CN106459967A - 使用模板转换和标签化的多重单细胞基因表达分析 - Google Patents

使用模板转换和标签化的多重单细胞基因表达分析 Download PDF

Info

Publication number
CN106459967A
CN106459967A CN201580033171.7A CN201580033171A CN106459967A CN 106459967 A CN106459967 A CN 106459967A CN 201580033171 A CN201580033171 A CN 201580033171A CN 106459967 A CN106459967 A CN 106459967A
Authority
CN
China
Prior art keywords
droplet
sequence
cdna
bead
chain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580033171.7A
Other languages
English (en)
Inventor
菲奥娜·卡帕
范建兵
倪拉吉·沙拉提亚
戈登·M·卡恩
阿拉什·吉马斯迪
艾利克斯·阿拉瓦尼斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ILLUMINA公司
Illumina Inc
Original Assignee
Illumina Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Illumina Inc filed Critical Illumina Inc
Publication of CN106459967A publication Critical patent/CN106459967A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1065—Preparation or screening of tagged libraries, e.g. tagged microorganisms by STM-mutagenesis, tagged polynucleotides, gene tags
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms

Abstract

本文提供用于多重单细胞基因表达分析的方法和组合物。一些方法和组合物包括具有诸如唯一性分子条形码(UMI)的唯一性条形码的小滴和/或珠粒的使用。

Description

使用模板转换和标签化的多重单细胞基因表达分析
相关申请
本申请要求于2014年4月29日提交的美国临时申请号为61/985,983以及于2014年5月1日提交的美国临时申请号为61/987,433的优先权，所述临时申请通过引用的方式以其全部并入本文。
政府支持
本发明是在公共卫生署(PHS)授予的国家卫生研究院(NIH)基金号为MH098977的政府支持下完成的。政府在本发明中具有一定权利。
背景技术
对细胞或组织的mRNA含量进行测定(即，“基因表达谱分析”)提供了用于正常及患病组织和器官的功能分析的方法。基因表达谱分析通常通过从组织样品中分离mRNA并且使该mRNA经受微阵列杂交来进行。然而，此类方法仅允许分析先前已知的基因，而不能用于分析选择性剪接、启动子及聚腺苷酸化信号。此外，微阵列具有两个主要缺点：它们与已知基因连接，并且它们具有有限的灵敏度和动态范围。
对组织的全部或部分mRNA含量进行直接测序被越来越多地采用。然而，目前通过直接测序分析细胞的mRNA含量的方法依靠对从一般包含数百万个细胞的组织样品中获得的大量mRNA进行分析。这意味着当在大量mRNA中分析基因表达时，单细胞中呈现的很多功能信息将丢失或变得模糊。此外，不能按总体平均值观察诸如细胞周期的动态过程。类似地，只有单独分析这些细胞，才能研究复杂组织(例如，大脑)中的唯一细胞类型。
通常，没有合适的细胞表面标志物来用于分离单细胞以进行研究，并且即使存在合适的细胞表面标志物，少量的单细胞仍不足以捕获基因表达中自然变异的范围。需要一种制备cDNA文库的方法，该方法可用于分析多个单细胞中的基因表达。
序列表
本申请连同电子格式的序列表一起提交。该序列表被提供为2015年4月28日创建的大小为1Kb且名称为IP-1245-PCT_SequenceListing.txt的文件。将电子格式的序列表中的信息通过引用的方式以其全部并入本文中。
发明内容
本文提供用于多重单细胞基因表达分析的方法和组合物。一些方法和组合物包括具有诸如唯一性分子条形码(UMI)的唯一性条形码的小滴和/或珠粒的使用。
因此，本文提供的一个实施例是从多个单细胞中制备cDNA文库的方法，该方法包括以下步骤：从每个单细胞中释放mRNA以提供多个单独的mRNA样品，其中每个单独mRNA样品中的mRNA来自一个单细胞；用第一链合成引物从每个单独的mRNA样品中的mRNA合成cDNA的第一链，并且将标签并入cDNA中以提供多个经标记的cDNA样品，其中每个经标记的cDNA样品中的cDNA与来自单细胞的mRNA是互补的。在一个实施例中，标签包括细胞特异性标识符序列和唯一性分子标识符(UMI)序列。在一些实施例中，标签包括细胞特异性标识符序列，而没有UMI。该方法进一步包括将经标记的cDNA样品池化；可选地扩增池化的cDNA样品以生成包括双链cDNA的cDNA文库；以及进行标签化反应以同时切割每个cDNA并且将衔接子并入cDNA的每个链中，由此生成多个经标记的cDNA片段。在一些实施例中，存在足够数量的单细胞，可以避免cDNA的扩增。使用模板转换型寡核苷酸引物(TSO引物)并随后进行对称Nextera来合成cDNA的第二链。
在某些实施例中，该方法进一步包括扩增经标记的cDNA片段以生成扩增的经标记的cDNA片段。在一些方面，扩增包括向扩增产物的5’端添加额外的序列。
在一些方面，该额外的序列包括用于在固体支持物上扩增的引物结合序列。在一些方面，该额外的序列包括另外的索引序列。
在某些实施例中，该方法进一步包括在固体支持物上扩增所扩增的经标记的cDNA片段。
在某些实施例中，该方法进一步包括对在固体支持物上的扩增产物进行测序。
在一些方面，标签化反应包括使双链cDNA与包括未在第一链合成引物中发现的衔接子序列的转座酶混合物接触。
在一些方面，转座酶混合物主要由具有一种类型的衔接子序列的转座体组成。
在某些实施例中，该方法进一步包括对经标记的cDNA片段进行测序。
在一些方面，测序包括3’标签计数。
在一些方面，测序包括全转录组分析。
在一些方面，使用随机引物的混合物进行第一链合成，所述随机引物进一步包括标签。
在一些方面，第一链合成引物包括双链部分。在一些实施例中，包括双链部分的第一链合成引物进一步包括在一端处的单链环。在一些方面，第一链合成引物包括能够形成发夹的区域。
在一些方面，该第一链合成引物与单链第一链合成引物相比减少了串联副产物。
在一些方面，第一链合成引物包含RNA区域。
在一些方面，将第一链合成引物杂交到互补的寡核苷酸，由此形成双链部分。
本文还提供多个珠粒，其中每个珠粒包括多个寡核苷酸，每个寡核苷酸包括：(a)接头；(b)扩增引物结合位点；(c)可选地唯一性分子标识符，对每个寡核苷酸，所述唯一性分子标识符均不同；(d)珠粒特异性序列，所述珠粒特异性序列在珠粒的每个寡核苷酸上是相同的，但在其他珠粒上则是不同的；和(e)捕获序列，所述捕获序列用于捕获mRNA并引发逆转录。
在一些方面，所述捕获序列包括寡聚-dT。
在一些方面，每个珠粒处在与其他珠粒分离的单独的小滴中。
在下面附图和说明书中阐述一个或多个实施例的细节。根据本说明书和附图并且根据权利要求书，其他特征、目标和优点将变得显而易见。
附图说明
图1是示出使用SMARTer方法合成cDNA的示意图的示例性示意图。
图2A是示出根据一个实施例的第一链合成的示例性示意图，所述第一链合成由附加有可选的分子条形码(UMI)、样品条形码(BC)、扩增引物结合序列(V2.A14)和模板转换(TS)引物序列的寡聚dT引发，随后进行模板转换、样品的池化和单引物PCR。
图2B是示出用对称Nextera对池化的扩增产物进行标签化，随后使用不同的正向(V2.B15)和反向(V2.A14)PCR引物扩增，并且后续进行配对末端测序的示例性示意图。
图3A是示出根据一个实施例的第一链合成的示例性示意图，所述第一链合成由附加有样品条形码(BC)、可选的分子条形码(UMI)、扩增引物结合序列(V2.A14)和模板转换(TS)引物序列的寡聚dT引发，随后进行模板转换、样品的池化和单引物PCR。可选的UMI处于BC的5’-端。
图3B是一个示例性示意图，示出根据一个实施例的池化的扩增产物的标签化、扩增和测序。
图4A是示出根据一个实施例的第一链合成的示例性示意图。
图4B是一个示例性示意图，示出根据一个实施例的池化的扩增产物的标签化、扩增和测序。
图5是示出根据一个实施例的对多重样品的池化和测序方法的示例性示意图。
图6是比较使用l00pg人类大脑参考RNA进行基因表达分析的方法的表格。
图7是比较使用单细胞进行高通量单细胞基因表达分析的方法的表格。
图8示出比较只使用一个转座酶衔接子(V2.B15)的标签化与使用两个转座酶衔接子(V2.A14和V2.B15)的采用标准/不对称标签化进行的标签化的转录物覆盖度的图表。
图9A是示出根据一个实施例的需要使用随机物进行第一链合成的全转录组分析的示意图。
图9B是示出当使用随机物用于第一链合成时可能产生的串联副产物的示意图。
图10示出用以减少或避免串联副产物的各种引物设计。
图11是示出根据一个实施例的基于小滴的条形码化的示意图。
图12是示出根据一个实施例的基于珠粒的条形码化的示意图。
具体实施方式
本文提供用于多重单细胞基因表达分析的方法和组合物。一些方法和组合物包括具有诸如唯一性分子条形码(UMI)的唯一性条形码的小滴和/或珠粒的使用。
目前，用于单细胞RNA-Seq的最常用的方法是基于CLONTECHSMART-SEQTM技术或其衍生物。简言之，寡聚(dT)引物引发第一链cDNA合成反应。当逆转录酶(SMARTSCRIBETM)到达mRNA的5’端时，酶的末端转移酶活性将一些额外的非模板核苷酸添加到cDNA的3’端。被设计为与该非模板核苷酸延伸碱基配对的模板转换寡核苷酸退火并且创建延伸的模板，以使RT能够继续复制到寡核苷酸的末端(图l)。
本文提供的方法可包括使用样品特异性标签生成经标记的cDNA的方法，如在U.S.2012/0010091的公开中所述的，其内容通过引用的方式以其全部并入本文中。如本文使用的，术语单细胞标记的逆转录和STRT是指例如在所并入的材料U.S.2012/0010091中公开的方法。在一些实施例中，在STRT方法中，双链cDNA未被DNase降解。反而，双链cDNA被转座酶(例如标准Nextera)标签化。
然后，可以按以下方式将双链cDNA转化成测序文库：使用例如NEXTERATM或TRUSEQTM(ILLUMINA公司(Illumina,Inc.))以用于全转录组RNA测序；或者通过酶(诸如DNase I或片段化酶)降解，随后衔接子连接以用于5’端测序。两种方法都各有利弊：前者只有在文库制备期间引入样品条形码之后才可以是多重性的，而后者因为可在第一链合成步骤期间引入条形码，因此在cDNA合成之后就可以是多重性的。因此，后者更有利于实现每个样品的较高通量和较低成本。然而，采用两种方法获得的信息具有不同应用：前者允许用于全转录组的测序，而后者只探询基因表达水平。
本文提供快速基因表达文库制备方法，所述方法可以应用于单细胞输入水平，并且允许在方案早期开始高水平的样品多重化。
在一些实施例中，第一链合成采用附加有样品条形码(BC)、扩增引物结合位点和可选地模板转换(TS)引物序列的(锚定的)寡聚dT引物(或可能采用随机物或两者的组合)引发。在一些实施例中，扩增引物结合位点是转座酶衔接子序列，例如像Nextera衔接子序列V2.A14或V2.B15。条形码可以先于或后随于会允许检测PCR复制物的分子条形码(唯一性分子标识符或“UMI”)。当逆转录酶到达mRNA的5’端时发生模板转换，如上文和在所并入的材料U.S.2012/0010091中所述的。这将TS引物序列的互补体并入到第一cDNA链中。由于已将样品条形码引入至第一链cDNA中，因此可在此时将不同的样品池化。第一链池随后将变为双链，并可选地在PCR反应中采用TS引物扩增(图2A)。由于cDNA的两端包含互补序列的事实，发夹结构的形成将导致抑制较小片段(诸如矫作物等)的扩增。
在一些实施例中，如在图2A和3A中所阐述的，第一链合成采用附加有样品条形码(BC)、转座酶衔接子序列的拷贝(“Nextera V2.A14序列”)，可选地附加有分子条形码(UMI)，和模板转换(TS)引物序列的寡聚dT引发。cDNA链的3’端的模板转换在第一链的另一端处并入TS’引物序列。可在此时将不同样品的cDNA池化。
在一些实施例中，如图2B和3B所阐述的，采用TS寡核苷酸扩增cDNA。该单引物PCR将抑制诸如引物二聚体等的小扩增子。可采用例如只包含一个衔接子序列而不是典型的两个衔接子的转座酶(“NEXTERATM”)将cDNA池标签化。在图2B和3B示出的实例中，转座酶负载有V2.B15寡核苷酸。在标签化之后，用p5-V2.A14和p7-V2.B15扩增引物进行的PCR优先扩增cDNA的3’端片段。由两个标签化事件生成的片段(“对称片段”)在PCR期间将被抑制，并且不会生成可测序片段。例如，如图2B和3B所示，由对称片段生成的扩增产物将在扩增产物的5’和3’端二者处呈现P7引物序列，并且不会在具有P5和p7扩增引物的标准亿明达流动室上形成可测序簇。此外，由于它们的互补端，它们在PCR期间将受到抑制。相比之下，在扩增之后，3’端片段将具有P5和P7引物结合位点，并且可以在亿明达流动室上形成可测序簇。配对末端测序将在读取1期间产生样品BC和UMI序列，并且在读取2期间产生cDNA序列。
