不可预测的，因此必须经过氘代分子的实际制备和测试，才能确定氘代药物与非氘代药物在代谢方面的差别。
发明内容
本发明一方面提供一种如式I所示的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药：
其中R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8、R9及R11分别独立地选自H(氢)或D(氘)，R3、R10、R12分别独立地选自CH3、CH2D、CHD2或CD3，条件是式I化合物含有至少一个氘原子且不包括以下化合物：
优选的，其中R1、R2、R5、R6、R7、R8或R11至少一个为D。
进一步优选的，其中R1、R2同时为D。
进一步优选的，其中R5、R6同时为D。
进一步优选的，其中R7、R8同时为D。
更进一步优选的，其中R5、R6、R7、R8同时为D。
在本发明的一些优选实施方案中，如式I所示的化合物的实例如下：
在本发明的一些特别优选的实施方案中，如式I所示的化合物的实例如下：
术语“药学上可接受的盐”指保留了特定化合物的游离酸和碱的生物学效力而没有生物学不良作用的盐。药学上可接受的盐的例子包括但不限于：(1)酸加成盐，和无机酸例如盐酸、硫酸、氢溴酸、硝酸、磷酸等形成的盐；或和有机酸例如苹果酸、富马酸、马来酸、苯甲酸、苯乙酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、羟基乙酸、肉桂酸、丙酮酸、甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、丙烯酸、扁桃酸等形成的盐；或者(2)碱加成盐，和碱金属例如锂、钠、钾等形成的盐；和碱土金属例如钙、镁等形成的盐；和有机碱例如铵、胆碱、二乙醇胺、赖氨酸、乙二胺、叔丁胺、叔辛胺、三(羟甲基)氨基甲烷、N-甲基葡萄糖胺、三乙醇胺、脱氢松香胺等形成的盐。对于本领域的技术人员而言，其他的药学上可接受的盐是已知的。
术语“溶剂合物”是指通过与溶剂分子配位形成固态或液态的配合物的本专利发明的化合物的形式.。此类形式的实例为水合物、醇合物等。
术语“前药”是指在体内转化成母体药物的任何药剂。前药常常是有用的，因为，在某些情况下，他们比母体药物更易于给药。例如，通过口服给药，它们是可生物利用的，而母体药物却不是。前药相对于母体药物还可改善药物组合物中的溶解度。前药可经由酶的方法以及代谢水解的途径被转化为母体药物。
本发明中所标记合成的化合物的任何原子若没有特别指定，可代表该原子的任何一种稳定的同位素。除非特别说明，当结构中某一位置被定义为H即氢(H-1)时，该位置仅含天然存在的同位素量。同样，除非特别说明，当结构中某一位置被定义为D即氘(H-2)时，该位置含同位素量至少比天然存在的同位素量(0.015％)大3340倍(即至少会50.1％氘同位素)。
本发明中所标记合成的化合物的氘代率是指标记合成的同位素含量与天然存在的同位素量的比值。本发明中所标记合成的化合物的每个指定氘原子的氘代率可至少为3500倍(52.5％)、至少为4000倍(60％)、至少为4500倍(67.5％)、至少为5000倍(75％)、至少为5500倍(82.5％)、至少为6000倍(90％)、至少为6333.3倍(95％)、至少为6466.7倍(97％)、至少为6566.7倍(98.5％)、至少为6600倍(99％)、至少为6633.3倍(99.5％)。
本发明中的同位素体(isotopologues)是指在化学结构方面仅有同位素组成上不同的化合物。本发明中所标记合成的化合物具有相同的化学结构、仅在其分子的原子组成中同位素的变化。因此，本发明中所标记合成的在特定位置含氘化合物也同样会含非常少的该位置的氢同位素体，本发明中所标记合成的化合物中的某位置的氢同位素体的量取决许多因素，其中包括氘代试剂(D2O、D2、NaBD4、LiAlD4等)的氘同位素纯度以及引入氘同位素合成方法的有效性。然而，如前所述这种某位置的氢同位素体的量总数将少于49.9％。本发明中所标记合成的化合物中的某位置的氢同位素体的量总数将少于47.5％、40％、32.5％、25％、17.5％、10％、5％、3％、1％或0.5％。
本文中，任何未指定为氘的各原子以其天然同位素丰度存在。
本发明进一步提供用于制备如式I所示的化合物及各中间体的示例性方法。
路线1提供了一种用于制备如式I所示的化合物的示例性方法。
如路线1所示，在催化剂存在下，式II化合物与双频哪醇二硼反应制备得到式III化合物，进一步地在金属催化剂作用下偶联反应得到式IV化合物。最后在催化剂存在下，式IV化合物和式V化合物以碳酸铯等无机碱作为缚酸剂反应得到式I化合物。
路线2提供了一种用于制备路线1中的式II化合物的示例性方法。
如路线2所示，式VII化合物可由式VI化合物(其中氘代异丙胺-d1和氘代异丙胺-d7可从Aldrich购买)与乙酸酐反应制备，进一步地，式VII化合物与式化合物VIII在三氯氧磷、有机碱存在下反应生成式IX化合物。化合物X可由化合物IX在叔丁醇钾等碱的作用下经缩合反应制备。最后，以重水、氘代甲醇或氘代乙醇等为氘源，在碱性条件下经氢-氘交换可制备出式II化合物。
路线3提供了一种用于制备路线1中的式V化合物的示例性方法。
如路线3所示，式XII化合物可由式XI化合物与5-溴吡啶-2-甲醛(可以从Aldrich购买)在甲酸、原甲酸三甲酯的作用下制备得到。进一步地，化合物XII可与六甲基二硅基氨基锂反应氨化得到式V化合物。
路线4提供了另一种用于制备路线1中的式V化合物的示例性方法。
式V化合物也可经由路线4来制备。以式XVII化合物为起始原料，经5-溴吡啶-2-甲醛还原胺化成式XXV化合物,后者可被还原成式XII化合物,再进一步氨化成式V化合物.
路线5提供了再一种用于制备路线1中的式V化合物的示例性方法。
式V化合物也可经由路线5来制备。以式XVII化合物为起始原料，经6-氨基烟酸(可从Aldrich购买)反应成式XXVI化合物，后者可在还原剂(例如NaBD4(H4))存在下被进一步还原成式V化合物.
路线6提供了另一种用于制备式I化合物的示例性方法。
如路线6所示，式XI化合物与6-氨基烟酸(可以从Aldrich购买)在脱水剂或活性剂的存在下制备式XIII化合物。在催化剂存在下，所得的式XIII化合物与式IV化合物发生C-N偶联反应生成中间体式XIV化合物，所得的式XIV化合物可进一步与还原试剂或氘代还原试剂如氢化铝锂(LiAlH4)、氘化铝锂(LiAlD4)、硼氢化钠(NaBH4)/路易斯酸(AlCl3,BF3)、硼氘化钠(NaBD4)/路易斯酸、硼烷(BH3)、氘代硼烷(BD3-THF)、硅烷(PhSiH3/KOH)等反应得到式I化合物。
对于式XI化合物，针对不同位点氘代的化合物可由不同的方法制备。路线7、8、9提供了其中三种不同的合成方法。
路线7：式XI化合物的合成
如路线7所示，以哌嗪为起始原料，首先经亚硝基化反应制备得到N,N-二亚硝基哌嗪。在碱性条件下，以重水、氘代甲醇或氘代乙醇等为氘源，经氢-氘交换可进一步制备式XV化合物。在铝镍合金条件下脱亚硝基可制备式XVI化合物，然后与定量的乙酸酐、乙酰氯或乙酸反应制备得式XVII化合物。最后在还原剂如氢化铝锂、氘化铝锂、硼氢化钠/路易斯酸、硼氘化钠/路易斯酸等作用下反应得到式XI化合物。
路线8：式XI-a化合物的合成
如路线8所示，以N-乙基哌嗪为起始原料，同样经亚硝基化反应制备得式XVIII化合物。在碱性条件下，以重水、氘代甲醇或氘代乙醇等为氘源，经氢-氘交换制备得式XIX化合物。最后在铝镍合金条件下脱亚硝基可制备得式XI-a化合物。
路线9：式XI-b化合物的合成
如路线9所示，以N-苄基哌嗪为起始原料(可从Aldrich公司购买)，经亚硝基化反应制备得式XX化合物。在碱性条件下，以重水、氘代甲醇或氘代乙醇等为氘源，经氢-氘交换制备得式XXI化合物。然后在铝镍合金条件下脱亚硝基可制备得式XXII化合物，再与定量的乙酸酐、乙酰氯或乙酸反应制备得式XXIII化合物。式XXIII化合物在还原剂如氢化铝锂、氘化铝锂、硼氢化钠/路易斯酸、硼氘化钠/路易斯酸等作用下反应得到式XXIV化合物。最后以钯等金属为催化剂、氢气环境中加热反应脱苄基即可得式XI-b化合物。
上述路线表示了构成本发明的合成方法，是用于通过特定实施例描述可应用的化学方法，而不是表示本发明的范围或意在限制。不管是不是通过相同的变量名(即，R1、R2、R3等)进行标识，本文图解中的化学结构描绘了用本文化合物式中相应位置的化学基团定义在此进行适当限定的变量。在用于合成另一种化合物的化学结构式中化学基团的适当性在本领域普通技术人员的知识范围之内。
本发明的再一个方面提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的如式I所示的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
可通过多种途径给予本发明的药物组合物，这取决于是否需要局部或全身治疗和所治疗的区域。可局部(例如，透皮、皮肤、眼和粘膜包括鼻内、***和直肠递药)、肺(例如，通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括通过喷雾器；气管内、鼻内)、口服或肠胃外给药。肠胃外给药包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内例如鞘内或脑室内给药。
可接受的载体或赋形剂的某些实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、***胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲基纤维素等。药物组合物还可含有：润滑剂例如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂例如苯甲酸甲酯和苯甲酸羟基丙酯；甜味剂和矫味剂。可通过使用本领域中已知的方法配制本发明的药物组合物，以便在给予患者后提供速释、缓释或延迟释放活性成分的作用。
可按单位剂型配制组合物，每一剂量含约5～1000mg，更通常约100～500mg活性成分。术语“单位剂型”是指物理上分离的适宜作为用于人患者和其它哺乳动物的单一剂量单位，各单位含有与适宜的药物赋形剂混合的经计算可产生所需疗效的预定量的活性物质。
活性化合物的有效剂量的范围可很大，通常按药用有效量给药。但是，可以理解实际给予的化合物的量通常由医师根据相关情况决定，它们包括所治疗的病症、所选择的给药途径、所给予的实际化合物；患者个体的年龄、重量和反应；患者症状的严重程度等。
本发明化合物的治疗剂量可根据例如以下而定：治疗的具体用途、给予化合物的方式、患者的健康和状态，以及签处方医师的判断。本发明化合物在药用组合物中的比例或浓度可不固定，取决于多种因素，它们包括剂量、化学特性(例如疏水性)和给药途径。例如可通过含约0.1～10％w/v该化合物的生理缓冲水溶液提供本发明化合物，用于肠胃外给药。某些典型剂量范围为约1μg/kg～约1g/kg体重/日。在某些实施方案中，剂量范围为约0.01mg/kg～约100mg/kg体重/日。剂量很可能取决于此类变量，如疾病或病症的种类和发展程度、具体患者的一般健康状态、所选择的化合物的相对生物学效力、赋形剂制剂及其给药途径。可通过由体外或动物模型试验***导出的剂量-反应曲线外推，得到有效剂量。
本发明另一方面提供如式I所示的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药在制备治疗癌症的药物中的用途。优选的，所述癌症选自结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌(特别是NSCLC)、***癌、胶质母细胞瘤、套细胞淋巴瘤、慢性粒细胞白血病和急性粒细胞白血病。
本发明又一方面提供一种治疗哺乳动物中癌症的方法，所述癌症选自结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌(特别是NSCLC)、***癌、胶质母细胞瘤、套细胞淋巴瘤、慢性粒细胞白血病和急性粒细胞白血病，该方法包括给有需要的哺乳动物施用治疗有效量的如式I所示的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药。
本发明的实施例化合物具有显著的CDK4和CDK6抑制活性。例如，在本文所述的一种或多种测定中，具有小于50nM的CDK4抑制活性，优选具有小于20nM的CDK4抑制活性，更优选具有小于8nM的CDK4抑制剂活性，最优选具有小于2nM的CDK4抑制活性。例如，在本文所述的一种或多种测定中，具有小于50nM的CDK6抑制活性，优选具有小于20nM的CDK6抑制活性，更优选具有小于8nM的CDK6抑制剂活性，最优选具有小于2nM的CDK6抑制活性。
与Abemaciclib相比，本发明的某些化合物(尤其是实施例化合物)在人肝微粒体中具有更佳的稳定性，以及更优异的药代动力学性质，有望降低临床的使用剂量，从而降低治疗成本以让更多患者受益。
具体实施方式：
下面的实施例可以更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1化合物I-1的制备
步骤1)N-异丙基-乙酰胺
冰浴下将2-异丙胺(20g，338.4mmol)、三乙胺(34.6g，341.8mmol)依次溶于二氯甲烷(150mL)，将乙酸酐(35.2g，345.1mmol)通过恒压滴液漏斗缓慢滴加到反应瓶中，控制内温小于5℃。加毕，将反应瓶转移至室温搅拌过夜。减压浓缩将溶剂除去，用甲基叔丁基醚(200mL)稀释后加入碳酸钾(50g)，室温下搅拌1小时。减压抽滤，滤液减压浓缩得式VII-1化合物(27.8g)，为淡黄色液体。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)：δ5.71(s,1H),4.06(dt,1H),1.94(s,3H),1.14(d,J＝6.5Hz,6H)。
HRMS(M+H)m/z：102.0908。
步骤2)N-(4-溴-2,6-二氟苯基)-N’-异丙基-乙眯