因此，在本文提供的某些实施例中，不是进行整个转录物的测序，而是进行依赖3’标签计数的数字基因表达测定形式。本文提供的方法提供在第一链合成步骤时单独条形码化细胞的能力。此外，采用廉价的寡聚-dT引物或随机物使cDNA的3’端条形码化提供了显著的成本节约优势。并且，随机物用于cDNA合成是有利的，因为它使该方法更类似于除3’标签计数测定法之外的总RNA测序方案。
随后，可在单个管中进行针对2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个细胞的池化、清除、单引物cDNA PCR扩增、标签化和测序文库制备。因此，本文描述的方法和组合物高度适合多重化。作为一个实例，在图5中所阐述的、本文提供的方法能实现细胞水平的多重化(例如，每个96-孔板96个样品)，进一步，所述方法能使用唯一性条形码化板(例如，标签化以并入识别96孔板的条形码)实现板水平的进一步多重化。这些方法适合自动化，并且可显著节约成本和时间。
将会理解，可改变第一链合成引物上的样品条形码和UMI的顺序。例如，在一些实施例中，样品条形码(BC)位于UMI的3’。在一些实施例中，样品条形码(BC)位于UMI的5’。在一些实施例中，样品条形码(BC)与UMI直接连接。在一些实施例中，样品条形码(BC)与UMI分隔开1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个核苷酸。在一些实施例中，样品条形码(BC)与UMI重叠1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个核苷酸。
在一些实施例中，使用包含未在第一链合成引物中发现的衔接子序列的转座酶混合物进行标签化。与被并入到第一链合成引物中的序列相比而言，如此操作产生具有不同的衔接子序列的标签化片段。例如，在一些实施例中，转座酶混合物排他地包括具有一种类型的衔接子序列的转座酶。由该类型的混合物生成的片段在本文中称为“对称片段”，并且不在亿明达流动室上产生可测序簇。在一些实施例中，转座酶混合物可包含被并入到第一链合成引物中的一定数量的序列，其中所述数量足够低以仍允许全部或基本上全部的3’cDNA片段被扩增和测序。例如，转座酶混合物中的衔接子序列可包括少于0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％，或少于25％、30％、35％、40％、45％，或少于50％的被并入到第一链合成引物中的序列。将会理解，在通常使用两种转座酶衔接子的情况中，可将两种衔接子中的任何一个并入到第一链合成引物中，并且可在标签化事件期间使用另一个衔接子。例如，在图3A、3B、4A和4B中阐述的示例性实施例中，在将一个衔接子序列并入到第一链合成引物中的情况下，该衔接子不再用于标签化混合物。图3A和3B示出一个实施例，其中在标签化步骤期间，将衔接子V2.A14并入到第一链合成引物中，并将衔接子V2.B15用作转座体衔接子。图4A和4B示出可替代的实施例，其中在标签化步骤期间，将衔接子V2.B15并入到第一链合成引物中，并将衔接子V2.A14用作转座体衔接子。在两个示例中，所得的标签化片段分为两类：对称片段(不能被扩增和/或测序)，以及可使用一组V2.A14和V2.B15引物扩增的不对称片段。
在一些实施例中，通过将索引并入到转座体衔接子序列中可显著增加可被多重化的单细胞的数量。如在图5中例示的，每个单独的细胞可采用细胞特异性条形码进行识别，并且可使每组细胞(例如，96个细胞的板)与具有被并入到转座体衔接子序列中的板特异性条形码的标签化混合物接触。在图5示出的实例中，在标签化之前，将来自板上的96个细胞中的每一个的cDNA池化，然后将标签化的样品池化以用于多重化测序。将会理解，在标签化之前可将任何数量的细胞池化，并且96孔板的使用只是许多实施例中的一个。例如，可以将一组2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21，22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100，或多于100、200、300、400、500、600、700、800、900或多于1000个，以及任何中间数目的细胞池化以用于标签化。可在任何单孔或多孔容器中进行第一链合成，诸如多孔板、芯片、微流体装置、乳液、珠粒混合物或用于多重化处理多个细胞的任何其他合适的形式。
如图7中所示(单细胞)，当使用相比于不对称标签化(Nextera形式V2.B15A/2.A14)的任何一种对称标签化(Nextera形式V2.B15)分析基因表达时，检测到相当大数量的基因并且获得其他度量。图8示出对比于使用两种转座酶衔接子(V2.A14和V2.B15)的标签化，当只使用一种转座酶衔接子(V2.B15)进行标签化时，转录物覆盖度几乎完全偏向转录物的3’端。
在一些实施例中，可通过将单独的细胞分隔成小滴进行样品化和UMI条形码化。在一些实施例中，在乳液中使小滴彼此分隔。在一些实施例中，使用小滴致动器形成和/或操纵小滴。在具体的实施例中，一个或更多个小滴包括一组不同的含条形码的第一链合成引物。在一些实施例中，每个小滴包括大量第一链合成引物，这些引物中的每一个均具有包括相同条形码的相同序列，并且来自一个小滴的条形码与来自另一个小滴的条形码不同，而在这些小滴之间第一链合成引物的其余部分保持相同。因此，在这些实施例中，条形码充当小滴以及小滴所包含的单细胞的标识符。在具体的实施例中，一个或更多个小滴包括一组不同的含UMI的第一链合成引物。因此，在每个小滴中裂解的每个单独的细胞将通过每个小滴中的条形码进行识别。如图11图示的，可通过将包含单细胞的小滴与包括唯一性条形码组的其他小滴融合来进行基于小滴的条形码化。此形式允许超出在多壁形式中可获得的多重化的额外的多重化。在每个单独的小滴内进行第一链合成和模板转换。在一些实施例中，可在PCR之前融合两个或更多个小滴。额外地或可替代地，在一些实施例中，可在标签化之前融合小滴。额外地或可替代地，在一些实施例中，可在PCR之后且在标签化之前融合小滴。例如，在一些实施例中，在单独的小滴中进行第一链合成之后，可将标记的cDNA融合，由此池化cDNA。
类似地，在一些实施例中，可通过将单独的细胞与具有用于第一链合成的UMI和/或条形码标记的引物的珠粒分隔来进行取样和UMI条形码化。在一些实施例中，将珠粒分隔至乳液中的小滴中。在一些实施例中，使用小滴致动器分隔并操纵珠粒。如图12所示的，可通过创建一组珠粒进行基于珠粒的条形码化，每个珠粒具有一组或几组唯一性条形码。
全转录组测序
在一些实施例中，本文提供的方法可用于进行全转录组测序。在此类实施例中，使用随机物扩展第一链合成。如图9A中所示的，随机引发将可测序片段的窗口扩展至沿转录物长度的任何地方，随机物在那里可杂交并且引发第一链合成。随机物可包括除其他衔接子和引物结合位点之外的样品条形码和唯一性分子标识符的相同组合，例如转座体衔接子序列和/或模板转换(TS)引物。可如上针对寡聚-dT引发的cDNA合成所述进行模板转换和第二链合成。然后，可如上所述使所得的双链cDNA经受标签化反应。使用随机物与寡聚-dT引物之间的差异在于可获得完整或基本上完整的转录物序列，而不是转录物的3’部分。如图6所示(100pg RNA)，相比于用于第一链合成的寡聚-dT和随机物的混合物，当使用任何一种寡聚-dT分析基因表达时，检测到相当大数量的基因并且获得其他度量。
当使用随机物用于引发第一链合成时可出现的一种类型的副产物是串联副产物。具体地，在一些情况中，如图9B所示的，随机物可杂交到其他随机引物，从而在与RNA转录物退火中竞争胜出。可使所得的cDNA产物进一步经受随机引发并且可发生模板转换事件的级联。该级联可导致串联体副产物的形成，所述串联体副产物的形成可依赖于模板转换寡核苷酸的存在。
为了减少和/或最小化此类副产物的形成，本文提供多种降低副产物形成的可能性的引物设计。示例性设计在图10中阐述，但将理解，本文阐述的引物组合物的范围延伸到附图中阐述的实例之外。在一个实施例中，可将引物配置为形成发夹以防止或最小化随机物引发至条形码、衔接子或扩增引物结合区域的任何部分。因此，在引物自身中形成的双链部分可在随机物杂交中竞争胜出。在一些实施例中，发夹的双链部分包括转座酶衔接子的嵌合端(ME)序列。可替代地或额外地，在一些实施例中，双链部分可包括越过嵌合端序列的一些或全部转座酶衔接子序列。在一些实施例中，衔接子序列可被短RNA序列完全替代，从而减少引物的长度，并且使随机物杂交到引物的可能性降至最低。在一些实施例中，在引物的5’端处或附近提供短RNA序列的互补体，从而形成发夹。在一些实施例中，通过使与衔接子和/或引物部分互补的寡核苷酸退火而形成双链区域，从而防止或最小化随机物引发至条形码、衔接子或扩增引物结合区域的任何部分，并由此减少或避免串联副产物。
条形码和UMI
如本文使用的，术语“条形码”或“BC”是指可用于识别核酸材料的样品或来源的核酸标签。因此，在核酸样品衍生自多种来源的情况中，可采用不同的核酸标签对每个核酸样品中的核酸进行标记，使得样品的来源能被识别。条形码(通常还称为索引、标签等)是本领域技术人员所熟知的。如本领域已知的并且如美国专利No.8,053,192和PCT公开案WO 05/068656的公开所例示的，可使用任何合适的条形码或条形码组，将所述参考文献通过引用的方式以其全部并入本文中。可按照例如在U.S.2013/0274117的公开中所述的进行单细胞的条形码化，将所述文献通过引用的方式以其全部并入本文中。
来自多于一种来源的核酸可并入可变标签序列。该标签序列的长度可多达100个核苷酸(如果涉及双链分子，则为碱基对)，优选地长度可为1至10个核苷酸，最优选地长度可为4、5或6个核苷酸，并且包括核苷酸的组合。例如，在一个实施例中，如果选择六个碱基对形成标签并使用四种不同核苷酸的排列，则可形成总计4096个核酸锚(例如，发夹)，每个核酸锚均具有唯一性6碱基标签。
如本文使用的，术语UMI、唯一性标识符和唯一性分子标识符是指附接到多个核酸分子中的每一个上的唯一性核酸序列。当被并入在核酸分子中时，例如在第一链cDNA合成期间，UMI可用于通过直接计数在扩增后测序的唯一性分子标识符(UMI)来校正随后的扩增偏倚。可如本领域已知的进行UMI的设计、并入和应用，例如，通过WO 2012/142213、Islam等人的《自然-方法学》(Nat.Methods)(2014)11:163-166，以及Kivioja,T.等人的《自然-方法学》(Nat.Methods)(2012)9:72-74的公开所例示的，所述每个文献都通过引用的方式以其全部并入本文中。
标签化
如本文使用的，术语“标签化”是指通过包括转座酶的转座体复合物进行的DNA的修饰，该转座酶与包括转座子末端序列的衔接子复合。标签化导致DNA的片段化与衔接子连接至双链片段的两个链的5’端同时发生。在去除转座酶的纯化步骤之后，可例如通过PCR、连接或本领域技术人员已知的任何其他合适的方法将额外的序列添加至改编片段的末端。
本发明的方法可使用可接受转座酶末端序列并且使靶核酸片段化的任何转座酶，所述转座酶附接至转移的末端而不是未转移的末端。“转座体(transposome)”由至少转座酶和转座酶识别位点构成。在一些称为“转座体”的此类***中，转座酶可与能够催化转座反应的转座子识别位点一起形成功能复合物。在有时称为“标签化(tagmentation)”的过程中，转座酶或整合酶可结合至转座酶识别位点，并将转座酶识别位点***至靶核酸中。在一些此类***事件中，可将转座酶识别位点的一个链转移到靶核酸中。
在标准的样品制备方法中，每个模板包含位于***物的任何一端处的衔接子，并且通常需要多个步骤来修饰DNA或RNA并且纯化修饰反应的期望产物。在向流动室添加改编片段(其中通过引物延伸反应将它们偶联至表面，所述引物延伸反应将杂交片段拷贝到共价附接至表面上的引物末端上)之前，在溶液中进行这些步骤。然后，这些“接种”模板通过几个扩增周期产生经拷贝的模板的单克隆簇。
在准备用于簇形成和测序的溶液中，将DNA转化为衔接子修饰的模板所需的步骤数可通过使用转座酶介导的片段化和标记而降至最低。
在一些实施例中，基于转座子的技术可用于使DNA片段化，例如在Nextera DNA样品制备试剂盒(ILLUMINA公司)的工作流程中所例示的，其中可通过同时使输入DNA片段化和加标记(“标签化”)的工程化转座体将基因组DNA片段化，从而创建在片段末端处包括唯一性衔接子序列的片段化核酸分子的群体。
一些实施例可包括使用过度活性的Tn5转座酶和Tn5-型转座酶识别位点(Goryshin和Reznikoff，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，273:7367(1998))，或MuA转座酶以及包括R1和R2末端序列的Mu转座酶识别位点(Mizuuchi,K.，《细胞》(Cell)，35：785，1983；Savilahti,H等人，《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBO J.)，14:4893，1995)。形成具有过度活性的Tn5转座酶(例如，EZ-Tn5TM转座酶，Epicentre生物技术，威斯康星州麦迪逊)的联合体的示例性转座酶识别位点。
可在本文提供的某些实施例中使用的转座***的更多实例包括金黄色葡萄球菌Tn552(Colegio等人，《细菌学杂志》(J.BacterioL)，183:2384-8，2001；Kirby C等人，《分子微生物学》(Mol.Microbiol.)，43:173-86，2002)，泰乐菌素(Tyl)(Devine和Boeke，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)，22:3765-72，1994和国际公开案WO 95/23875)，转座子Tn7(Craig,N L，《科学》(Science.)271:1512，1996；Craig,N L，在《微生物学和免疫学当前论题》(Curr Top Microbiol Immunol.)中的综述，204:27-48，1996)，Tn/O和IS10(KlecknerN等人，《微生物学和免疫学当前论题》(Curr Top Microbiol Immunol.)，204:49-82，1996)，水手转座酶(Mariner transposase)(Lampe D J等人，《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBO J.)，15:5470-9，1996)，Tel(Plasterk R H，《微生物学和免疫学当前论题》(Curr.Topics Microbiol.Immunol.)，204:125-43，1996)，P因子(Gloor,G B，《分子生物学方法》(Methods Mol.Biol.)，260：97-114，2004)，Tn3(Ichikawa和Ohtsubo，《生物化学杂志》(J Biol.Chem.)265:18829-32，1990)，细菌***序列(Ohtsubo和Sekine，《微生物学和免疫学当前论题》(Curr.Top.Microbiol.Immunol.)204:1-26，1996)，逆转录病毒(Brown等人，《美国国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci USA)，86:2525-9，1989)和酵母逆转录转座子(Boeke和Corces，《微生物学年度评论》(Annu Rev Microbiol.)，43:403-34，1989)。更多实例包括IS5、Tnl0、Tn903、IS911和转座酶家族酶的工程化形式(Zhang等人，(2009)《公共科学图书馆遗传学》(PLoS Genet.)5:el000689.电子出版于2009年10月16日；Wilson C.等人(2007)《微生物学方法杂志》(J.Microbiol.Methods)71:332-5)。
简略地说，“转座反应”是其中将一个或更多个转座子在随机位点或几乎在随机位点***至靶核酸的反应。转座反应中的必需组成部分是转座酶和展现转座子核苷酸序列的DNA寡核苷酸，包括转移的转座子序列及其组成部分(即，非转移的转座子末端序列)以及形成功能转座或转座体复合物所需的其他组成部分。DNA寡核苷酸可进一步包括所需的或期望的额外的序列(例如，衔接子序列或引物序列)。简略地说，体外转座可通过使转座体复合物与靶DNA接触引发。可较为容易地改编以用于在本公开的转座酶中使用的示例性转座程序和***描述在例如WO 10/048605；US 2012/0301925；US 2013/0143774中，将这些所述每个参考文献通过引用的方式以其全部并入本文中。
添加至核酸的5’和/或3’端的衔接子可包括通用序列。通用序列是两个或更多个核酸分子共有(即，共享)的核苷酸序列区域。可选地，两个或更多个核酸分子还具有序列差异区域。因此，例如，5’衔接子可包括相同或通用核酸序列，且3’衔接子可包括相同或通用序列。可存在于多个核酸分子的不同成员中的通用序列可允许使用互补于通用序列的单一通用引物复制或扩增多个不同序列。在本文提供的实例中使用的一些通用引物序列包括V2.A14和V2.B15 NexteraTM序列。然而，将容易理解的是，任何合适的衔接子序列可用于本文提供的方法和组合物中。例如，Tn5嵌合端序列A14(Tn5MEA)和/或Tn5嵌合端序列B15(Tn5MEB)(包括下面阐述的互补的非转移序列(NTS))可用于本文提供的方法。
Tn5MEA：5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3(SEQ ID NO:1)’
Tn5MEB：5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQ ID NO:2)
Tn5NTS：5’-CTGTCTCTTATACACATCT-3’(SEQ ID NO:3)
小滴中的条形码和UMI
在一些实施例中，具有样品条形码的引物可在溶液中。额外地或可替代地，具有UMI序列的引物可在溶液中。例如，固体支持物可以是一个或更多个小滴。因此，在某些实施例中，可存在多个小滴，其中所述多个小滴中的每个小滴均具有唯一性样品条形码和/或UMI序列，其中的每一个对于分子而言都是唯一的。因此，本领域的一般技术人员将理解，在一些实施例中，条形码对于小滴是唯一的，并且UMI对于分子是唯一的，使得UMI在一批小滴中重复很多次。在一些实施例中，使单独的细胞与具有一组唯一性样品条形码和/或UMI序列的小滴接触以识别所述单独的细胞。在一些实施例中，使来自单独的细胞的裂解物与具有一组唯一性样品条形码和/或UMI序列的小滴接触以识别所述单独的细胞裂解物。在一些实施例中，使来自单独的细胞的纯化核酸与具有一组唯一性样品条形码和/或UMI序列的小滴接触以识别来自所述单独的细胞的纯化核酸。
用于形成并操纵小滴的任何合适的***都可用于本文提供的实施例，其中多个小滴中的每个小滴均具有一组唯一性样品条形码和/或UMI序列。例如，可使用小滴致动器。
“小滴致动器”意指用于操纵小滴的装置。关于小滴致动器的实例，参见Pamula等人的2005年6月28日授权的美国专利No.6,911,132，标题为“通过基于电润湿的技术操纵小滴的设备(Apparatus for Manipulating Droplets by Electrowetting-BasedTechniques)”；Pamula等人的2006年8月31日公开的美国专利公开No.20060194331，标题为“用于操纵印刷电路板上的小滴的设备和方法(Apparatuses and Methods forManipulating Droplets on a Printed Circuit Board)”；Pollack等人的2007年10月25日公开的国际专利公开No.WO/2007/120241，标题为“基于小滴的生物化学(Droplet-BasedBiochemistry)”；Shenderov的2004年8月10日授权的美国专利No.6,773,566，标题为“用于微流体的静电致动器及其使用方法(Electrostatic Actuators for Microfluidics andMethods for Using Same)”；Shenderov的2003年5月20日授权的美国专利No.6,565,727，标题为“没有移动部件的用于微流体的致动器(Actuators for Microfluidics WithoutMoving Parts)”；Kim等人的2003年11月6日公开的美国专利公开No.20030205632，标题为“电润湿驱动的微型泵送(Electrowetting-driven Micropumping)”；Kim等人于2006年7月27日公开的美国专利公开No.20060164490，标题为“用于促进液滴从喷嘴完全转移的方法和设备(Method and Apparatus for Promoting the Complete Transfer of LiquidDrops from a Nozzle)”；Kim等人的2007年2月1日公开的美国专利公开No.20070023292，标题为“在印刷电路板上移动的小物体(Small Object Moving on Printed CircuitBoard)”；Shah等人的2009年11月19日公开的美国专利公开No.20090283407，标题为“用于在液滴微流体中使用磁性粒子的方法(Method for Using Magnetic Particles inDroplet Microfluidics)”；Kim等人在2010年4月22日公开的美国专利公开No.20100096266，标题为“用于芯片上小滴的电操纵的实时反馈控制的方法和设备(Methodand Apparatus for Real-time Feedback Control of Electrical Manipulation ofDroplets on Chip)”；Velev的2009年6月16日授权的美国专利No.7,547,380，标题为“具有流体表面的小滴运输装置和方法(Droplet Transportation Devices and MethodsHaving a Fluid Surface)”；Sterling等人的2007年1月16日授权的美国专利No.7,163,612，标题为“用于化学、生物化学和生物分析等的经由电润湿进行微流体控制的方法、设备和物品(Method,Apparatus and Article for Microfluidic Control viaElectrowetting,for Chemical,Biochemical and Biological Assays and the Like)”；Becker等人的2010年1月5日授权的美国专利No.7,641,779，标题为“用于可编程流体处理的方法和设备(Method and Apparatus for Programmable Fluidic Processing)”；Becker等人的2005年12月20日授权的美国专利No.6,977,033，标题为“用于可编程流体处理的方法和设备(Method and Apparatus for Programmable Fluidic Processing)”；Deere等人的2008年2月12日授权的美国专利No.7,328,979，标题为“用于操纵流体的***(System for Manipulation of a Body of Fluid)”；Yamakawa等人的2006年2月23日公开的美国专利No.20060039823，标题为“化学分析设备(Chemical Analysis Apparatus)”；Wu的2011年3月3日公开的美国专利公开No.20110048951，标题为“用于热交换化学过程的基于数字微流体的设备(Digital Micro fluidics Based Apparatus for Heat-exchangingChemical Processes)”；Fouillet等人的2009年7月30日公开的美国专利公开No.20090192044，标题为“电极寻址方法(Electrode Addressing Method)”；Fouillet等人的2006年5月30日授权的美国专利No.7,052,244，标题为“通过静电力沿着微悬链线的小液体体积的移位装置(Device for Displacement of Small Liquid Volumes Along aMicro-catenary Line by Electrostatic Forces)”；Marchand等人的2008年5月29日公开的美国专利公开No.20080124252，标题为“小滴微反应器(Droplet Microreactor)”；Adachi等人的2009年12月31日公开的美国专利公开No.20090321262，标题为“液体转移装置(Liquid Transfer Device)”；Roux等人的2005年8月18日公开的美国专利公开No.20050179746，标题为“用于控制两个或若干个固体基板之间的液滴的移位的装置(Device for Controlling the Displacement of a Drop Between Two or SeveralSolid Substrates)”；以及Dhindsa等人的“虚拟电润湿通道：具有连续通道功能性的电子液体运输(Virtual Electrowetting Channels:Electronic Liquid Transport withContinuous Channel Functionality)”，《芯片实验室》(Lab Chip)，10:832-836(2010)，将所述文献的全部公开通过引用的方式并入本文。某些小滴致动器将包括一个或更多个基板，在所述基板之间安排有小滴操作间隙，并且多个电极关联于(例如，层叠于、附接至和/或嵌入)所述一个或更多个基板中并且被安排为执行一个或更多个小滴操作。例如，某些小滴致动器包括基体(或底部)基板、与基板关联的小滴操作电极、位于基板和/或电极顶部的一个或更多个介电层，以及可选地位于形成小滴操作表面的基板、介电层和/或电极顶部的一个或更多个疏水层。还可提供顶部基板，通过通常称为小滴操作间隙的间隙将所述顶部基板与小滴操作表面分开。在上文引用的专利和申请中讨论了顶部和/或底部基板上的各种电极排列方式，并且在本公开的说明书中讨论了某些新颖的电极排列方式。在小滴操作期间，优选的是小滴与地电极或参比电极保持连续接触或频繁接触。地电极或参比电极可与间隙之中面向间隙的顶部基板、面向间隙的底部基板关联。在电极被提供两个基板上的情况中，用于将电极联接至用于控制或监测电极的小滴致动器仪器上的电接触可与一个或两个极板关联。在一些情况中，将一个基板上的电极电联接至其他基板，使得只有一个基板与小滴致动器接触。在一个实施例中，导电材料(例如，环氧树脂，诸如MASTER BONDTM聚合物体系EP79的，可自新泽西州哈肯萨克市(Hackensack)的美斯邦德公司(Master Bond,Inc.)