将4-溴-2,6-二氟苯胺(31.05g，0.15mol)、N-异丙基乙酰胺(30.3g，0.30mmol)、三氯氧磷(20.9mL，0.225mol)依次加入到无水甲苯中。冰浴下将三乙胺(31.3mL，0.225mol)于恒压漏斗中缓慢滴加到反应瓶，保持内温小于60℃。反应瓶转移至油浴锅中加热至溶剂回流。2小时后反应瓶冷却至室温，缓慢倒入到300g冰水混合物中，加入300毫升乙酸乙酯，充分混合后分液，水层再次用200毫升乙酸乙酯萃取，合并有机层，饱和食盐水洗涤后无水硫酸钠干燥，减压浓缩后得淡黄色固体，加入100毫升石油醚打浆10分钟，减压抽滤得式IX-1化合物(28.0g)，为类白色固体(收率92.3％)。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)：δ7.01～7.03(m,2H),4.17(s,1H),1.76(s,3H),1.23(d,J＝5.6Hz,6H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ157.48,156.65,153.41,115.09,114.72,110.03,41.62,21.79,17.62。
HRMS(M+H)m/z：291.0088。
步骤3)6-溴-4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并咪唑
将N-(4-溴-2,6-二氟苯基)-N’-异丙基-乙眯(27.2g，93.47mmol)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(200mL)，加入叔丁醇钾(13.11g，116.83mmol)，氮气保护下加热至110℃。4小时后反应瓶冷却至室温，加入500毫升乙酸乙酯，800毫升水，充分混匀后分液，水层继续用500毫升乙酸乙酯萃取，分液。合并有机层，先用200毫升水洗涤5次，再用200毫升饱和食盐水洗涤3次，有机层无水硫酸钠干燥后减压浓缩得淡棕色固体，加入100毫升石油醚打浆两次后得式II-1化合物(21.0g)，为淡黄色固体。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)：δ7.41(d,J＝1.2Hz,1H),7.07(dd,J1＝1.4Hz,J2＝9.6Hz,1H),4.62(heptet,1H),2.62(s,3H),1.62(d,J＝7.0Hz,6H)。
13C-NMR(CDCl3,300MHz)：δ154.75,151.91,151.35,137.11,130.90,111.14,110.27,48.39,21.17,14.79。
HRMS(M+H)m/z：271.0251。
步骤4)6-溴-4-氟-1-异丙基-2-[D3]甲基-1H–[5,7-D2]苯并咪唑
将重水(15mL)、40％含量NaOD的重水溶液(2mL)、无水四氢呋喃(5mL)依次加入到微波反应瓶中，然后加入6-溴-4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并咪唑(2.76g，10mmoL)。开启微波加热反应，设置反应温度为145℃，反应时间为15小时。反应完毕，产物沉于反应瓶底部，除去溶剂后，重新补加重水(15mL)、40％含量NaOD的重水溶液(2mL)、无水四氢呋喃(5mL)，相同反应条件(反应温度145℃，反应时间15小时)下继续微波反应，重复氘代4次。可得式II-2化合物(2.30g)。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ4.76(heptet,1H),1.54(d,J＝6.9Hz,6H)。
MS(M+H)：276.0553。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ153.91,152.79,150.55,137.34,130.51,112.48,110.68,47.87,20.63。
HRMS(M+H)m/z：276.0557。
步骤5)4-氟-1-异丙基-2-[D3]甲基-6-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-[5,7-D2]苯并咪唑
将DMSO(100mL)加入到500毫升单口烧瓶中，依次加入6-溴-4-氟-1-异丙基-2-[D3]甲基-1H-[5,7-D2]苯并咪唑(20.7g，73.80mmoL)、双(频哪醇)二硼(27.6g，108.69mmol)、三环己基膦(3.53g，12.61mmol)、乙酸钾(21.3g，217.38mmol)。氮气置换反应瓶中空气后快速加入乙酸钯(1.5g)，氮气保护下开启加热至90℃。3小时后反应瓶冷却至室温，反应液倒入700毫升水中，充分混合后减压抽滤，滤饼用100毫升水洗涤两次后干燥得淡棕色固体。粗品加入50mL石油醚，10mL乙酸乙酯打浆10min，减压抽滤得式III-1化合物(18.8g)，为类白色固体。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ4.82(heptet,1H),1.56(d,J＝6.9Hz,6H),1.32(s,12H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ154.08,153.12,150.76,136.62,133.79,113.61,110.99,83.74,47.68,24.59,22.90,21.00。
HRMS(M+H)m/z：324.2311。
步骤6)6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-[D3]甲基-1H-[5,7-D2]苯并咪唑
将2,4-二氯-5-氟嘧啶(9.95g，59.60mmol)溶于乙二醇二甲醚(210mL)，依次加入2M碳酸钠水溶液(140mL)、4-氟-1-异丙基-2-[D3]甲基-6-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-[5,7-D2]苯并咪唑(17.5g，54.18mmol)、双(三苯基膦)氯化钯(1.0g)。氮气置换反应瓶中空气，开启油浴加热，85℃下搅拌反应1h。反应瓶冷却至室温，反应液倒入300mL水中，大量固体析出，充分搅拌后减压抽滤，滤饼干燥后得式IV-1化合物(13.18g)，为灰白色固体。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ8.94(d,J＝3.4Hz,1H),4.86(heptet,1H),1.60(d,J＝6.9Hz,6H)。
13C-NMR(CDCl3,300MHz)：δ156.45,154.81,153.85,152.95,150.54,149.58,149.22,136.35,124.50,109.15,106.98,47.93,20.77,14.50(m,CD3)。
HRMS(M+H)m/z：328.1184。
步骤7)1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-乙基-哌嗪
将N-乙基哌嗪(1.59g，13.95mmol)、2-溴-5-吡啶甲醛(3.14g，16.88mmol)依次加入到乙腈中，加入甲酸(2.10mL，55.80mmol)、原甲酸三甲酯(3.07mL，27.90mmol)。氮气保护下加热回流，4小时后反应液冷却至室温，加入30mL水，15mL乙酸乙酯，分液。有机层为剩余2-溴-5-吡啶甲醛。水层加入饱和氢氧化钠调节pH至10，加入30mL乙酸乙酯，分液，水层再次加入30mL乙酸乙酯，合并有机层，无水硫酸钠干燥后减压浓缩得产物粗品。柱层析纯化得式XII-1化合物(1.48g)，为无色液体。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)：δ8.29(1H,d,J＝1.74Hz,Py),7.53-7.55(1H,dd,J＝1.98Hz,8.10Hz,Py),7.43(1H,d,J＝8.10Hz,Py),3.47(2H,s,CH2),2.38-2.48(10H,m,piper-CH3 CH2 ),1.08(3H,t,J＝7.14Hz,CH3 CH2)。
13C-NMR(300MHz,CDCl3)：δ150.59,140.71,139.29,133.18,127.72,59.25,52.61,52.21,11.84。
HRMS(M+H)m/z：284.0757。
步骤8)5-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺
将1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-乙基-哌嗪(960mg，3.38mmol)溶于无水四氢呋喃(8mL)，加入2-(二环己基膦基)联苯(120mg，0.338mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(154mg，0.169mmol)。氮气保护下缓慢加入六甲基二硅基氨基锂(4.06mL，1M，4.06mmol)。反应瓶油浴加热至65℃，20分钟后反应瓶冷却至室温，加入50mL乙酸乙酯，30mL水，混合后分液，水层再次加入30mL乙酸乙酯，分液，合并有机层，无水硫酸钠干燥后旋蒸得淡棕色固体。柱层析纯化得式V-1化合物(670mg)，为淡黄色固体。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)：δ7.75(1H,d,J＝1.65Hz,Py),7.24-7.28(1H,dd,J＝2.16Hz,8.37Hz,Py),6.40(1H,d,J＝8.37Hz,Py),5.77(2H,s,NH2),3.24(2H,s,CH2),2.25-2.32(10H,m,piper-CH3 CH2 ),0.96(3H,t,J＝7.11Hz,CH3 CH2)。
13C-NMR(300MHz,CDCl3)：δ157.64,148.54,139.12,123.18,108.27,59.74,52.64,52.20,11.84。
HRMS(ESI)m/z：220.1688。
步骤9)[5-(4-乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-[D3]甲基-3H-[5,7-D2]苯并咪唑-5基)-嘧啶-2-基]-胺
将6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-[D3]甲基-1H-[5,7-D2]苯并咪唑(788mg，2.41mmol)、5-(4-乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺(530mg，2.41mmol)、碳酸铯(1.57g，4.82mmol)依次加入到二氧六环(20mL)中，氮气置换反应瓶中空气，快速加入三(二亚苄基丙酮)二钯(50mg)、9,9-二甲基-4,5-双二苯基膦氧杂蒽(80mg)。氮气保护下加热至反应液回流。2小时后反应液冷却至室温，加入30mL乙酸乙酯，减压抽滤。滤液加入20mL水，分液，水层时入20mL乙酸乙酯，分液，合并有机层，无水硫酸钠干燥后减压浓缩除去溶剂得淡棕色固体。粗品加入9mL石油醚，3mL乙酸乙酯，室温搅拌30分钟，减压抽滤，得式I-1化合物858mg，为类白色固体(收率69.8％)。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ10.08(s,1H),8.67(s,1H),8.20～8.22(m,1H),7.65(d,J＝7.7Hz,1H),4.81～4.85(m,1H),3.42(s,2H),2.27～2.36(m,10H),1.62(d,J＝6.4Hz,6H),0.96(t,J＝6.6Hz,3H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ155.34,154.46,153.85,152.11,150.55,148.73,148.07,147.77,147.41,138.17,136.36,133.38,126.97,126.40,111.69,108.81,58.77,52.44,51.52,48.03,20.88,11.96,(氘代甲基碳多重峰包在杂音中)。
HRMS(M+H)m/z：512.3103。
实施例2化合物I-10的制备
步骤1)4-氟-1-异丙基-2-甲基-6-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-苯并咪唑
用6-溴-4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并咪唑代替6-溴-4-氟-1-异丙基-2-[D3]甲基-1H–[5,7-D2]苯并咪唑，并参照实施例1步骤5)所示方法制备制备式III-2化合物。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)：δ7.69(s,1H),7.33(d,J＝10.7Hz,1H),4.65～4.74(m,1H),2.65(s,3H),1.65(d,J＝7.0Hz,6H),1.36(s,12H)。
13C-NMR(CDCl3,300MHz)：δ154.89,152.20,151.55,136.67,134.27,113.46,112.51,83.88,48.28,24.81,21.43,15.12。
HRMS(M+H)m/z：319.1987。
步骤2)6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并咪唑
用4-氟-1-异丙基-2-甲基-6-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-苯并咪唑代替4-氟-1-异丙基-2-[D3]甲基-6-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-[5,7-D2]苯并咪唑，并参照实施例1步骤6)所示方法制备式IV-2化合物。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ8.95(d,J＝3.3Hz,1H),8.15(s,1H),7.62(d,J＝11.9Hz,1H),4.86(heptet,1H),2.65(s,3H),1.60(d,J＝6.9Hz,6H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ156.60,155.03,153.96,153.10,150.66,149.78,149.42,136.49,124.66,109.36,107.08,48.05,20.88,14.63。
HRMS(M+H)m/z：323.0870。
步骤3)N-苄基-N-亚硝基哌嗪
向反应瓶中加入N-苄基哌嗪(50.0g，0.284mol)，0℃左右滴加2M HCl(160ml，0.318mol)，得到的反应液在0℃下搅拌10分钟，然后向反应中滴加NaNO2的水溶液[NaNO2，(24.50g，0.335mol)加入水(58mL)配成的溶液]，维持温度在0～10℃，40分钟滴完。反应混合物在室温搅拌过夜。次日，将反应加热到35℃约1小时(大量不溶固体生成)，再将反应瓶放入低温槽中，0℃下冷却析出，最后通过抽滤分离出固体产物，水洗，水层再用DCM萃取，有机相合并，无水硫酸镁干燥，通过抽滤除去干燥剂，旋转蒸发除去溶剂得到固体产物。最后通过减压烘箱50℃干燥后得到式XX-1化合物(56.71g)，为淡黄色固体(产率97.30％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3):7.26～7.34(m,5H),4.23～4.27(t,J＝10.4Hz,2H),3.81～3.85(t,J＝10.7Hz,2H),3.60(s,2H),2.66～2.70(t,J＝10.3Hz,2H),2.43～2.46(t,J＝10.7Hz,2H)。
MS(M+H)m/z：206.1。
步骤4)N-苄基-N-亚硝基-[3,3,5,5-D4]哌嗪
向反应瓶中加入N-苄基-N-亚硝基哌嗪(20.0g，97.43mmol)，甲醇钠(15.79g，292.29mmol)，氮气下，缓慢向反应瓶中加入重水(150ml)，氘代乙醇(d1，100ml)。然后加热到80℃，反应溶清。24小时后停止加热，待冷却到室温后，放入低温槽中，0℃下冷却析出。3小时后，通过抽滤分离出固体产物。最后通过减压烘箱50℃干燥得到式XXI-1化合物(17.735g)，为淡黄色固体。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)：7.25～7.33(m,5H),3.56(s,2H),2.64(s,2H),2.41(s,2H)。
MS ESI,(M+Na)m/z：232.2。
步骤5)N-苄基-[3,3,5,5-D4]哌嗪
向反应瓶中加入式XXI-1化合物(10.0g，47.78mmol)，甲醇钠(7.74g，143.34mmol)，氮气下，缓慢向反应中加入重水(75mL)及氘代乙醇(d1，75mL)。然后加热到70℃。反应24小时后停止加热，待冷却至室温后，分多次向反应中加入Al-Ni合金(30.0g)，约2小时加完，反应混合物在室温下搅拌过夜。次日，通过抽滤除去固体金属，收集含有产物的滤液。再用DCM萃取，有机相合并，无水硫酸镁干燥，通过抽滤除去干燥剂，旋转蒸发除去溶剂得到固体产物。最后通过减压干燥后得到式XXII-1化合物(7.13g)，为淡黄色油状体(产率82.81％)。
1H-NMR(300MHz,CD3OD)：7.20～7.31(m,5H),3.47(s,2H),2.39(s,4H)。
HRMS(ESI,M+H)m/z：181.2。
步骤6)N-苄基-N’-乙酰基-[3,3,5,5-D4]哌嗪
将N-苄基-[3,3,5,5-D4]哌嗪(5.40g，30mmol)溶于二氯甲烷(30mL)，冰浴条件下缓慢加入乙酸酐(3.4mL，36mmol)，室温搅拌10分钟，反应液中加入20mL饱和碳酸钠溶液，分液，水层加入30mL二氯甲烷，分液后合并有机相，无水硫酸钠干燥后减压浓缩得式XXIII-1化合物(6.20g)，为淡棕色液体。
步骤7)N-苄基-N’-[1,1-D2]乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪
将N-苄基-N’-乙酰基-[3,3,5,5-D4]哌嗪(3.33g，15.0mmol)溶于无水四氢呋喃(30mL)，依次加入[D4]硼氘化钠(1.23g，30mmol)、氯化铝(4.01g，30mmol)，开启加热至反应液回流。3小时后反应液冷却至室温，倒入50g冰水混合物中，加入饱和氢氧化钠溶液调节pH至10左右。加入50mL乙酸乙酯，混合后分液，水层再次加入50mL乙酸乙酯，分液，合并有机层，无水硫酸钠干燥后减压浓缩得式XXIV-1化合物(2.85g)，为无色液体。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ7.21～7.33(m,5H),3.43(s,2H),2.33(s,4H),0.95(s,3H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ138.27,128.67,128.02,126.74,69.66,62.13,52.47,11.70。
HRMS(M+H)m/z：211.1454。
步骤8)N-[1,1-D2]乙基-[2,2,6,6-D4]哌嗪
将N-苄基-N’-[1,1-D2]乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪(2.75g，13.10mmol)溶于甲醇，加入10％含量钯碳(0.28g)。氢气环境中加热至60℃。10小时后反应液减压抽滤，滤液旋蒸得式XI-2化合物(1.80g)，为无色液体。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ2.74(s,4H),0.95(s,3H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ69.76,52.59,44.56,26.06,11.70。
HRMS(M+H)m/z：121.1282。
步骤9)1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-[1,1-D2]乙基-[3,3,5,5--D4]哌嗪
用N-[1,1-D2]乙基-[2,2,6,6-D4]哌嗪XI-2代替N-乙基哌嗪，并参照实施例1步骤7)所示方法制备式XII-2化合物。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ8.29(s,1H),7.65～7.68(m,1H),7.58～7.61(m,1H),3.46(s,2H),2.36(s,4H),0.96(s,3H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ150.51,139.94,139.77,133.67,127.62,69.66,58.08,52.09,11.51。
MS(M+H)m/z：290.1127。
步骤10)5-(4-[1,1-D2]乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺
用1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-[1,1-D2]乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪代替1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-乙基-哌嗪，并参照实施例1步骤8)所示方法制备式V-2化合物。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ7.75(d,J＝1.6Hz,1H),7.26(dd,J1＝2.1Hz,J1＝8.4Hz1H),6.39(d,J＝8.4Hz,1H),5.77(s,2H),3.23(s,2H),2.29(s,4H),0.94(s,3H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ158.93,147.95,138.05,120.78,107.50,59.14,52.14,11.70。
HRMS(M+H)m/z：227.2136。
步骤11)[5-(4-[1,1-D2]乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5基)-嘧啶-2-基]-胺
用6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并咪唑代替6--(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-[D3]甲基-1H-[5,7-D2]苯并咪唑，用5-(4-[1,1-D2]乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺代替5-(4-乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺，并参照实施例1步骤9所示方法制备式I-10化合物。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ10.12(s,1H),8.69(d,J＝2.9Hz,1H),8.29(s,1H),8.20～8.22(m,2H),7.66～7.70(m,2H),4.80～4.89(m,1H),3.43(s,2H),2.64(s,3H),2.36(s,4H),1.63(d,J＝6.5Hz,6H),0.95(s,3H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ155.33,154.52,153.89,152.12,150.59,148.75,148.09,147.79,147.43,138.19,136.37,133.36,127.00,126.56,111.72,108.88,58.81,52.29,51.45,48.05,20.89,14.50,11.72。
HRMS(M+H)m/z：513.3152。
实施例3化合物I-9的制备
步骤1)N-苄基-N’-乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪
用氢化锂铝代替硼氘化钠，并参照实施例2步骤7)所示方法制备式XXIV-2化合物。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ7.20～7.33(m,5H),3.43(s,2H),2.26～2.34(m,6H),0.97(t,J＝7.2Hz,3H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ138.25,128.70,128.04,126.77,62.10,52.41,51.44,11.92。
MS(M+H)：209.1346。
步骤2)N-乙基-[2,2,6,6-D4]哌嗪
用N-苄基-N’-乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪代替N-苄基-N’-[1,1-D2]乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪，并参照实施例2步骤8所示方法制备式XI-3化合物。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ2.73(s,4H),2.28(q,J＝7.2Hz,2H),0.97(t,J＝7.2Hz,3H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ169.76,51.96,44.73,26.06,11.71。
HRMS(M+H)m/z：119.1475。
步骤3)1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪
用N-乙基-[2,2,6,6-D4]哌嗪代替N-[1,1-D2]乙基-[2,2,6,6-D4]哌嗪，并参照实施例2步骤9)所示方法制备式XII-3化合物。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ8.28(1H,s,Py),7.64-7.68(1H,m,Py),7.59(1H,d,J＝8.10Hz,Py),3.46(2H,s,CH2-Py),2.35(4H,s,CD2CH2-piper),2.28(2H,q,J＝7.20Hz,CH3CH2-piper),0.96(3H,t,J＝7.20Hz,CH3CH2)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ150.47,139.89,139.73,133.70,127.59,58.12,52.28,51.37,26.02,11.91。
HRMS(M+H)m/z：288.0843，290.0825。
步骤4)5-(4-乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺
用1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪代替1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-[1,1-D2]乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪，并参照实施例2步骤10所示方法制备式V-3化合物。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ7.74(1H,s,Py),7.25(1H,d,J＝8.34HzPy),6.38(1H,d,J＝8.37Hz,Py),3.23(2H,s,CH2-Py),2.30(4H,s,CD2CH2-piper),2.26(2H,q,J＝7.20Hz,CH3CH2-piper),0.96(3H,t,J＝7.14Hz,CH3CH2)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ158.90,147.93,138.03,120.81,107.48,59.13,52.16,51.41,11.95。
HRMS(M+H)m/z：225.1881。
步骤5)[5-(4-乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5基)-嘧啶-2-基]-胺
用5-(4-乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺代替5-(4-[1,1-D2]乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺，并参照实施例2步骤11)所示方法制备式I-9化合物。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ10.08(s,1H),8.68(d,J＝2.6Hz,1H),8.29(s,1H),8.20～8.22(m,2H),7.65～7.70(m,2H),4.80～4.89(m,1H),3.45(s,2H),2.64(s,3H),2.35～2.55(m,6H),1.63(d,J＝6.4Hz,6H),0.99(t,J＝6.7Hz,3H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ155.35,154.51,153.89,152.15,150.59,148.75,148.13,147.76,147.41,138.22,136.38,133.35,126.82,126.47,111.71,108.87,58.65,51.82,51.29,48.05,30.36,20.88,14.48,11.50。
HRMS(M+H)m/z:511.3017。
实施例4化合物I-4的制备
步骤1)N,N-二亚硝基哌嗪
向反应瓶中加入哌嗪(8.0g，93.0mmol)，0℃左右滴加2M HCl(104ml，208mmol)，0℃下搅拌10min后滴加NaNO2的水溶液(NaNO2，15.2g，水36ml)，30分钟左右滴加完毕，室温反应过夜。加热到35℃反应约1-2小时，0℃冷却析出，抽滤得淡黄色固体，真空干燥箱45℃烘干后得到N,N-二亚硝基哌嗪(12.32g)，收率92％。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ4.60(s,1.7H),4.46(t,J＝5.4Hz,2.3H),4.21(t,2.3H),3.88(s,1.7H)—(由氮上亚硝基两祌不同取向形成不可分离的两个异构体，-N-N＝O)。
13C-NMR(400MHz,CDCl3)：δ49.58,47.09,40.50,37.75(不可分离的两个异构体，-N-N＝O)
HRMS(ESI)m/z：144.0647。
步骤2)N,N-二亚硝基-[D8]哌嗪
向反应瓶中加入二亚硝基哌嗪(10.0g，69.4mmol)，甲醇钠(15.0g，277.7mmol)，氮气下缓慢加入重水(300mL，15.0mol)，80℃反应10小时。0℃下冷却析出，抽滤，真空干燥箱45℃烘干得式XV-1化合物(8.56g)，为淡黄色固体，收率82％。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)(对硝基苯甲醚做内标)：δ8.20(2H,d,J＝9.21Hz,Ph),6.96(2H,d,J＝9.21Hz,Ph),3.91(3H,s,CH3)(除内标分子氢峰外，无其它氢峰，哌嗪上氢全部被氘取代)。
HRMS(M+H)m/z：153.1212。
步骤3)[D8]哌嗪二盐酸盐
向反应瓶中加入二亚硝基-D8-哌嗪(3.0g，19.74mmol)、甲醇钠(5.99g，0.11mol)，缓慢加入重水(30mL，15.0mol)及D1-氘代乙醇(30mL)，冷却至室温后分多次加入Al-Ni合金(24.0g)，室温下反应过夜。抽滤，滤液常压蒸馏(130℃)，待液体全部蒸出后，缓慢滴加浓盐酸(4mL)。旋蒸除去溶剂得白色固体，真空干燥箱45℃烘干得XVI-1化合物(2.86g)，收率82％。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)(对硝基苯甲醚做内标)：δ8.20(2H,d,J＝9.27Hz,Ph),7.07(2H,d,J＝9.27Hz,Ph),3.91(3H,s,CH3)(除内标分子氢峰外，无其它氢峰，哌嗪上氢全部被氘取代)。
HRMS(M+H)m/z：95.1417。
步骤4)N-乙酰基-[D8]哌嗪
在25ml的单颈瓶中加入式XVI-1化合物(0.5g，2.99mmol)，水(5mL)，然后加Na2CO3调pH至8左右，冰浴下缓慢滴加醋酸酐(0.34mL，3.59mmol)，室温下搅拌10分钟。DCM萃取除去杂质，水相用2M的NaOH调pH至碱性，旋干得白色固体，DCM打浆，过滤后合并有机相，浓缩得式XVII-1化合物(0.23g)，为白色固体，收率56.5％。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)：δ2.02(3H,s,CH3)。
HRMS(M+H)m/z：137.1526。
步骤5)1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-乙酰基-[D8]哌嗪
用N-乙酰基-[D8]哌嗪代替N-乙基哌嗪，并参照实施例1步骤7所示方法制备式XXV-1化合物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)：δ8.29(1H,d,J＝1.65Hz,Py),7.62-7.66(1H,dd,J＝2.40Hz,8.16Hz,Py),7.43(1H,d,J＝8.10Hz,Py),3.48(2H,s,CH2),2.09(3H,s,CH3)。
HRMS(M+H)m/z：306.1057。
步骤6)1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-乙基-[D8]哌嗪
在100ml单颈瓶中加入式XXV-1化合物(3.07g，10.03mmol)，无水THF(35mL)，NaBH4(1.52g，40.10mmol)，分批加入AlCl3(5.35g，40.10mmol),室温反应过夜。加入2M盐酸至溶清，70℃回流1h，2M氢氧化钠溶液调pH至碱性，DCM萃取，无水硫酸钠干燥。柱层析分离纯化(DCM:MeOH＝5:1)得式XII-4化合物(1.91g)，为黄色液体，收率72％。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)：δ8.29(1H,d,J＝1.74Hz,Py),7.62-7.66(1H,dd,J＝2.40Hz,8.10Hz,Py),7.42(1H,d,J＝8.10Hz,Py),3.48(2H,s,CH2),2.40-2.47(2H,q,J＝7.23Hz,CH3 CH2 ),1.09(3H,t,J＝7.23Hz,CH3 CH2)。
HRMS(M+H)m/z：292.1245。
步骤7)5-(4-乙基-[D8]哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-胺
用1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-乙基-[D8]哌嗪代替1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-乙基-哌嗪，并参照实施例1步骤8)所示方法制备式V-4化合物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)：δ7.95(1H,d,J＝1.65Hz,Py),7.39-7.43(1H,dd,J＝2.04Hz,8.34Hz,Py),6.47(1H,d,J＝8.34Hz,Py),4.44(2H,s,NH2),3.37(2H,s,CH2),2.37-2.45(2H,q,J＝7.20Hz,CH3 CH2 ),1.07(3H,t,J＝7.20Hz,CH3 CH2)。
HRMS(M+H)m/z：229.2268。
步骤8)[5-(4-乙基-[D8]哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5基)-嘧啶-2-基]-胺
用6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并咪唑代替6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-[D3]甲基-1H-[5,7-D2]苯并咪唑，用5-(4-乙基-[D8]哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-胺代替5-(4-乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺，并参照实施例1步骤9所示方法制备式I-4化合物。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ10.08(s,1H),8.68(d,J＝3.7Hz,1H),8.29(s,1H),8.19～8.22(m,2H),7.64～7.70(m,2H),4.80～4.89(m,1H),3.43(s,2H),2.64(s,3H),2.30(q,J＝7.1Hz,2H),1.63(d,J＝6.7Hz,6H),0.96(t,J＝7.1Hz,3H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ155.34,154.51,153.89,152.11,150.59,148.73,148.08,147.78,147.42,138.17,136.36,133.35,127.01,126.47,111.69,108.90,58.71,52.12,51.47,48.05,20.88,14.49,11.98。
HRMS(M+H)m/z：515.3274。
实施例5化合物I-3的制备
步骤1)N-乙基-N-亚硝基哌嗪
用N-乙基哌嗪代替N-苄基哌嗪，并参照实施例2步骤3所示方法制备式XVIII-1化合物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)：δ4.28(2H,t,J＝5.13Hz,piper),3.86(2H,t,J＝5.28Hz,piper),2.67(2H,t,J＝5.22Hz,piper),2.47-2.54(2H,q,J＝7.20Hz,CH3 CH2 ),2.43(2H,t,J＝5.40Hz,piper),1.12(3H,t,J＝7.20Hz,CH3 CH2)。
HRMS(ESI)m/z：148.1383。
步骤2)4-乙基-1-亚硝基-[2,2,6,6-D4]哌嗪
用N-乙基-N-亚硝基哌嗪代替N-苄基-N-亚硝基哌嗪，并参照实施例2步骤4所示方法制备制备式XIX-1化合物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)：δ2.64(2H,s,piper),2.45-2.52(2H,q,J＝7.20Hz,CH3 CH2 ),2.40(2H,s,piper),1.11(3H,t,J＝7.20Hz,CH3 CH2)。
HRMS(ESI)m/z：147.1310。
步骤3)1-乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪盐酸盐
用N-乙基-N-亚硝基[2,2,6,6-D4]哌嗪代替N-苄基-N-亚硝基[2,2,6,6-D4]哌嗪，并参照实施例2步骤5所示方法制备制备式XI-a-1化合物
1H-NMR(300MHz,CDCl3)：δ3.06(4H,s,piper),2.81-2.88(2H,q,J＝7.23Hz,CH3 CH2 ),1.23(3H,t,J＝7.23Hz,CH3 CH2)。
HRMS(M+H)m/z：119.1479。
步骤4)1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-乙基-[2,2,6,6-D4]哌嗪
单颈瓶中加入式XI-a-1化合物(1.6g，10.34mmol)，氢氧化钠(0.41g，10.34mmol)，15mL甲醇，65℃回流3小时。冷却至室温后加硫酸镁搅拌0.5小时，抽滤，滤液旋干得乳白色固体。单颈瓶中加入上述乳白色固体(1.22g，10.32mmol)，6-溴-3-吡啶甲醛(2.30g，12.38mmol)，原甲酸三甲酯(2.26mL，20.64mmol)，甲酸(1.56mL，41.28mmol)，乙腈(5mL),80℃反应过夜。2M氢氧化钠溶液调pH至碱性，DCM萃取，无水硫酸钠干燥。柱层析分离纯化(DCM:MeOH＝5:1)得式XII-5化合物(1.16g)，为黄色液体。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)：δ8.29(1H,d,J＝1.65Hz,Py),7.52-7.56(1H,dd,J＝2.40Hz,8.16Hz,Py),7.43(1H,d,J＝8.10Hz,Py),3.48(2H,s,CH2-Py),2.40-2.51(8H,m,CH3CH2-piper),1.11(3H,t,J＝7.2Hz,CH3CH2)。
13C-NMR(CDCl3，300MHz)：δ160.64,150.59,139.27,133.11,127.73,59.09,52.99,52.34,51.77,11.85,11.64。