获得)提供一个基板上的电极和另一个基板上的电通路之间的电连接，例如，可通过这样的导电材料将顶部基板上的地电极联接至底部基板上的电通路。在使用多个基板的情况中，在这些基板之间可提供间隔件以确定所述基板之间的间隙的高度并限定在线致动器的分发储器。间隔件高度可例如为至少约5μm、100μm、200μm、250μm、275μm或更大。可替代地或额外地，间隔件高度可为至多约600μm、400μm、350μm、300μm或更小。间隔件可例如，由形成顶部或底部基板的突出物的层和/或***在顶部和底部基板之间的材料形成。在一个或更多个基板中可提供一个或更多个开口，以用于形成流体通路，通过所述流体通路可将液体递送至小滴操作间隙中。在一些情况中，可将一个或更多个开口对齐以用于与一个或更多个电极相互作用，例如对齐使得通过开口流动的液体将变得足够接近一个或更多个小滴操作电极，以允许通过小滴操作电极使用液体实现小滴操作。在一些情况中，基体(或底部)和顶部基板可被形成为一个整体部件。可在基体(或底部)和/或顶部基板和/或在间隙中提供一个或更多个参比电极。在上述引用的专利和专利申请中提供了参比电极排列方式的实例。在各个实施例中，通过小滴致动器操纵小滴可为电极介导的，例如，电润湿介导的或介电电泳介导的或库仑力介导的。可使用在本公开的小滴致动器中的用于控制小滴操作的其他技术的实例包括使用诱导水动力流体压力的装置，例如基于以下原理操作的那些装置：机械原理(例如，外部注射泵、气动隔膜泵、振动隔膜泵、真空装置、离心力、压电/超声泵和声力)；电或磁原理(例如，电渗流、电动泵、铁磁流体插头、电流体动力泵、使用磁力的吸引力或排斥力和磁流体动力泵)；热力学原理(例如，气泡生成/相变诱导的体积膨胀)；其他种类的表面润湿原理(例如，电润湿和光电润湿，以及化学、热学、结构和放射性诱导的表面张力梯度)；重力；表面张力(例如，毛细管作用)；静电力(例如，电渗流)；离心流(设置在光盘上并且旋转的基板)；磁力(例如，振荡离子引起流动)；磁流体动力；以及真空或压力差。在某些实施例中，两种或更多种前述技术的组合可用于进行本公开的小滴致动器中的小滴操作。类似地，前述中的一种或更多种可用于，例如，从另一个装置的储器中或者从小滴致动器的外部储器(例如，与小滴致动器基板和从储器进入小滴操作间隙的流动通路相关联的储器)中递送液体进入小滴操作间隙。本公开的某些小滴致动器的小滴操作表面可由疏水性材料制成或者可被涂覆或处理以使它们为疏水性的。例如，在一些情况中，可使用低表面能材料或化学品对小滴操作表面的一部分或全部进行衍生化，例如，通过沉积或通过使用化合物(诸如溶液形式的聚氟或全氟化合物或者可聚合单体)的原位合成。实例包括铁氟龙(TEFLON)AF(可自特拉华州威尔明顿(Wilmington)的杜邦公司(DuPont)获得)、cytop材料家族成员、疏水性和超疏水性涂料的家族的涂料(可自马里兰州贝尔茨维尔(Beltsville)的Cytonix公司获得)、硅烷涂料、氟硅烷涂料、疏水性磷酸酯衍生物(例如，Aculon公司销售的那些)和NOVECTM电子涂料(可自明尼苏达州圣保罗(St.Paul)的3M公司获得)、用于等离子体增强化学气相沉积(PECVD)的其他氟化单体，以及用于PECVD的有机硅氧烷(例如，SiOC)。在一些情况中，小滴操作表面可包括具有从约10nm至约1,000nm范围的厚度的疏水性涂层。此外，在一些实施例中，小滴致动器的顶部基板包括导电有机聚合物，然后将其用疏水性涂层涂覆或以其他方式处理以使小滴操作表面为疏水性的。例如，在塑料基板上沉积的导电有机聚合物可以是聚(3,4-亚乙二氧基噻吩)聚(苯乙烯磺酸)(PEDOT:PSS)。导电有机聚合物和替代导电层的其他实例描述在Pollack等人的2011年1月6日公开的标题为“小滴致动器装置和方法(Droplet Actuator Devices and Methods)”的国际专利公开No.WO/2011/002957中，将所述文献的全部公开通过引用的方式并入本文中。可使用印刷电路板(PCB)、玻璃、氧化铟锡(ITO)-涂覆的玻璃和/或半导体材料作为基板来制造一个或两个基板。当基板为ITO-涂覆的玻璃时，ITO涂层优选低具有至少约20nm、50nm、75nm、100nm或更大的厚度。可替代地或额外地，所述厚度可为至多约200nm、150nm、125nm或更小。在一些情况下，顶部和/或底部基板包括涂覆有电介质(诸如聚酰亚胺电介质)的PCB基板，在一些情况中还可将其涂覆或以其他方式处理以使小滴操作表面为疏水性的。当基板包括PCB时，以下材料是合适的材料的实例：MITSUI BN-300(可自加利福尼亚州圣何塞(San Jose)的美国三井化学公司(MITSUI Chemicals America,Inc.)获得)；ARLON 11N(可自加利福尼亚州圣安娜(Santa Ana)的雅龙公司(Arlon,Inc)获得)；N4000-6和N5000-30/32(可自纽约州梅尔维尔(Melville)的帕克电化学公司(Park ElectrochemicalCorp.)获得)；ISOLA FR406(可自亚利桑那州钱德勒(Chandler)的伊索拉集团(IsolaGroup)获得)，尤其是IS620；氟聚合物家族(由于它具有低背景荧光而适用于荧光检测)；聚酰亚胺家族；聚酯；聚萘二甲酸乙二醇酯；聚碳酸酯；聚醚醚酮；液晶聚合物；环烯烃共聚物(COC)；环烯烃聚合物(COP)；芳族聚酰胺；非织造芳族聚酰胺强化材料(可自特拉华州威尔明顿的杜邦公司获得)；牌纤维(可自特拉华州威尔明顿的杜邦公司获得)；以及纸。很多材料也适合用作基板的电介质组分。实例包括：蒸汽沉积电介质，例如PARYLENE C(尤其在玻璃上)、PARYLENE N和PARYLENE HT(对于高温，～300℃)(可自得克萨斯州凯蒂的帕利灵涂料服务有限公司(Parylene Coating Services,Inc.)获得)；铁氟龙AF涂料；cytop；阻焊层(soldermasks)，例如液态感光焊料掩膜(例如，在PCB上)，像TAIYO PSR4000系列，TAIYO PSR和AUS系列(可自内华达州卡森城(Carson City)的太阳铁工美国有限公司(Taiyo America,Inc.)获得)(良好热特性以用于涉及热控制的应用)和PROBIMER 8165(良好热特性以用于涉及热控制的应用(可自加利福尼亚州洛杉矶的亨斯迈先进材料美洲公司(Huntsman Advanced Materials Americas Inc.)获得)；干膜焊料掩膜，例如在干膜焊料掩膜系中的那些(可自特拉华州威尔明顿的杜邦公司获得)；膜电介质，例如聚酰亚胺膜(例如，聚酰亚胺膜，可自特拉华州威尔明顿的杜邦公司获得)、聚乙烯和氟聚合物(例如，FEP)、聚四氟乙烯；聚酯；聚萘二甲酸乙二醇酯；环烯烃共聚物(COC)；环烯烃聚合物(COP)；上文列出的任何其他PCB基板材料；黑色基质树脂；聚丙烯；以及黑色柔性电路材料，例如DuPontHXC和DuPontMBC(可自特拉华州威尔明顿的杜邦公司获得)。可针对特定测定方案中使用的试剂的性能选择小滴传输电压和频率。设计参数可变化，例如，在线致动器储器的数量和放置、独立的电极连接件的数量、不同储器的尺寸(体积)、磁体/珠粒洗涤区的放置、电极尺寸、电极间的间距，以及间隙高度(顶部和底部基板之间)可变化以用于与特定试剂、方案、小滴体积等一起使用。在一些情况中，可使用低表面能材料或化学品对本公开的基板进行衍生化，例如，使用沉积或使用溶液形式的聚氟或全氟化合物或者可聚合单体的原位合成。实例包括用于浸渍或喷涂的铁氟龙AF涂料和涂料、用于等离子体增强化学气相沉积(PECVD)的其他氟化单体，以及用于PECVD的有机硅氧烷(例如，SiOC)。此外，在一些情况中，可使用物质涂覆小滴操作表面的一些部分或整体，以便降低背景噪音，例如来自PCB基板的背景荧光。例如，降低噪音的涂料可包括黑色基质树脂，例如可自日本东丽株式会社(Torayindustries,Inc.)获得的黑色基质树脂。小滴致动器的电极通常受控于控制器或处理器，所述控制器或处理器自身被提供为***的一部分，并且可包括处理功能以及数据和软件储存以及输入和输出能力。可在小滴致动器上，在小滴操作间隙中或在流体地联接至小滴操作间隙的储器中提供试剂。在小滴操作间隙中或在流体地联接至小滴操作间隙的储器中，试剂可为液体形式(例如，小滴)，或者可以以可重构形式提供所述试剂。通常，可将可重构的试剂与用于重构的液体组合。适用于与本文阐述的方法和设备一起使用的可重构试剂的实例包括Meathrel等人的2010年6月1日授权的美国专利No.7,727,466中描述的那些，所述美国专利的标题为“用于诊断装置的可崩解膜(Disintegratable Films for DiagnosticDevices)”，将所述专利的全部公开通过引用的方式并入本文中。
关于一个或更多个电极的“激活(Activate)”意为影响一个或更多个电极的电状态的变化，所述变化在小滴存在的条件下导致小滴操作。电极的激活可使用交流电(AC)或直流电(DC)完成。可使用任何合适的电压。例如，可使用大于约150V、或大于约200V、或大于约250V、或从约275V至约1000V、或约300V的电压激活电极。在使用AC信号的情况中，可采用任何合适的频率。例如，可使用具有从约1Hz至约10Mhz、或从约10Hz至约60Hz、或从约20Hz至约40Hz或约30Hz的频率的AC信号激活电极。
关于小滴致动器上的珠粒的“珠粒(Bead)”意为能够与小滴致动器之上或附近的小滴相互作用的任何珠粒或粒子。珠粒可为多种形状中的任何一种，例如球形，大体球形、蛋形、盘形、立方体、无定形和其他三维形状。珠粒例如，能够经受小滴致动器上小滴中的小滴操作或者相对于小滴致动器另外以一方式配置，所述方式允许使小滴致动器上的小滴与小滴致动器上的珠粒接触和/或离开小滴致动器。珠粒可被提供在小滴中、在小滴操作间隙中或者在小滴操作表面上。珠粒可被提供在储器中，所述储器位于小滴操作间隙外部或者远离小滴操作表面，并且储器可与流动通路关联，所述流动通路允许包括珠粒的小滴被带至小滴操作间隙中或者与小滴操作表面接触。可使用多种材料制造珠粒，所述材料包括例如树脂和聚合物。珠粒可具有任何合适的尺寸，包括例如，微珠粒、微粒、纳米珠粒和纳米粒子。在一些情况中，珠粒是磁响应的；在其他情况中，珠粒并非显著磁响应的。对于磁响应珠粒而言，磁响应材料可基本上构成珠粒的全部、珠粒的一部分或珠粒的仅一个组成部分。除此以外，珠粒的其余部分可包括聚合材料、涂料以及允许附接测定试剂的部分。合适的珠粒的实例包括流式细胞术微珠粒、聚苯乙烯微粒和纳米粒子、官能化的聚苯乙烯微粒和纳米粒子、涂覆的聚苯乙烯微粒和纳米粒子、二氧化硅微珠粒、荧光微球和纳米球、官能化的荧光微球和纳米球、涂覆的荧光微球和纳米球、颜料染色的微粒和纳米粒子、磁微粒和纳米粒子、超顺磁微粒和纳米粒子(例如，戴诺磁珠(DYNABEADS)粒子，可自加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad)的英杰集团(Invitrogen Group)获得)、荧光微粒和纳米粒子、涂覆的磁微粒和纳米粒子、铁磁微粒和纳米粒子、涂覆的铁磁微粒和纳米粒子，以及在以下文献中描述的那些：Watkins等人的2005年11月24日公开的美国专利公开No.20050260686，标题为“优选使用磁粒子作为固相的多重流式测定(Multiplex Flow Assays Preferably withMagnetic Particles as Solid Phase)”；Chandler于2003年7月17日公开的美国专利公开No.20030132538，标题为“荧光粒子的离散量子的封装(Encapsulation of DiscreteQuanta of Fluorescent Particles)”；Chandler等人的2005年6月2日公开的美国专利公开No.20050118574，标题为“临床标本的多重分析的设备和方法(Multiplexed Analysisof Clinical Specimens Apparatus and Method)”；Chandler等人的2005年12月15日公开的美国专利公开No.20050277197，标题为“具有多重荧光信号的微粒及其使用方法(Microparticles with Multiple Fluorescent Signals and Methods of UsingSame)”；以及Chandler等人的2006年7月20日公开的美国专利公开No.20060159962，标题为“用于基于荧光的应用的磁微球(Magnetic Microspheres for use in Fluorescence-based Applications)”，针对所述文献关于珠粒和磁响应材料及珠粒的教导将所述文献的全部公开通过引用的方式并入本文中。可将珠粒与生物分子或能够与生物分子结合并形成复合物的其他物质预联接。可将珠粒与抗体、蛋白质或抗原、DNA/RNA探针或针对期望靶标具有亲和力的任何其他分子预联接。用于固定磁响应珠粒和/或非磁响应珠粒和/或使用珠粒进行小滴操作方案的小滴致动器技术的实例描述在Pollack等人的2008年3月6日公开的美国专利公开No.20080053205，标题为“基于小滴的粒子分选(Droplet-Based ParticleSorting)”；2008年3月25日提交的美国专利申请No.61/039,183，标题为“单个小滴中的多重珠粒检测(Multiplexing Bead Detection in a Single Droplet)”；Pamula等人的2008年4月25日提交的美国专利申请No.61/047,789，标题为“使用珠粒的小滴致动器装置和小滴操作(Droplet Actuator Devices and Droplet Operations Using Beads)”；2008年8月5日提交的美国专利申请No.61/086,183，标题为“用于操纵珠粒的小滴致动器装置和方法(Droplet Actuator Devices and Methods for Manipulating Beads)”；Eckhardt等人的2008年8月14日公开的国际专利公开No.WO/2008/098236，标题为“采用磁珠的小滴致动器装置和方法(Droplet Actuator Devices and Methods Employing Magnetic Beads)”；Grichko等人的2008年11月6日公开的国际专利公开No.WO/2008/134153，标题为“基于珠粒的多重分析方法和仪器(Bead-based Multiplexed Analytical Methods andInstrumentation)”；Eckhardt等人的2008年9月25日公开的国际专利公开No.WO/2008/116221，“小滴致动器上的珠粒分选(Bead Sorting on a Droplet Actuator)”；以及Eckhardt等人的2007年10月25日公开的国际专利公开No.WO/2007/120241，标题为“基于小滴的生物化学(Droplet-based Biochemistry)”中，将这些文献的全部公开通过引用的方式并入本文中。珠粒特征可用于本公开的多重化方面中。具有适用于多重化的特征的珠粒以及检测并分析从此类珠粒发出的信号的方法的实例可在以下文献中发现：Whitman等人的2008年12月11日公开的美国专利公开No.20080305481，标题为“用于PCR实时多重分析的***和方法(Systems and Methods for Multiplex Analysis of PCR in Real Time)”；Roth于2008年6月26日公开的美国专利公开No.20080151240，标题为“用于动态范围扩展的方法和***(Methods and Systems for Dynamic Range Expansion)”；Sorensen等人的2007年9月6日公开的美国专利公开No.20070207513，标题为“用于识别样品中的分析物的方法、产品和试剂盒(Methods,Products,and Kits for Identifying an Analyte in aSample)”；Roth的2007年3月22日公开的美国专利公开No.20070064990，标题为“用于图像数据处理的方法和***(Methods and Systems for Image Data Processing)”；Chandler等人的2006年7月20日公开的美国专利公开No.20060159962，标题为“用于基于荧光的应用的磁微球(Magnetic Microspheres for use in Fluorescence-based Applications)”；Chandler等人的2005年12月15日公开的美国专利公开No.20050277197，标题为“具有多重荧光信号的微粒及其使用方法(Microparticles with Multiple Fluorescent Signalsand Methods of Using Same)”；以及Chandler等人的2005年6月2日公开的美国专利公开No.20050118574，标题为“临床标本多重分析设备和方法(Multiplexed Analysis ofClinical Specimens Apparatus and Method)”，将所述文献的全部公开通过引用的方式并入本文中。
“小滴(droplet)”意指小滴致动器上的液体体积。通常，小滴被填料流体至少部分地限制。例如，小滴可被填料流体完全包围或者可被填料流体和小滴致动器的一个或更多个表面限制。作为另一个实例，小滴可被填料流体、小滴致动器的一个或更多个表面和/或大气限制。再作为另一个实例，小滴可被填料流体和大气限制。小滴可以是，例如，水性的或非水性的，或者可以是包括水性及非水性组分的混合物或乳液。小滴可采用各种各样的形状；非限制性实例包括大体盘形、块形、截球形、椭球形、球形、部分压缩的球形、半球形、卵球形、圆柱形、此类形状的组合，以及在小滴操作(诸如融合或分离)期间形成的或者由此类形状与小滴致动器的一个或更多个表面接触所致形成的各种形状。关于可使用本公开的途径经受小滴操作的小滴流体的实例，参见Eckhardt等人的2007年10月25日公开的国际专利公开No.WO/2007/120241，标题为“基于小滴的生物化学(Droplet-based Biochemistry)”，将所述文献的全部公开通过引用的方式并入本文中。
在各种实施例中，小滴可包括生物样品，例如全血、淋巴液、血清、血浆、汗液、泪液、唾液、痰液、脑脊液、羊水、***、***分泌物、浆液、滑膜液、心包液、腹膜液、胸膜液、漏出液、渗出液、囊液、胆汁、尿液、胃液、肠液、粪便样品、包含单细胞或多细胞的液体、包含细胞器的液体、流化组织、流化生物体、包含多细胞生物体的液体、生物拭子和生物冲洗液。此外，小滴可包括试剂，例如水、去离子水、盐溶液、酸性溶液、碱性溶液、洗涤剂溶液和/或缓冲液。小滴可包括核酸，例如DNA、基因组DNA、RNA、mRNA或其类似物；核苷酸(诸如脱氧核醣核苷酸、核糖核苷酸)或其类似物(诸如具有终止子部分的类似物)，例如在以下文献中所述的那些：Bentley等人，《自然》(Nature)456:53-59(2008)；Gormley等人的2013年9月12日公开的国际专利公开No.WO/2013/131962，标题为“核酸测序的改进方法(Improved Methodsof Nucleic Acid Sequencing)”；Barries等人的2006年6月6日授权的美国专利No.7,057,026，标题为“标记的核苷酸(Labelled Nucleotides)”；Kozlov等人的2008年4月10日公开的国际专利公开No.WO/2008/042067，标题为“用于核苷酸测序的组合物及方法(Compositions and Methods for Nucleotide Sequencing)”；Rigatti等人的2013年8月15日公开的国际专利公开No.WO/2013/117595，标题为“支持物上核酸的靶向富集和扩增(Targeted Enrichment and Amplification of Nucleic Acids on a Support)”；Hardin等人的2008年2月12日授权的美国专利No.7,329,492，标题为“用于实时单分子序列测定的方法(Methods for Real-Time Single Molecule Sequence Determination)”；Hardin等人的2007年5月1日授权的美国专利No.7,211,414，标题为“酶促核酸合成：用于改变单体并入保真性的组合物及方法(Enzymatic Nucleic Acid Synthesis:Compositions andMethods for Altering Monomer Incorporation Fidelity)”；Turner等人的2008年1月1日授权的美国专利No.7,315,019，标题为“光约束阵列及其用途(Arrays of OpticalConfinements and Uses Thereof)”；Xu等人的2008年7月29日授权的美国专利No.7,405,281，标题为“荧光核苷酸类似物及其用途(Fluorescent Nucleotide Analogs and UsesTherefor)”；以及Ranket等人的2008年5月8日公开的美国专利公开No.20080108082，标题为“用于增强的核酸测序的聚合酶及试剂(Polymerase Enzymes and Reagents forEnhanced Nucleic Acid Sequencing)”，将所述文献的全部公开通过引用的方式并入本文中；酶，例如聚合酶、连接酶、重组酶或转座酶；结合伴侣，例如抗体、表位、链霉亲和素、抗生物素蛋白、生物素、凝集素或碳水化合物；或其他生物化学活性分子。小滴内容物的其他实例包括试剂，例如用于生物化学方案的试剂，所述生物化学方案为例如核酸扩增方案、基于亲和力的测定方案、酶测定方案、测序方案和/或用于生物流体分析的方案。小滴可包括一个或更多个珠粒。
“小滴操作”意为小滴致动器上的小滴的任何操纵。小滴操作可，例如，包括：将小滴加载至小滴致动器中；从小滴来源分发一个或更多个小滴；将小滴分割、分离或划分成两个或更多个小滴；在任意方向上将小滴从一个位置输送至另一个位置；将两个或更多个小滴融合或合并成单个小滴；将小滴稀释；将小滴混合；将小滴搅动；使小滴变形；使小滴保持在合适位置；将小滴孵育；将小滴加热；使小滴蒸发；将小滴冷却；将小滴处理；将小滴输送离开小滴致动器；本文描述的其他小滴操作；和/或前述内容的任何组合。术语“融合(merge)”、“融合(merging)”、“组合(combine)”、“组合(combining)”等用于描述从两个或更多个小滴创建一个小滴。应当理解，当关于两个或更多个小滴使用这样的术语时，可使用足以导致两个或更多个小滴组合成一个小滴的小滴操作的任何组合。例如，“融合小滴A与小滴B”可通过输送小滴A与静止的小滴B接触、输送小滴B与静止的小滴A接触，或输送小滴A和B彼此接触来实现。术语“分割(splitting)”、“分离(separating)”和“划分(dividing)”并不旨在暗示关于所得的小滴的体积的任何特定结果(即，所得的小滴的体积可以是相同的或不同的)或者关于所得的小滴的数量的任何特定结果(所得的小滴的数量可以是2、3、4、5或更多)。术语“混合”是指产生小滴内一个或更多个组分的更均匀分布的小滴操作。“加载”小滴操作的实例包括微量透析加载、压力辅助加载、自动加载、被动加载以及移液管加载。小滴操作可以是电极介导的。在一些情况中，通过在表面上使用亲水区和/或疏水区和/或通过物理障碍进一步促进小滴操作。针对小滴操作的实例，参见上文在“小滴致动器”的定义下引用的专利和专利申请。阻抗或电容感应技术或成像技术有时可用于确定或确认小滴操作的结果。此类技术的实例描述于Sturmer等人的2010年8月5日公开的美国专利公开No.20100194408中，所述美国专利公开的标题为“小滴致动器的电容检测(CapacitanceDetection in a Droplet Actuator)”，将所述文献的全部公开通过引用的方式并入本文中。一般而言，感应或成像技术可用于确认在特定电极处小滴的存在或不存在。例如，在小滴分发操作之后目标电极处存在分发的小滴证实小滴分发操作是有效的。类似地，测定方案中适当步骤中的检测点处存在小滴可证实前面的小滴操作组已成功产生用于检测的小滴。小滴输送时间可以是非常快的。例如，在各种实施例中，小滴从一个电极输送至下一个电极可超过约1秒，或约0.1秒，或约0.01秒，或约0.001秒。在一个实施例中，以AC模式操作电极，但为了成像切换到DC模式。这有助于进行与电润湿区相似的小滴的足迹区的小滴操作；换言之，分别使用1、2和3个电极可有效控制操作lx-、2x-3x-小滴。如果小滴足迹大于用于进行给定时间处的小滴操作可利用的电极数量，则小滴尺寸和电极数量之间的差通常应不大于1；换言之，使用1个电极可有效控制2x小滴，且使用2个电极可有效控制3x小滴。当小滴包含珠粒时，小滴尺寸等于控制小滴(例如，输送小滴)的电极数量是有用的。
“填料流体”意为与小滴致动器的小滴操作基板关联的流体，该流体与小滴相不能充分混合以使小滴相经受电极介导的小滴操作。例如，通常，使用填料流体填充小滴致动器的小滴操作间隙。填料流体可以例如是或者包括低粘度油，例如硅酮油或十六烷填料流体。填料流体可以是或者包括卤化油，例如氟化油或全氟化油。填料流体可填充小滴致动器的整个间隙或者可覆盖小滴致动器的一个或更多个表面。填料流体可为传导性或非传导性的。可选择填料流体以改进小滴操作和/或减少小滴中试剂或目标物质的损失、改进微滴形成、减少小滴之间的交叉污染、减少小滴致动器表面的污染、降低小滴致动器材料的降解等。例如，可针对与小滴致动器材料的相容性选择填料流体。作为实例，可将氟化填料流体与氟化表面涂料一起有效地使用。氟化填料流体可用于减少亲脂性化合物的损失，所述亲脂性化合物为例如伞形酮底物如6-十六酰胺基-4-甲基伞形酮底物(例如，用于使用在Krabbe、Niemann-Pick或其他测定中)；其他伞形酮底物描述在Winger等人的2011年5月19日公开的美国专利公开No.20110118132中，所述美国专利公开的标题为“在油的小滴中使用伞形酮底物及环糊精的酶测定(Enzymatic Assays Using Umbelliferone Substrateswith Cyclodextrins in Droplets of Oil)”，将所述文献的全部公开通过引用的方式并入本文中。合适的氟化油类的实例包括在Galden系中的那些，例如Galden HT170(bp＝170℃，粘度＝1.8cSt，密度＝1.77)、Galden HT200(bp＝200C，粘度＝2.4cSt，d＝1.79)、Galden HT230(bp＝230C，粘度＝4.4cSt，d＝1.82)(全部来自苏威苏莱克斯公司(SolvaySolexis))；Novec系中的那些，例如Novec 7500(bp＝128C，粘度＝0.8cSt，d＝1.61)、FluorinertFC-40(bp＝155℃，粘度＝1.8cSt，d＝1.85)，FluorinertFC-43(bp＝174℃，粘度＝2.5cSt，d＝1.86)(二者均来自3M)。通常，全氟化填料流体的选择基于运动粘度(<7cSt是优选的，但不是必需的)，并且基于沸点(对于使用在基于DNA/RNA的应用(PCR等)中，>150℃是优选的，但不是必需的)。填料流体可，例如，掺杂有表面活性剂或其他添加剂。例如，可选择添加剂以改进小滴操作和/或减少小滴中试剂或目标物质的损失、微滴形成、小滴之间的交叉污染、小滴致动器表面的污染、小滴致动器材料的降解等。可针对在特定测定方案中所用的试剂的性能以及与小滴致动器材料的有效相互作用或非相互作用来选择包括表面活性剂掺杂的填料流体的组合物。适用于本文阐述的方法和设备的填料流体和填料流体制剂的实例提供在Srinivasan)等人的2010年6月3日公开的国际专利公开No.WO/2010/027894，标题为“小滴致动器、改性流体和方法(Droplet Actuators,Modified Fluids andMethods)”；Srinivasan等人的2009年2月12日公开的国际专利公开No.WO/2009/021173，标题为“添加剂在增强小滴操作中的用途(Use of Additives for Enhancing DropletOperations)”；Sista等人的2009年1月15日公开的国际专利公开No.WO/2008/098236，标题为“采用磁珠的小滴致动器装置和方法(Droplet Actuator Devices and MethodsEmploying Magnetic Beads)”；以及Monroe等人的2008年11月20日公开的美国专利公开No.20080283414，标题为“电润湿装置(Electrowetting Devices)”中，将所述文献的全部公开以及其中引用的其他专利和专利申请通过引用的方式并入本文中。在一些情况中，氟化油可掺杂有氟化表面活性剂，例如，Zonyl FSO-100(西格玛-奥德里奇)和/或其他。填料流体通常是液体。在一些实施例中，可使用填料气体代替液体。