HRMS(M+H)m/z：288.1055。
步骤5)5-(4-乙基-[2,2,6,6-D4]哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-胺
用1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-乙基-[2,2,6,6-D4]哌嗪代替1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-乙基-哌嗪，并参照实施例1步骤8)所示方法制备式V-5化合物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)：δ7.94(1H,d,J＝1.65Hz,Py),7.39-7.42(1H,dd,J＝1.50Hz,8.31Hz,Py),6.47(1H,d,J＝8.34Hz,Py),4.47(2H,s,NH2),3.40(2H,s,CH2-Py),2.51-2.60(6H,m,CH3CH2-piper),1.15(3H,t,J＝7.2Hz,CH3CH2)。
13C-NMR(CDCl3，300MHz)：δ157.73,148.50,139.20,122.76,108.39,59.43,52.20,52.15,11.31。
HRMS(M+H)m/z：225.2004。
步骤6)[5-(4-乙基-[2,2,6,6-D4]哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5基)-嘧啶-2-基]-胺
用6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并咪唑代替6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-[D3]甲基-1H-[5,7-D2]苯并咪唑，用5-(4-乙基-[2,2,6,6-D4]哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-胺代替5-(4-乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺，并参照实施例1步骤9)所示方法制备式I-3化合物。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ10.12(s,1H),8.68(d,J＝3.4Hz,1H),8.29(s,1H),8.20～8.22(m,2H),7.66～7.70(m,2H),4.81～4.89(m,1H),3.43(s,2H),2.64(s,3H),2.29～2.34(m,6H),1.62(d,J＝6.4Hz,6H),0.96(t,J＝6.7Hz,3H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ155.37,154.54,153.89,152.14,150.60,148.76,148.10,147.70,147.44,138.20,136.38,133.36,126.98,126.49,111.72,108.89,58.64,52.12,51.55,48.06,20.89,14.51,11.90。
HRMS(M+H)m/z：511.3027。
实施例6化合物I-6的制备
方法一
步骤1)(6-氨基吡啶-3-基)(4-乙基哌嗪-1-基)甲酮
在单颈瓶中加入6-氨基烟酸(1.0g，7.24mmol)，DMF(20mL)，CDI(1.41g，8.68mmol)，70℃下搅拌10min，室温下搅拌1h后加入N-乙基哌嗪(1.84mL，14.48mmol)，室温下反应过夜。旋蒸除去溶剂，柱层析分离纯化(DCM:MeOH＝5:1)得式XIII-1化合物，为白色固体(1.44g)，收率85％。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)：δ8.18(1H,s,Py),7.53-7.57(1H,dd,J＝2.19Hz,8.49Hz,Py),6.49(1H,d,J＝8.49Hz,Py),4.77(2H,s,NH2),3.66(4H,s,piper),2.42-2.47(6H,m,piper-CH2 CH3),1.10(3H,t,J＝7.17Hz,CH3 CH2)。
13C-NMR(CDCl3，300MHz)：δ168.58,159.25,147.91,137.72,121.23,107.70,52.73,52.19,29.62,11.81。
HRMS(ESI)m/z：235.1550。
步骤2)5-(4-乙基哌嗪-1-基-[D2]甲基)-吡啶-2-胺
用(6-氨基吡啶-3-基)(4-乙基哌嗪-1-基)甲酮XIII-1代替N-苄基-N’-乙酰基-[3,3,5,5-D4]哌嗪，并参照实施例2步骤7)所示方法制备式V-7化合物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)：δ7.95(1H,s,Py),7.39-7.42(1H,dd,J＝1.50Hz,8.34Hz,Py),6.47(1H,d,J＝8.34Hz,Py),4.42(2H,s,NH2),2.39-2.48(10H,m,piper-CH2 CH3),1.08(3H,t,J＝7.20Hz,CH3 CH2)。
13C-NMR(CDCl3，300MHz)：δ157.67,148.59,139.10,123.07,108.26,52.58,11.81。
HRMS(ESI)m/z：223.1243。
步骤3)[5-(4-乙基哌嗪-1-基[D2]甲基)-吡啶-2-基]-[5氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5基)-嘧啶-2-基]-胺
用6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并咪唑代替6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-[D3]甲基-1H-[5,7-D2]苯并咪唑，用5-(4-乙基哌嗪-1-基-[D2]甲基)-吡啶-2-胺代替5-(4-乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺，并参照实施例1步骤9)所示方法制备式I-6化合物。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ10.08(s,1H),8.68(d,J＝3.4Hz,1H),8.29(s,1H),8.20～8.23(m,2H),7.66～7.70(m,2H),4.81～4.89(m,1H),2.64(s,3H),2.35～2.50(m,10H),1.63(d,J＝6.0Hz,6H),0.99(t,J＝6.6Hz,3H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ155.32,154.53,153.90,152.16,150.60,148.75,148.14,147.78,147.43,138.24,136.37,133.36,126.81,126.56,111.70,108.88,52.16,51.46,48.06,20.89,14.50,11.73。
HRMS(M+H)m/z：509.2907。
方法二
步骤1)(4-乙基哌嗪-1-基)(6-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)-嘧啶-3-基)甲酮
将式IV-2化合物(428mg，1.33mmol)、式XIII-1化合物(314mg，1.33mmol)、碳酸铯(532mg，2.66mmol)依次加入到二氧六环(15mL)中，氮气置换反应瓶中空气，加入三(二亚苄基丙酮)二钯(30mg)、9,9-二甲基-4,5-双二苯基膦氧杂蒽(50mg)。氮气保护下加热至反应液回流。3小时后反应液冷却至室温，加入30mL乙酸乙酯，减压抽滤除去无机盐及金属等不溶物。滤液加入20mL水，分液，水层加入20mL乙酸乙酯，分液，合并有机层，无水硫酸钠干燥后减压浓缩除去溶剂得类白色固体。柱层析纯化得式XIV-1化合物(395mg)，为白色固体。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ10.42(s,1H),8.72(d,1H),8.38(s,1H),8.33～8.29(m,2H),7.80(d,1H),7.68(d,1H),4.89～4.81(m,1H),3.40-3.32(m,4H),2.64(s,3H),2.39～2.33(m,6H),1.63(d,6H),1.01(t,3H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ166.88,155.05,154.60,153.90,152.39,150.34,149.02,147.60,147.00,136.96,136.42,133.35,126.30,124.78,110.89,109.0,107.26,52.25,51.42,48.09,20.91,14.54,11.83。
HRMS(M+H)m/z：521.2474。
步骤2)[5-(4-乙基哌嗪-1-基[D2]甲基)-吡啶-2-基]-[5氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5基)-嘧啶-2-基]-胺
将式XIV-1化合物(260mg，0.5mmol)溶于无水四氢呋喃(5mL)，依次加入硼氘化钠(41mg，1.0mmol)、氯化铝(134mg，1.0mmol)，反应瓶加热回流2h后补加硼氘化钠(21mg)，继续加热反应1h后冷却至室温。加入2M盐酸至反应液溶清，70℃加热回流1h后冷却至室温，用2M氢氧化钠溶液调pH至弱碱性，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥。柱层析分离纯化(DCM:MeOH＝5:1)得式I-6化合物(220mg)，为白色固体。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ10.08(s,1H),8.68(d,J＝3.4Hz,1H),8.29(s,1H),8.20～8.23(m,2H),7.66～7.70(m,2H),4.81～4.89(m,1H),2.64(s,3H),2.35～2.50(m,10H),1.63(d,J＝6.0Hz,6H),0.99(t,J＝6.6Hz,3H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ155.32,154.53,153.90,152.16,150.60,148.75,148.14,147.78,147.43,138.24,136.37,133.36,126.81,126.56,111.70,108.88,52.16,51.46,48.06,20.89,14.50,11.73。
HRMS(M+H)m/z：509.2907。
实施例7化合物I-5的制备
步骤1)(6-氨基吡啶-3-基)(4-乙酰基哌嗪-1-基)甲酮
用N-乙酰基哌嗪代替N-乙基哌嗪，并参照实施例7步骤1)所示方法制备式XXVI-1化合物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)：δ8.18(1H,s,Py),7.54-7.57(1H,dd,J＝1.65Hz,8.52Hz,Py),6.51(1H,d,J＝8.52Hz,Py),4.92(2H,s,NH2),3.51-3.66(8H,m,piper),2.13(3H,s,CH3)。
13C-NMR(CDCl3，300MHz)：δ169.17,159.46,147.87,137.90,120.48,107.95,41.45,29.65,21.31。
HRMS(ESI)m/z：249.1532。
步骤2)5-(4-[1,1-D2]乙基哌嗪-1-基-[D2]甲基)-吡啶-2-胺
用(6-氨基吡啶-3-基)(4-乙酰基哌嗪-1-基)甲酮代替N-苄基-N’-乙酰基-[3,3,5,5-D4]哌嗪，并用双倍量[D4]硼氘化钠，并参照实施例2步骤7)所示方法制备式V-8化合物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)：δ7.95(1H,d,J＝1.62Hz,Py),7.39-7.42(1H,dd,J＝2.07Hz,8.34Hz,Py),6.47(1H,d,J＝8.34Hz,Py),4.44(2H,s,NH2),2.40-2.50(8H,m,piper),1.07(3H,s,CH3)。
13C-NMR(CDCl3，300MHz)：δ157.67,148.56,139.12,120.98,108.28,52.52,11.49。
HRMS(ESI)m/z：225.2022。
步骤3)[5-(4-[1,1-D2]乙基哌嗪-1-基-[D2]甲基)-吡啶-2-基]-[5氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5基)-嘧啶-2-基]-胺
用6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并咪唑代替6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-[D3]甲基-1H-[5,7-D2]苯并咪唑，用5-(4-[1,1-D2]乙基哌嗪-1-基-[D2]甲基)-吡啶-2-胺代替5-(4-乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺，并参照实施例1步骤9)所示方法制备式I-5化合物。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ9.99(s,1H),8.67(d,J＝2.7Hz,1H),8.29(s,1H),8.18～8.21(m,2H),7.66～7.70(m,2H),4.81～4.89(m,1H),2.64(s,3H),2.35～2.50(m,8H),1.63(d,J＝6.5Hz,6H),0.96(s,3H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ155.34,154.50,153.88,152.12,150.58,148.74,148.10,147.76,147.40,138.19,136.37,133.34,126.82,126.55,111.71,108.86,52.17,48.03,20.87,14.47,11.56。