关于磁响应珠粒的“固定”意为珠粒被基本上限制在小滴中或小滴致动器上的填料流体中的合适位置中。例如，在一个实施例中，将被固定的珠粒充分地限制在小滴中的位置以允许执行小滴分割操作，产生具有基本上全部珠粒的一个小滴以及基本上没有珠粒的一个小滴。
“磁响应”意指对磁场的响应。“磁响应珠粒”包括或者由磁响应材料构成。磁响应材料的实例包括顺磁材料、铁磁材料、亚铁磁材料和变磁材料。合适的顺磁材料的实例包括铁、镍和钴以及金属氧化物，例如Fe3O4、BaFe12O19、CoO、NiO、Mn2O3、Cr2O3和CoMnP。
“储器(reservoirs)”意指被配置为用于保持、储存或供应液体的围合物或部分围合物。本公开的小滴致动器***可包括在线盒(on-cartridge)储器和/或离线盒(off-cartridge)储器。在线盒储器可以是(1)在线致动器储器，这是在小滴操作间隙中或在小滴操作表面上的储器；(2)离线盒储器，这是在小滴致动器盒上，但在小滴操作间隙外部并且不与小滴操作表面接触的储器；或者(3)具有在线致动器区域和离线致动器区域的混合型储器。离线致动器储器的实例是在顶部基板中的储器。离线致动器储器通常与布置的开口或流动通路处于流体连通，以用于使来自离线致动器储器的液体流动至小滴操作间隙中，例如流动至在线致动器储器中。离线盒储器可以是这样的储器，所述储器完全不是小滴致动器盒的一部分，但它使液体流动至小滴致动器盒的某一部分。例如，离线盒储器可以是***或插接站的一部分，小滴致动器盒在操作期间与所述***或插接站联接。类似地，离线盒储器可以是用于迫使流体进入在线盒储器中或进入小滴操作间隙中的试剂储存容器或注射器。采用离线盒储器的***通常包括流体通道装置，借此液体可从离线盒储器转移至在线盒储器中或转移至小滴操作间隙中。
如本文使用的，“输送至磁体的磁场中”、“朝向磁体输送”等是指小滴和/或小滴内的磁响应珠粒旨在指输送至能够实质性地吸引小滴中的磁响应珠粒的磁场区域中。类似地，如本文使用的，“输送离开磁体或磁场”、“输送离开磁体的磁场”等是指小滴和/或小滴内的磁响应珠粒旨在指输送离开能够实质性地吸引小滴中的磁响应珠粒的磁场区域，不论小滴或磁响应珠粒是否从磁场中被完全移除。将会理解，在本文描述的此类情况的任何一种中，可将小滴输送朝向或离开磁场的期望区域，和/或可将磁场的期望区域移动朝向或离开小滴。关于在磁场“之内(within)”或“之中(in)”的电极、小滴或磁响应珠粒等，这旨在描述这样一种情形，即其中电极以一种允许电极输送小滴进入和/或离开磁场的期望区域的方式定位，或者小滴或磁响应珠粒位于磁场的期望区域中，在每种情况中，期望区域中的磁场均能够实质性地吸引小滴中的任何磁响应珠粒。类似地，关于磁场“外部”或“离开”磁场的电极、小滴或磁响应珠粒等，这旨在描述这样一种情形，即其中电极以一种允许电极输送小滴离开磁场的某个区域的方式定位，或者小滴或磁响应珠粒位于离开磁场的某个区域，在每种情况中，这种区域中的磁场均不能实质性地吸引小滴中的任何磁响应珠粒或者其中任何剩余的引力不会消除该区域中进行的小滴操作的效力。在本公开的各个方面中，***、小滴致动器或***的另一个部件可包括磁体，例如一个或更多个永磁体(例如，单个圆柱形或条形磁体或此类磁体的阵列，例如Halbach阵列)或电磁体或电磁体的阵列，以形成磁场以用于与芯片上的磁响应珠粒或其他组成部分相互作用。此类相互作用可，例如，包括储存期间或者小滴操作期间的小滴中的磁响应珠粒的基本上固定或者限制移动或流动，或者吸引磁响应珠粒离开小滴。
关于洗涤珠粒的“洗涤”意为降低与珠粒接触的小滴中与珠粒接触或暴露于珠粒的一种或更多种物质的量和/或浓度。物质的量和/或浓度的降低可为部分的、基本上完全的或甚至完全的。物质可为多种多样的物质中的任一种；实例包括用于进一步分析的目标物质和不想要的物质，例如样品的组分、污染物和/或过量试剂。在一些实施例中，洗涤操作开始于与磁响应珠粒接触的起始小滴，其中小滴包括物质的起始量和起始浓度。可使用多种小滴操作进行洗涤操作。洗涤操作可产生包含磁响应珠粒的小滴，其中小滴具有小于该物质的起始量和/或浓度的物质的总量和/或浓度。合适的洗涤技术的实例描述在Pamula等人的2008年10月21日授权的美国专利No.7,439,014中，所述美国专利的标题为“基于小滴的表面修饰和洗涤(Droplet-Based Surface Modification and Washing)”，将所述专利的全部公开通过引用的方式并入本文中。
参照小滴致动器部件的相对位置(例如小滴致动器的顶部基板和底部基板的相对位置)，在整个说明书中使用术语“顶部”、“底部”、“在...上方”、“在...下方”和“在...之上”。将会理解，无论小滴致动器在空间中的取向如何，小滴致动器均是功能性的。
当将任何形式的液体(例如，不论运动或静止的小滴或连续体)描述为处于电极、阵列、基质或表面“之上”、“之处”、或“上方”时，此类液体可与电极/阵列/基质/表面直接接触，或者可与***在液体和电极/阵列/基质/表面之间的一个或更多个层或膜接触。在一个实例中，填料流体可被视为在此类液体和电极/阵列/基质/表面之间的膜。
当将小滴描述为在小滴致动器“之上”或“加载在小滴致动器之上”时，应当理解，以有助于使用小滴致动器进行小滴上的一个或更多个小滴操作的方式将小滴布置在小滴致动器之上，将小滴以有助于感测小滴的特性或来自小滴的信号的方式布置在小滴致动器上，和/或小滴已经受小滴致动器上的小滴操作。
珠粒上的条形码和UMI
在一些实施例中，可将具有样品条形码的引物固定至固体支持物上。额外地或可替代地，可将具有UMI序列的引物固定至固体支持物上。例如，固体支持物可以是一个或更多个珠粒。因此，在某些实施例中，可存在多个珠粒，其中所述多个珠粒中的每个珠粒均具有唯一性样品条形码和/或UMI序列。在一些实施例中，使单独的细胞与具有一组唯一性样品条形码和/或UMI序列的一个或更多个珠粒接触以识别所述单独的细胞。在一些实施例中，使来自单独的细胞的裂解物与具有一组唯一性样品条形码和/或UMI序列的一个或更多个珠粒接触以识别所述单独的细胞裂解物。在一些实施例中，使来自单独的细胞的纯化核酸与具有一组唯一性样品条形码和/或UMI序列的一个或更多个珠粒接触以识别来自单独细胞的所述纯化核酸。可按本领域已知的任何合适方式操纵珠粒，例如，使用上文描述的小滴致动器。
术语“固体表面”、“固体支持物”以及本文的其他语法等同物是指适用于或可被修改以适用于附接本文描述的引物、条形码和序列的任何材料。如将被本领域技术人员理解的，可能的基板的数量是非常巨大的。可能的基板包括但不限于，玻璃以及改性或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、铁氟龙TM等)、多糖类、尼龙或硝酸纤维素、陶瓷、树脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅酮和改性硅酮)、碳、金属、无机玻璃、塑料、光学纤维束以及多种其他聚合物。对于一些实施例，特别有用的固体支持物和固体表面位于流动室内。下面进一步详细地阐述示例性流动室。
在一些实施例中，固体支持物包括适用于以有序模式固定本文描述的引物、条形码和序列的图案化表面。“图案化表面”是指固体支持物的暴露层之中或之上的不同区域的排列。例如，在存在一个或更多个转座体复合物的情况中，所述区域中的一个或更多个可以具备多个特征。在不存在转座体复合物的情况中，所述特征可由间隙区域分开。在一些实施例中，图案可以是处于行和列的x-y形式的特征。在一些实施例中，图案可以是特征和/或间隙区域的重复排列。在一些实施例中，图案可以是特征和/或间隙区域的随机排列。在一些实施例中，将转座体复合物随机分布在固体支持物上。在一些实施例中，将转座体复合物分布在图案化表面上。可用于本文阐述的方法和组合物中的示例性图案化表面描述在美国序列No.13/661,524美国专利申请公开No.2012/0316086 Al中，将所述每个文献通过引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，固体支持物包括位于表面中的孔或凹陷的阵列。如通常本领域已知的，这可使用多种技术进行制造，包括但不限于光刻法、冲压技术、成型技术和微蚀技术。如将被本领域技术人员理解的，所使用的技术将取决于阵列基板的组成和形状。
固体支持物的组成和几何形状可随它的用途而改变。在一些实施例中，固体支持物是平面结构，诸如载玻片、芯片、微芯片和/或阵列。因此，基板的表面可为平面层的形式。在一些实施例中，固体支持物包括流动室的一个或更多个表面。如本文使用的，术语“流动室(flowcell)”是指包括固体表面的室，一种或更多种流体试剂可跨该固体表面流动。可较为容易地用于本公开的方法中的流动室和相关流体***以及检测平台的实例描述在，例如，Bentley等人的《自然》(Nature)456:53-59(2008)，WO 04/018497；US 7,057,026；WO91/06678；WO 07/123744；US 7,329,492；US 7,211,414；US 7,315,019；US 7,405,281和US2008/0108082中，将所述每个文献通过引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，固体支持物或其表面是非平面的，例如管或容器的内表面或外表面。在一些实施例中，固体支持物包括微球或珠粒。“微球(microspheres)”或“珠粒(beads)”或“粒子(parcitiles)”或本文的语法等同物意指小的离散粒子。适合的珠粒组合物包括但不限于：塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、顺磁材料、氧化钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、乳胶或交联葡聚糖(诸如琼脂糖)、纤维素、尼龙、交联胶束和铁氟龙，并且本文概述的用于固体支持物的任何其他材料全部可以使用。来自费雪尔邦斯实验室(Bangs Laboratories,Fishers Ind.)的“微球检测指南(Microsphere DetectionGuide)”是有用的指南。在某些实施例中，微球是磁性微球或珠粒。
珠粒不必是球形的；可使用不规则粒子。可替代地或额外地，珠粒可以是多孔的。珠粒尺寸范围可以是从纳米(即100nm)至毫米(即1mm)，其中从约0.2微米至约200微米的珠粒是优选的，并且从约0.5微米至约5微米是特别优选的，但在一些实施例中可使用更小或更大的珠粒。
在整个申请中，引用了各种出版物、专利和/或专利申请。将这些出版物的公开以它们的全部内容通过引用的方式并入本申请中。
本文包括的术语旨在为开放式的，不仅包括列举的元素，而且还包括任何额外的元素。
已经描述了多个实施例。然而，将会理解可进行各种修改。因此，其他实施例在下面权利要求书的范围内。
序列表
<110> ILLUMINA公司
<120> 使用模板转换和标签化的多重单细胞基因表达分析
<130> P00372/Illumina/US
<140> PCT/US2015/028062
<141> 2015-04-28
<150> US61/985,983
<151> 2014-04-29
<150> US61/987,433
<151> 2014-05-01
<160> 3
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tn5MEA
<400> 1
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tn5MEB
<400> 2
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tn5NTS
<400> 3
ctgtctctta tacacatct 19

Claims (20)

1.一种从多个单细胞制备cDNA文库的方法，所述方法包括以下步骤：
从每个单细胞中释放mRNA以提供多个单独的mRNA样品，其中每个单独的mRNA样品中的所述mRNA来自单细胞；
用第一链合成引物从每个单独的mRNA样品中的所述mRNA合成cDNA的第一链，并且将标签并入所述cDNA以提供多个经标记的cDNA样品，其中每个经标记的cDNA样品中的所述cDNA与来自单细胞的mRNA是互补的，并且其中所述标签包括细胞特异性标识符序列和可选地唯一性分子标识符(UMI)序列；
将所述经标记的cDNA样品池化；
可选地扩增所述池化的cDNA样品以生成包括双链cDNA的cDNA文库；以及
进行标签化反应以同时切割每个cDNA并且将衔接子并入该cDNA的每个链中，由此生成多个经标记的cDNA片段。
2.如权利要求1所述的方法，进一步包括扩增所述经标记的cDNA片段以生成扩增的经标记的cDNA片段。
3.根据权利要求2所述的方法，其中扩增包括向扩增产物的5’端添加额外的序列。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述额外的序列包括用于在固体支持物上扩增的引物结合序列。
5.如权利要求4所述的方法，进一步包括在固体支持物上扩增所扩增的经标记的cDNA片段。
6.如权利要求5所述的方法，进一步包括对在所述固体支持物上的扩增产物进行测序。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述标签化反应包括使所述双链cDNA与包括未在所述第一链合成引物中发现的衔接子序列的转座酶混合物接触。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述转座酶混合物主要由具有一种类型的衔接子序列的转座体组成。
9.如权利要求1所述的方法，进一步包括对所述经标记的cDNA片段进行测序。
10.如权利要求9所述的方法，其中测序包括3’标签计数。
11.如权利要求9所述的方法，其中测序包括全转录组分析。
12.如权利要求1所述的方法，使用随机引物的混合物进行第一链合成，所述随机引物进一步包括标签。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述第一链合成引物包含双链部分。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述第一链合成引物与单链第一链合成引物相比，减少了串联副产物。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述第一链合成引物包括能够形成发夹的区域。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述第一链合成引物包括RNA区域。
17.如权利要求13所述的方法，其中将所述第一链合成引物杂交到互补的寡核苷酸，由此形成双链部分。
18.多个珠粒，其中每个珠粒包括多个寡核苷酸，每个寡核苷酸包括：
(a)接头；
(b)扩增引物结合位点；
(c)可选地唯一性分子标识符，对每个寡核苷酸，所述唯一性分子标识符均不同；
(d)珠粒特异性序列，所述珠粒特异性序列在所述珠粒上的每个寡核苷酸上是相同的，但在其他珠粒上则是不同的；以及
(e)捕获序列，所述捕获序列用于捕获mRNA并引发逆转录。
19.如权利要求18所述的多个珠粒，其中所述捕获序列包括寡聚-dT。
20.如权利要求18所述的多个珠粒，其中每个珠粒是处于与其他珠粒分隔的单独小滴中。
CN201580033171.7A 2014-04-29 2015-04-28 使用模板转换和标签化的多重单细胞基因表达分析 Pending CN106459967A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461985983P 2014-04-29 2014-04-29
US61/985,983 2014-04-29
US201461987433P 2014-05-01 2014-05-01
US61/987,433 2014-05-01
PCT/US2015/028062 WO2015168161A2 (en) 2014-04-29 2015-04-28 Multiplexed single cell gene expression analysis using template switch and tagmentation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106459967A true CN106459967A (zh) 2017-02-22