HRMS(M+H)m/z：511.3033。
实施例8化合物I-7的制备
[5-(4-[1,1-D2]乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-[D3]甲基-3H-[5,7-D2]苯并咪唑-5基)-嘧啶-2-基]-胺
用5-(4-[1,1-D2]乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-胺代替5-(4-乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺，并参照实施例1步骤9)所示方法制备式I-7化合物。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ10.09(s,1H),8.69(d,J＝3.7Hz,1H),8.20(d,J＝6.4Hz,2H),7.66(d,J＝8.4Hz,2H),4.80～4.89(m,1H),3.44(s,2H),2.40～2.55(m,8H),1.63(d,J＝6.8Hz,6H),0.96(s,3H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ155.36,154.48,153.85,152.13,150.56,148.75,148.09,147.78,147.43,138.19,136.28,133.40,126.95,126.32,111.71,58.74,52.36,52.21,48.03,20.89,11.64。
HRMS(M+H)m/z：514.3224。
实施例9化合物I-8的制备
[5-(4-乙基哌嗪-1-基-[D2]甲基)-吡啶-2-基]-[5氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-[D3]甲基-3H-[5,7-D2]苯并咪唑-5基)-嘧啶-2-基]-胺
用5-(4-乙基哌嗪-1-基-[D2]甲基)-吡啶-2-胺代替5-(4-乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺，并参照实施例1步骤9)所示方法制备式I-8化合物。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ10.09(s,1H),8.68(d,J＝3.7Hz,1H),8.20(d,J＝6.4Hz,2H),7.66(d,J＝8.4Hz,2H),4.80～4.89(m,1H),2.40～2.55(m,10H),1.63(d,J＝6.8Hz,6H),0.97(t,J＝6.7Hz,3H)。
HRMS(M+H)m/z：514.3212。
实施例10化合物I-35的制备
步骤1)4-甲基苯磺酸[D5]乙酯
将氢氧化钠(15.4g，385mmol)溶于水配成26mL溶液，冰浴条件下加入D6乙醇。将对甲苯磺酰氯(15.8g，84.49mmol)溶于四氢呋喃(26mL)，缓慢滴加到上述溶液中，室温搅拌反应2小时。反应液加入乙酸乙酯50mL，充分搅拌后分液，水层再次加入50mL乙酸乙酯，分液，合并有机层，加入无水硫酸钠干燥，减压浓缩得无色粘稠液体17.5g。
1H-NMR(500MHz,DMSO)：δ7.80(2H,d,J＝8.0Hz,Py),7.35(2H,d,J＝8.0Hz,Py),2.45(3H,s,CH3)。
13C-NMR(DMSO,500MHz)：144.73,133.24,129.86,127.84,21.63。
HRMS(ESI)m/z：171.0121。
m/z 171.0121为对甲苯磺酸的[M-H]-，对甲苯磺酸乙酯在离子源中很容易裂解成对甲苯磺酸，所以采集不到甲苯磺酸乙酯的离子。
步骤2)N-苄基-N’-[D5]乙基哌嗪
将乙腈(10mL)加入到25mL单口烧瓶中，依次加入4-甲基苯磺酸[D5]乙酯(2.05g，10mmol)，苄基哌嗪(1.76g，10mmol)，碳酸钾(1.65g，12mmol)，开启加热至反应液回流，3小时后TLC显示反应基本完全。反应液用乙酸乙酯萃取至水层无产物，有机层用无水硫酸酸钠干燥后旋蒸得无色粘稠液体，柱层析纯化得无色粘稠液体1.80g。
1H-NMR(500MHz,DMSO)：δ7.25-7.33(5H,m,Py),3.54(2H,s,-CH2),2.57(8H,s)。
13C-NMR(DMSO,500MHz)：138.09,129.25,128.21,127.03,63.09,53.00,52.74。
HRMS(ESI)m/z：210.2116。
步骤3)N-[D5]乙基哌嗪
用N-苄基-N’-[D5]乙基哌嗪代替N-苄基-N’-[1,1-D2]乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪，并参照实施例2步骤8所示方法制备式XI-4化合物。
1H-NMR(500MHz,DMSO)：δ2.93(4H,t,J＝5.0Hz),2.43-2.46(4H,m)。
13C-NMR(DMSO,500MHz)：52.77,45.25。
HRMS(ESI)m/z：120.1540。
步骤4)(6-氨基吡啶-3-基)(4-[D5]乙基哌嗪-1-基)甲酮
用N-[D5]乙基哌嗪代替乙基哌嗪，并参照实施例7，方法一中步骤1所示方法制备式XIII-2化合物。
1H-NMR(300MHz,DMSO)：δ7.74(1H,d,J＝3.00Hz,Py),7.40-7.41(1H,dd,J＝3.00Hz,Py),7.02(1H,s,Py),6.35(2H,s,NH2),3.49(4H,t,J＝9.00Hz,piper),2.36(4H,t,J＝9.00Hz,piper)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：167.94,160.49,147.87,136.76,121.62,118.87,106.77,52.24,39.78。
HRMS(ESI)m/z：240.1872。
步骤5)5-(4-[D5]乙基哌嗪-1-基-[D2]甲基)-吡啶-2-胺
用(6-氨基吡啶-3-基)(4-[D5]乙基哌嗪-1-基)甲酮XIII-2代替N-苄基-N’-乙酰基-[3,3,5,5-D4]哌嗪，并参照实施例2步骤7)所示方法制备式V-9化合物。
1H-NMR(300MHz,DMSO)：δ7.75(1H,s,Py),7.25-7.28(1H,dd,J＝9.00Hz,Py),6.40(1H,d,J＝9.00Hz,Py),5.80(2H,s,NH2),2.25-2.50(8H,m,piper)。
13C-NMR(DMSO，300MHz)：δ158.14,148.92,137.56,122.04,109.64,55.96,11.59。
HRMS(ESI)m/z：227.2127。
步骤6)[5-(4-[D5]乙基哌嗪-1-基-[D2]甲基)-吡啶-2-基]-[5氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5基)-嘧啶-2-基]-胺
用6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并咪唑代替6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-[D3]甲基-1H-[5,7-D2]苯并咪唑，用5-(4-[D5]乙基哌嗪-1-基-[D2]甲基)-吡啶-2-胺代替5-(4-乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺，并参照实施例1步骤9)所示方法制备式I-35化合物。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ10.10(s,1H),8.69(s,1H),8.30(s,1H),8.19～8.22(m,2H),7.66～7.70(m,2H),4.81～4.89(m,1H),2.64(s,3H),2.35～2.50(m,8H),1.63(d,J＝5.2Hz,6H)。
HRMS(M+H)m/z：514.3229。
实施例11化合物I-36的制备
步骤1)[5-(4-[D5]乙基哌嗪-1-基-[D2]甲基)-吡啶-2-基]-[5氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-[D3]甲基-3H-[5,7-D2]苯并咪唑-5基)-嘧啶-2-基]-胺
用5-(4-[D5]乙基哌嗪-1-基-[D2]甲基)-吡啶-2-胺代替5-(4-乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺，并参照实施例1步骤9)所示方法制备式I-36化合物。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ10.12(s,1H),8.69(d,J＝3.8Hz,1H),8.20(d,J＝6.5Hz,2H),7.66(d,J＝8.9Hz,1H),4.80～4.89(m,1H),2.40～2.55(m,8H),1.63(d,J＝6.8Hz,6H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ155.39,154.54,153.87,152.20,150.57,148.78,148.18,147.84,147.49,138.28,136.29,126.80,126.34,111.75,52.20,48.08,20.93。
HRMS(M+H)m/z：519.3531。
实施例12化合物I-37的制备
步骤1)[5-(4-[1,1-D2]乙基哌嗪-1-基-[D2]甲基)-吡啶-2-基]-[5氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-[D3]甲基-3H-[5,7-D2]苯并咪唑-5基)-嘧啶-2-基]-胺
用5-(4-[1,1-D2]乙基哌嗪-1-基-[D2]甲基)-吡啶-2-胺代替5-(4-乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺，并参照实施例1步骤9)所示方法制备式I-37化合物。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ10.10(s,1H),8.69(d,J＝3.9Hz,1H),8.20(d,J＝5.2Hz,2H),7.66(dd,J1＝2.1Hz,J2＝8.7Hz,1H),4.80～4.89(m,1H),2.30～2.42(m,8H),1.63(d,J＝6.9Hz,6H),0.95(s,3H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ155.37,154.54,153.86,152.17,150.57,148.97,148.78,147.85,147.50,138.26,126.90,111.77,52.40,48.07,20.92,11.77。
HRMS(M+H)m/z：516.3344。
实施例13化合物I-38的制备
步骤1)(6-氨基吡啶-3-基)(4-乙酰基-[D8]哌嗪-1-基)甲酮
用N-乙酰基-[D8]哌嗪代替N-乙基哌嗪，并参照实施例8步骤1)所示方法制备式XXVI-2化合物。
1H-NMR(300MHz,DMSO)：δ8.19(1H,d,J＝2.0Hz,Py),7.56-7.58(1H,dd,J1＝2.0Hz,J2＝8.5Hz,Py),6.52(1H,d,J＝8.5Hz,Py),4.90(2H,s,NH2),2.14(3H,s,CH3)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ169.28,159.58,148.07,137.88,120.46,107.91,21.40。
HRMS(ESI)m/z：257.1858。
步骤2)5-(4-[1,1-D2]乙基-[D8]哌嗪-1-基-[D2]甲基)-吡啶-2-胺
用(6-氨基吡啶-3-基)(4-乙酰基-[D8]哌嗪-1-基)甲酮代替N-苄基-N’-乙酰基-[3,3,5,5-D4]哌嗪，并用双倍量[D4]硼氘化钠，并参照实施例2步骤7)所示方法制备式V-10化合物。
1H-NMR(300MHz,DMSO)：δ7.74(1H,s,Py),7.24-7.27(1H,dd,J＝9.00Hz,Py),6.38(1H,d,J＝9.00Hz,Py),5.78(2H,s,NH2),0.94(3H,s,CH3)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ158.52,148.36,137.48,122.10,109.14,61.82,10.65。
HRMS(ESI)m/z：232.2441。
步骤3)[5-(4-[1,1-D2]乙基-[D8]哌嗪-1-基-[D2]甲基)-吡啶-2-基]-[5氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-[D3]甲基-3H-[5,7-D2]苯并咪唑-5基)-嘧啶-2-基]-胺
用5-(4-[1,1-D2]乙基[D8]哌嗪-1-基-[D2]甲基)-吡啶-2-胺代替5-(4-乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺，并参照实施例1步骤9)所示方法制备式I-38化合物。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ10.10(s,1H),8.69(d,J＝3.9Hz,1H),8.20(d,J＝5.0Hz,2H),7.66(dd,J1＝2.1Hz,J2＝8.7Hz,1H),4.80～4.89(m,1H),1.63(d,J＝6.9Hz,6H),0.96(s,3H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ155.42,154.56,153.87,152.19,148.79,148.18,147.86,147.51,138.29,126.86,111.78,48.08,20.93,11.61。
HRMS(M+H)m/z：524.3854。
实施例14化合物I-24的制备
步骤1)N-[D7]异丙基-乙酰胺
将D8异丙醇(5.7g，83.2mmol)溶于乙腈(85.38g，2.1mol)中，加热至60℃，一次性加入10ml浓硫酸，反应体系剧烈放热，关闭加热，回流装置回流，水流加大；待温度降至50℃，打开加热，重复上述操作，继续加浓硫酸，共加入浓硫酸30ml(0.56mol)。TLC跟踪，待反应完，将反应体系倒入冰水中，用NaOH水溶液中和反应体系。用DCM萃取两次，用NaCl水溶液洗涤两次，干燥，减压蒸馏除去溶剂，***稀释，并加入10g K2CO3，常温打浆2h。过滤，减压浓缩得到8.7g淡黄色油状物。产率：96％。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)：δ1.95(s,3H)。
13C-NMR(CDCl3,300MHz)：δ171.81,77.0,24.72,23.17。
HRMS(M+H)m/z：109.1349。
步骤2)N-(4-溴-2,6-二氟苯基)-N’-[D7]异丙基-乙眯
用N-[D7]异丙基-乙酰胺代替N-异丙基-乙酰胺，并参照实施例1步骤2)所示方法制备式IX-2化合物。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)：δ7.03(d,J＝6.12Hz,2H),4.45(s,1H),1.76(s,3H)。
13C-NMR(CDCl3,300MHz)：δ157.19,153.98,115.32,115.17,115.09,114.95,77.42,77.00,76.57,18.72,18.66。
HRMS(M+H)m/z：298.0751。
步骤3)6-溴-4-氟-1-[D7]异丙基-2-甲基-1H-苯并咪唑
用N-(4-溴-2,6-二氟苯基)-N’-[D7]异丙基-乙眯代替N-(4-溴-2,6-二氟苯基)-N’-异丙基-乙眯，并参照实施例1步骤3)所示方法制备式II-3化合物。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)：δ7.41(d,J＝1.17Hz,1H),7.08(dd,J1＝1.26Hz,J2＝9.6Hz,1H),2.63(s,3H)。
13C-NMR(CDCl3,300MHz)：δ154.76,151.94,111.45,111.17,110.34,110.28,77.42,77.00,76.57,14.78。
HRMS(M+H)m/z：278.0684。
步骤4)4-氟-1-[D7]异丙基-2-甲基-6-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-苯并咪唑
用6-溴-4-氟-1-[D7]异丙基-2-甲基-1H-苯并咪唑代替6-溴-4-氟-1-异丙基-2-[D3]甲基-1H-[5,7-D2]苯并咪唑，并参照实施例1步骤5)所示方法制备式III-3化合物。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)：δ7.69(s,1H),7.37(m,1H),2.68(s,3H),1.36(s,12H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ152.03,113.60,113.56,113.18,112.97,84.03,77.41,76.99,76.57,24.87,14.84。
HRMS(M+H)m/z：326.2423。
步骤5)6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-[D7]异丙基-2-甲基-1H-苯并咪唑
用4-氟-1-[D7]异丙基-2-甲基-6-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-苯并咪唑代替4-氟-1-异丙基-2-[D3]甲基-6-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-[5,7-D2]苯并咪唑，并参照实施例1步骤6)所示方法制备式IV-3化合物。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)：δ8.51(d,J＝3.42Hz,1H),8.15(s,1H),7.80(d,J＝11.49Hz),2.70(s,3H)。
13C-NMR(CDCl3,300MHz)：δ156.63,154.22,151.66,148.57,148.21,108.88,108.76,108.51,108.40,108.24,108.13,15.17。
HRMS(M+H)m/z：330.1079。
步骤6)[5-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5氟-4-(7-氟-3-[D7]异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5基)-嘧啶-2-基]-胺
用6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-[D7]异丙基-2-甲基-1H-苯并咪唑代替6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-[D3]甲基-1H-[5,7-D2]苯并咪唑，并参照实施例1步骤9)所示方法制备式I-24化合物。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)：δ8.41(m,2H),8.26(s,1H),8.18(s,1H),7.79(d,J＝11.64Hz,1H),7.68(m,1H),3.53(s,2H),2.69～2.64(m,5H),2.56(t,J＝7.29Hz,8H),1.18(t,J＝7.14Hz,3H)。
13C-NMR(CDCl3,300MHz)：δ154.69,153.11,151.64,148.84,146.81,146.45,138.48,135.90,127.65,126.89,126.41,108.23,108.12,108.08,107.79,107.52,107.42,76.93,59.07,51.91,51.73,51.53,14.51,10.78。
HRMS(M+H)m/z：514.3225。
实施例15化合物I-39的制备
步骤1)[5-(4-[D5]乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5氟-4-(7-氟-3-[D7]异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5基)-嘧啶-2-基]-胺
用6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-[D7]异丙基-2-甲基-1H-苯并咪唑代替6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-[D3]甲基-1H-[5,7-D2]苯并咪唑，用5-(4-[D5]乙基哌嗪-1-基-甲基)-吡啶-2-胺代替5-(4-乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺，并参照实施例1步骤9)所示方法制备式I-39化合物。
1H-NMR(DMSO,500MHz):δ10.08(s,1H),8.68(d,J＝3.5Hz,1H),8.29(s,1H),8.20～8.21(m,2H),7.65～7.69(m,2H),3.44(s,2H),2.64(s,3H),2.34～2.49(m,8H)。
13C-NMR(DMSO,500MHz):155.86,153.74,152.66,151.97,150.55,149.55,148.63,138.74,136.82,133.69,127.47,112.26,109.33,107.49,59.25,52.85,15.01。
HRMS(M+H)m/z：519.3573。
实施例16化合物I-17的制备
步骤1)N-苄基-N’-[D5]乙基[3,3,5,5-D4]哌嗪
用N-苄基-[3,3,5,5-D4]哌嗪代替苄基哌嗪，并参照实施例11步骤2所示方法制备式XXIV-4化合物。
步骤2)N-[1,1,2,2,2-D5]乙基-[2,2,6,6-D4]哌嗪
用N-苄基-N’-[D5]乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪代替N-苄基-N’-[1,1-D2]乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪，并参照实施例2步骤8所示方法制备式XI-5化合物。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)：δ2.86(s,4H)。
13C-NMR(CDCl3,500MHz)：δ45.74。
HRMS(M+H)m/z：124.1788。
步骤3)1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-[1,1,2,2,2-D5]乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪
用N-[D5]乙基-[2,2,6,6-D4]哌嗪代替N-[1,1-D2]乙基-[2,2,6,6-D4]哌嗪，并参照实施例2步骤9)所示方法制备式XII-7化合物。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)：δ8.33(d,J＝2Hz,1H),7.47(d,J＝8.2Hz,1H),7.50(dd,J＝8.2Hz,2.0Hz,1H),3.6(s,2H),3.03(s,2H),2.90(s,2H)。
13C-NMR(CDCl3,500MHz)：δ150.7,141.5,139.2,131.9,128.0,58.4,50.6,49.0,49.0,37.0。
HRMS(M+H)m/z：293.1619。
步骤4)5-(4-[1,1,2,2,2-D5]乙基-[3,3,5,5--D4]哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺
用1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-[D5]乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪代替1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-[1,1-D2]乙基-[3,3,5,5-D4]哌嗪，并参照实施例2步骤10所示方法制备式V-12化合物。
1H-NMR(CDCl3,500MHz):δ7.97(d,J＝2.2Hz,1H),7.43(dd,J＝8.4Hz,2.2Hz,1H),6.49(d,J＝8.4Hz,1H),4.43(s,2H),3.40(s,2H),2.50(s,4H)。
13C-NMR(CDCl3,500MHz)：δ157.7,148.6,139.2,123.2,108.4,59.8,52.4。
HRMS(ESI)m/z：230.2323。
步骤5)[5-(4-[1,1,2,2,2-D5]乙基-[3,3,5,5--D4]哌嗪-1-基-甲基)-吡啶-2-基]-[5氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5基)-嘧啶-2-基]-胺
用6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并咪唑代替6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-[D3]甲基-1H-[5,7-D2]苯并咪唑，用5-(4-[D5]乙基[2,2,6,6-D4]哌嗪-1-基-甲基)-吡啶-2-胺代替5-(4-乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺，并参照实施例1步骤9)所示方法制备式I-17化合物。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)：δ8.48(m,1H),8.41(d,J＝8.25Hz,1H),8.29(d,J＝1.5Hz,1H),8.21(d,J＝1.0Hz,1H),7.81(d,J＝11.5Hz,1H),7.71(m,1H),4.76(quintet,J＝7Hz,1H),3.53(s,2H),2.71(s,3H),2.65(s,4H),1.73(d,J＝7Hz,6H)。
13C-NMR(CDCl3,500MHz)：154.32,153.62,152.08,150.00,148.72,136.47,136.39,134.18,134.05,127.42,111.42,108.75,108.24,108.18,108.02,59.77,52.40,48.66,21.48,15.07。
HRMS(M+H)m/z：516.3403。
参考实施例1化合物I-2的制备
步骤1)1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-乙酰基-哌嗪
用N-乙酰基哌嗪代替N-乙基哌嗪，并参照实施例1步骤7)所示方法制备式XXV-2化合物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)：δ8.29(1H,d,J＝1.65Hz,Py),7.55-7.58(1H,dd,J＝1.74Hz,8.10Hz,Py),7.46(1H,d,J＝8.10Hz,Py),3.62(2H,t,J＝4.77Hz,piper),3.49(2H,s,CH2-Py),3.46(2H,t,J＝4.86Hz,piper),2.40-2.44(4H,m,piper),2.08(3H,s,CH3)。
13C-NMR(CDCl3，300MHz)：δ150.48,141.03,139.20,132.61,127.88,59.10,52.93,52.65,46.10,41.24,21.24。
HRMS(M+H)m/z：298.0549。
步骤2)1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-[1,1-D2]乙基哌嗪
用1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-乙酰基-哌嗪代替N-苄基-N’-乙酰基-[3,3,5,5-D4]哌嗪，并参照实施例2步骤7)所示方法制备式XII-6化合物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)：δ8.29(1H,d,J＝1.74Hz,Py),7.52-7.56(1H,dd,J＝1.98Hz,8.10Hz,Py),7.43(1H,d,J＝8.10Hz,Py),3.47(2H,s,CH2),2.50(8H,s,piper),1.08(3H,s,CH3 CD2)。
13C-NMR(CDCl3，300MHz)：δ150.59,140.73,139.28,133.18,127.73,59.25,52.84,52.54,11.56。
HRMS(M+H)m/z：286.0879。
步骤3)5-(4-[1,1-D2]乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-胺
用1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-[1,1-D2]乙基哌嗪代替1-(6-溴-吡啶-3-基甲基)-4-乙基-哌嗪，并参照实施例1步骤8)所示方法制备式V-6化合物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)：δ7.95(1H,d,J＝1.65Hz,Py),7.39-7.42(1H,dd,J＝1.50Hz,8.31Hz,Py),6.47(1H,d,J＝8.31Hz,Py),4.42(2H,s,NH2),3.37(2H,s,CH2),2.47(8H,s,piper),1.05(3H,s,CH3 CD2)。
13C-NMR(CDCl3，300MHz)：δ157.63,148.58,139.11,123.27,108.26,59.79,52.77,52.63,11.65。
HRMS(ESI)m/z：223.1890。
步骤4)[5-(4-[1,1-D2]乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5基)-嘧啶-2-基]-胺
用6--(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并咪唑代替6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-[D3]甲基-1H-[5,7-D2]苯并咪唑，用5-(4-[1,1-D2]乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-胺代替5-(4-乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺，并参照实施例1步骤9)所示方法制备式I-2化合物。
1H-NMR(DMSO,300MHz)：δ10.06(s,1H),8.69(d,J＝3.4Hz,1H),8.29(s,1H),8.20～8.22(m,2H),7.65～7.69(m,2H),4.81～4.89(m,1H),3.47(s,2H),2.65(s,3H),2.40～2.55(m,8H),1.63(d,J＝6.4Hz,6H),0.84(s,3H)。
13C-NMR(DMSO,300MHz)：δ155.37,154.54,153.89,152.14,150.60,148.76,148.10,147.70,147.44,138.20,136.38,133.36,126.98,126.49,111.72,108.89,58.64,52.12,51.55,48.06,20.89,14.51,11.90。
HRMS(M+H)m/z：509.2899。
参考实施例2化合物I-16的制备
步骤1)5-(4-[D5]乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-胺
用(6-氨基吡啶-3-基)(4-[D5]乙基哌嗪-1-基)甲酮XIII-2代替N-苄基-N’-乙酰基-[3,3,5,5-D4]哌嗪，并参照实施例2步骤7)所示方法制备式V-11化合物。
1H-NMR(300MHz,DMSO):δ7.74(1H,s,Py),7.24-7.27(1H,dd,J＝9.00Hz,Py),6.39(1H,d,J＝9.00Hz,Py),5.76(2H,s,NH2),3.23(2H,s,-CH2),2.32-2.50(8H,m,piper)。
13C-NMR(DMSO,300MHz):158.95,147.97,138.07,120.75,107.52,59.09,39.52。
HRMS(ESI)m/z：226.2084。
步骤2)[5-(4-[D5]乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5基)-嘧啶-2-基]-胺
用6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并咪唑代替6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-[D3]甲基-1H-[5,7-D2]苯并咪唑，用5-(4-[D5]乙基哌嗪-1-基-甲基)-吡啶-2-胺代替5-(4-乙基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基胺，并参照实施例1步骤9)所示方法制备式I-16化合物。
1H-NMR(DMSO,500MHz)：δ10.09(s,1H),8.68(d,J＝4.0Hz,1H),8.29(s,1H),8.20～8.21(m,2H),7.66～7.69(m,2H),4.82～4.87(m,1H),3.45(s,2H),2.64(s,3H),2.35～2.48(m,8H),1.63(d,J＝7.0Hz,6H)。
13C-NMR(DMSO,500MHz):δ155.88,153.75,152.71,151.77,150.62,149.96,148.26,138.78,136.79,133.82,127.30,112.27,107.59,59.13,52.52,48.59,21.42,15.03。
HRMS(M+H)m/z：512.3152。
实施例17CDK4抑制活性分析
实验步骤
制备ATP和多肽底物Ulight-4E-BP1(Thr37/46)(PerkinElmer公司CatNO.TRF0128-D)溶液，得到稀释在50mM HEPES、10mM MgCl2、10mM EGTA、2mM DTT、0.01％Tween 20的激酶缓冲液中的终浓度为70μM ATP和50nM Ulight-4E-BP1(Thr37/46)。制备酶溶液，获得稀释在上述激酶缓冲液中终浓度为0.5ng/μL的CDK4酶(CARNA Biosciences公司Cat NO.04-105)。将2μL在0.02％DMSO中的试验化合物，4μL ATP与多肽底物Ulight-4E-BP1(Thr37/46)溶液及4μL酶溶液在低体积384孔板中混合。将试验化合物以1:3系列稀释在0.02％DMSO中，产生8个点的曲线，起始浓度为400nM，不添加试验化合物的单独0.02％DMSO缓冲液对照，激酶缓冲液作为不存在酶活时的背景信号，将试剂混合，离心1分钟(2500转/分钟)并且封膜后在25℃温育60分钟，通过添加5μL 40mM EDTA终止反应(终浓度10mM)，后加入5μL 8nM(终浓度2nM)Eu-anti-P-4E-BP1(Thr37/46)(PerkinElmer公司CatNO.TRF0216-D)到检测板中，混匀，离心1分钟(2500转/分钟)封膜后继续在25℃温育60分钟，后放入多功能读板仪(Molecular Devices公司型号Paradigm)采用HTRF模块检测数值。
实验结果
表1.化合物对CDK4抑制IC50值(nM)
采用四参数拟合方式，对检测结果的抑制率拟合曲线计算IC50值，见上表1，所筛选的I-1、I-2、I-3、I-4、I-5、I-6、I-7、I-8、I-9及I-10与阳性化合物LY-2835219结果接近，均小于2nM。实验结果证实以上化合物均为优异的CDK4抑制剂。
实施例18 CDK6抑制活性分析
实验步骤
制备ATP和多肽底物Ulight-4E-BP1(Thr37/46)(PerkinElmer公司CatNO.TRF0128-D)溶液，得到稀释在50mMHEPES、10mM MgCl2、10mM EGTA、2mM DTT、0.01％Tween 20的激酶缓冲液中的终浓度为70μMATP和50nMUlight-4E-BP1(Thr37/46)。制备酶溶液，获得稀释在上述激酶缓冲液中终浓度为0.5ng/μL的CDK6酶(CARNA Biosciences公司Cat NO.04-107)。将2μL在0.02％DMSO中的试验化合物，4μL ATP与多肽底物Ulight-4E-BP1(Thr37/46)溶液及4μL酶溶液在低体积384孔板中混合。将试验化合物以1:3系列稀释在0.02％DMSO中，产生7个点的曲线，起始浓度为100nM，不添加试验化合物的单独0.02％DMSO缓冲液对照，激酶缓冲液作为不存在酶活时的背景信号，将试剂混合，离心1分钟(2500转/分钟)并且封膜后在25℃温育60分钟，通过添加5μL 40mM EDTA终止反应(终浓度10mM)，后加入5μL 8nM(终浓度2nM)Eu-anti-P-4E-BP1(Thr37/46)(PerkinElmer公司CatNO.TRF0216-D)到检测板中，混匀，离心1分钟(2500转/分钟)封膜后继续在25℃温育60分钟，后放入多功能读板仪(Molecular Devices公司型号Paradigm)采用HTRF模块检测数值。
实验结果
表2.化合物对CDK6抑制IC50值(nM)
采用四参数拟合方式，对检测结果的抑制率拟合曲线计算IC50值，见上表2，所筛选的I-1、I-2、I-3、I-4、I-5、I-6、I-7、I-8、I-9、I-10及对照物LY-2835219化合物抑制CDK6活性相近，均小于5nM。结果证实以上化合物均为优异的CDK6抑制剂。
实施例19在人肝微粒体中稳定性研究
300μL最终的温孵体系中，含30μL肝微粒体(蛋白浓度：0.15mg/mL)，30μL NADPH+MgCl2，3μL底物，237μL PBS缓冲液。其中有机溶剂(乙腈)的比例为1％。每个种属做2份，每份0.3mL。每管先配好总体积为270μL的底物及酶的混匀液，和NADPH分别在37℃预温孵5min后，加入30μL NADPH+MgCl2混合，分别于0、15、30、60、120min取出50μL用含内标的冰乙腈300μL终止反应。另外分别做3份空白(KB)各300μL，分别为KB1：不加NADPH；KB2：不加底物；KB3：不加酶。
吸取50μL温孵样品，加入300μL含内标的冰乙腈沉淀，涡旋震荡5min后，离心(8800rpm，4℃)10min。吸取上清液100μL至进样瓶中，0.5μL进样分析。相关化合物在人肝微粒体中消除参数见表3。
表3 相关化合物体外人肝微粒体代谢稳定性
实施例20大鼠中的药代动力学评价
SD大鼠，体重200～220g，适应3-5天后，随机分为7组，每组3只，分别给予10mg/kg剂量的化合物:Abemaciclib、I-4、I-5、I-8、I-9、I-10。
受试动物(SD大鼠)给药前禁食12h，给药后4h给食物，实验前后和实验过程中均自由饮水。
灌胃给药后，于0min、15min、30min、1h、3h、4h、5h、6h、8h、10h、24h于眼眶取血0.10mL左右，EDTA-K2抗凝，立即将血样放置冰中，30min内转移到4℃，4000rpm，10min条件下离心分离血浆。收集全部血浆后立即于-20℃保存待测。
吸取40μL待测血浆样品和标曲样品，加入200μL含内标的甲醇溶液，振荡混匀5min，13000rpm离心10min，取上清80μL，吸取1μL用于LC/MS/MS测定，记录色谱图。
通过大鼠体内药物动力学实验评估本发明化合物的口服生物利用度。一些代表性化合物的药代参数如下表所示。
表4 相关化合物的药代参数
Claims (5)
1.如下所示化合物或其药学上可接受的盐：
2.如下所示化合物或其药学上可接受的盐：
3.一种药物组合物，其包含权利要求1-2中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
4.权利要求1-2中任一项的化合物或权利要求3的药物组合物在制备治疗癌症药物中的用途。
5.权利要求4的用途，其中所述的癌症选自结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、***癌、胶质母细胞瘤、套细胞淋巴瘤、慢性粒细胞白血病或急性粒细胞白血病。
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