Family

ID=53055134

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580033171.7A Pending CN106459967A (zh) 2014-04-29 2015-04-28 使用模板转换和标签化的多重单细胞基因表达分析

Country Status (8)

Country Link
US (2) US20170044525A1 (zh)
EP (2) EP3680333A1 (zh)
JP (1) JP6412954B2 (zh)
CN (1) CN106459967A (zh)
AU (4) AU2015253299B2 (zh)
CA (2) CA2947426C (zh)
SG (2) SG11201609053YA (zh)
WO (1) WO2015168161A2 (zh)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108611346A (zh) * 2018-05-06 2018-10-02 湖南大地同年生物科技有限公司 一种单细胞基因表达量检测文库的构建方法
WO2019061196A1 (zh) * 2017-09-28 2019-04-04 深圳华大生命科学研究院 一种用于检测的pcr引物及其应用
CN110835783A (zh) * 2018-08-17 2020-02-25 深圳华大生命科学研究院 用于长读长高质量测序的核酸文库的构建方法、测序方法及试剂
WO2020259303A1 (zh) * 2019-06-25 2020-12-30 北京全式金生物技术有限公司 一种快速构建rna 3'端基因表达文库的方法
CN112424380A (zh) * 2018-11-01 2021-02-26 Illumina公司 用于体细胞变体检测的方法和组合物
CN112867801A (zh) * 2018-11-30 2021-05-28 Illumina公司 使用单一测定分析多种分析物
CN112867800A (zh) * 2018-12-17 2021-05-28 Illumina公司 用于制备测序文库的方法和手段
CN112980667A (zh) * 2017-08-29 2021-06-18 伯乐实验室有限公司 用于分离和分析细胞的***和方法
CN113166797A (zh) * 2018-12-21 2021-07-23 Illumina公司 基于核酸酶的rna耗尽
WO2022021279A1 (zh) * 2020-07-31 2022-02-03 北京寻因生物科技有限公司 多种核酸共标记支持物及其制作方法与应用

Families Citing this family (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US9404864B2 (en) 2013-03-13 2016-08-02 Denovo Sciences, Inc. System for imaging captured cells
ES2797448T3 (es) 2011-08-01 2020-12-02 Bio Rad Laboratories Sistema de captura de células
US10466160B2 (en) 2011-08-01 2019-11-05 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for retrieving and analyzing particles
SG11201405274WA (en) 2012-02-27 2014-10-30 Cellular Res Inc Compositions and kits for molecular counting
US9606102B2 (en) 2013-01-26 2017-03-28 Denovo Sciences, Inc. System and method for capturing and analyzing cells
US9707562B2 (en) 2013-03-13 2017-07-18 Denovo Sciences, Inc. System for capturing and analyzing cells
US9856535B2 (en) 2013-05-31 2018-01-02 Denovo Sciences, Inc. System for isolating cells
US10391490B2 (en) 2013-05-31 2019-08-27 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for isolating and analyzing cells
KR20230074639A (ko) 2013-08-28 2023-05-30 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 대량의 동시 단일 세포 분석
US10975371B2 (en) 2014-04-29 2021-04-13 Illumina, Inc. Nucleic acid sequence analysis from single cells
ES2836802T3 (es) 2015-02-27 2021-06-28 Becton Dickinson Co Códigos de barras moleculares espacialmente direccionables
WO2016160844A2 (en) 2015-03-30 2016-10-06 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for combinatorial barcoding
US11390914B2 (en) 2015-04-23 2022-07-19 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for whole transcriptome amplification
SG10201912283RA (en) * 2015-08-28 2020-02-27 Illumina Inc Nucleic acid sequence analysis from single cells
CN108026524A (zh) 2015-09-11 2018-05-11 赛卢拉研究公司 用于核酸文库标准化的方法和组合物
EP3350732A4 (en) * 2015-09-15 2019-02-27 Takara Bio USA, Inc. METHOD FOR GENERATING A LIBRARY WITH SEQUENCING OF THE NEXT GENERATION (NGS) FROM A RIBONUCLEIC ACID (RNA) SAMPLE AND COMPOSITIONS FOR IMPLEMENTING THEREOF
CN105926043B (zh) * 2016-04-19 2018-08-28 苏州贝康医疗器械有限公司 一种提高孕妇血浆游离dna测序文库中胎儿游离dna占比的方法
JPWO2017204294A1 (ja) * 2016-05-25 2019-02-21 株式会社ニコン 標的生体分子の特定方法、標的生体分子特定用ビーズ、ビーズのセット、及び標的生体分子特定装置
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US11293021B1 (en) 2016-06-23 2022-04-05 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
RU2019106038A (ru) * 2016-08-10 2020-09-17 Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж Способы de novo сборки баркодированных фрагментов геномной днк
CA3034924A1 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Cellular Research, Inc. Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
US11667951B2 (en) 2016-10-24 2023-06-06 Geneinfosec, Inc. Concealing information present within nucleic acids
US20180127819A1 (en) * 2016-11-09 2018-05-10 Qiagen Waltham, Inc. Enhancing Sequencing Performance in Sequencing-by-Synthesis
EP3559255A1 (en) 2016-12-23 2019-10-30 Grail, Inc. Methods for high efficiency library preparation using double-stranded adapters
US10711269B2 (en) * 2017-01-18 2020-07-14 Agilent Technologies, Inc. Method for making an asymmetrically-tagged sequencing library
US11319583B2 (en) 2017-02-01 2022-05-03 Becton, Dickinson And Company Selective amplification using blocking oligonucleotides
EP3583212A4 (en) * 2017-02-16 2021-01-13 Takara Bio USA, Inc. METHOD FOR PREPARING NUCLEIC ACID LIBRARIES AND COMPOSITIONS AND KITS FOR CARRYING OUT THEREOF
WO2018183918A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Grail, Inc. Enhanced ligation in sequencing library preparation
WO2018183897A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Grail, Inc. Higher target capture efficiency using probe extension
US10676779B2 (en) 2017-06-05 2020-06-09 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
CN107502607A (zh) * 2017-06-20 2017-12-22 浙江大学 一种大量组织、细胞样本mRNA的分子条形码标记、文库构建、测序的方法
WO2018235938A1 (ja) * 2017-06-23 2018-12-27 国立研究開発法人理化学研究所 核酸をシークエンシングする方法および解析する方法
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
EP3848459A1 (en) 2017-06-30 2021-07-14 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments and systems
JP2021509024A (ja) * 2018-01-02 2021-03-18 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 多数の液滴の捕捉
WO2019191459A1 (en) * 2018-03-28 2019-10-03 Berkeley Lights, Inc. Methods for preparation of nucleic acid sequencing libraries
US10526598B2 (en) 2018-04-24 2020-01-07 Inscripta, Inc. Methods for identifying T-cell receptor antigens
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
JP7358388B2 (ja) 2018-05-03 2023-10-10 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 反対側の転写物末端における分子バーコーディング
EP4234717A3 (en) 2018-05-03 2023-11-01 Becton, Dickinson and Company High throughput multiomics sample analysis
AU2019292919A1 (en) 2018-06-30 2021-03-11 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
CN112689673A (zh) * 2018-07-11 2021-04-20 埃克斯基因美国公司 转座体使能的dna/rna测序（ted rna-seq）
BR112021002779A2 (pt) 2018-08-15 2021-05-04 Illumina, Inc. composições e métodos para melhorar o enriquecimento de bibliotecas
EP3841202B1 (en) * 2018-08-20 2023-10-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleotide sequence generation by barcode bead-colocalization in partitions
EP3861134A1 (en) 2018-10-01 2021-08-11 Becton, Dickinson and Company Determining 5' transcript sequences
CN112969789A (zh) 2018-11-08 2021-06-15 贝克顿迪金森公司 使用随机引发的单细胞全转录组分析
WO2020123384A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 Cellular Research, Inc. Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
EP4242322A3 (en) 2019-01-23 2023-09-20 Becton, Dickinson and Company Oligonucleotides associated with antibodies
US11001831B2 (en) 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
WO2020198174A1 (en) 2019-03-25 2020-10-01 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
US10633693B1 (en) 2019-04-16 2020-04-28 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for leakage control in a particle capture system
SG11202112151UA (en) 2019-05-07 2021-12-30 Bio Rad Laboratories System and method for automated single cell processing
US11273439B2 (en) 2019-05-07 2022-03-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System and method for target material retrieval from microwells
EP3953477A4 (en) 2019-06-06 2022-06-22 Inscripta, Inc. HARDENING FOR RECURSIVE NUCLEIC ACID-DRIVEN CELL EDITING
CA3143241A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. System and method for automated single cell processing and analyses
EP4004231A1 (en) 2019-07-22 2022-06-01 Becton, Dickinson and Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
JP7306155B2 (ja) 2019-08-22 2023-07-11 スズキ株式会社 車両用動力伝達装置
US11773436B2 (en) 2019-11-08 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company Using random priming to obtain full-length V(D)J information for immune repertoire sequencing
WO2021102059A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
US11008557B1 (en) 2019-12-18 2021-05-18 Inscripta, Inc. Cascade/dCas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells
CN115244184A (zh) 2020-01-13 2022-10-25 贝克顿迪金森公司 用于定量蛋白和rna的方法和组合物
EP4095256A4 (en) * 2020-01-23 2023-03-15 DGI Tech (Qing Dao) Co., Limited DROPLET MICROFLUIDIC-BASED SINGLE CELL SEQUENCING AND APPLICATIONS
WO2021154706A1 (en) 2020-01-27 2021-08-05 Inscripta, Inc. Electroporation modules and instrumentation
US11504719B2 (en) 2020-03-12 2022-11-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. System and method for receiving and delivering a fluid for sample processing
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
US11661625B2 (en) 2020-05-14 2023-05-30 Becton, Dickinson And Company Primers for immune repertoire profiling
US20210381007A1 (en) * 2020-06-04 2021-12-09 Inscripta, Inc. Methods and compositions for crispr editing of cells and correlating the edits to a resulting cellular nucleic acid profile
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
AU2021320307A1 (en) 2020-08-06 2023-02-16 Illumina Cambridge Limited Preparation of RNA and DNA sequencing libraries using bead-linked transposomes
WO2022060749A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Inscripta, Inc. Crispr editing to embed nucleic acid landing pads into genomes of live cells
WO2022067494A1 (en) * 2020-09-29 2022-04-07 Singleron (Nanjing) Biotechnologies, Ltd. Method for detection of whole transcriptome in single cells
US11512297B2 (en) 2020-11-09 2022-11-29 Inscripta, Inc. Affinity tag for recombination protein recruitment
US11739443B2 (en) 2020-11-20 2023-08-29 Becton, Dickinson And Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
CA3204158A1 (en) 2021-01-04 2022-07-07 Juhan Kim Mad nucleases
US11332742B1 (en) 2021-01-07 2022-05-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
WO2022188054A1 (en) * 2021-03-10 2022-09-15 Nanjing University Methods and reagents for sample multiplexing for high throughput single-cell rna sequencing
EP4314283A1 (en) 2021-03-31 2024-02-07 Illumina, Inc. Methods of preparing directional tagmentation sequencing libraries using transposon-based technology with unique molecular identifiers for error correction
EP4352286A1 (en) * 2021-06-11 2024-04-17 Cellanome, Inc. Systems and methods for analyzing biological samples
WO2023159416A1 (zh) * 2022-02-24 2023-08-31 浙江大学 一种单细胞转录组测序方法及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120010091A1 (en) * 2009-03-30 2012-01-12 Illumina, Inc. Gene expression analysis in single cells

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0450060A1 (en) 1989-10-26 1991-10-09 Sri International Dna sequencing
US5677170A (en) 1994-03-02 1997-10-14 The Johns Hopkins University In vitro transposition of artificial transposons
EP0852004B1 (en) 1995-10-11 2011-01-19 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens
DE69812329T2 (de) 1997-11-18 2004-02-12 Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules Multiplex-zufluss-immunotest mit magnetischen teilchen als festphase
US6565727B1 (en) 1999-01-25 2003-05-20 Nanolytics, Inc. Actuators for microfluidics without moving parts
US6294063B1 (en) 1999-02-12 2001-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and apparatus for programmable fluidic processing
US6277607B1 (en) * 1999-05-24 2001-08-21 Sanjay Tyagi High specificity primers, amplification methods and kits
ATE324588T1 (de) 1999-08-17 2006-05-15 Luminex Corp Verkapselung von fluoreszierenden partikeln
EP1204869B1 (en) 1999-08-17 2008-10-22 Luminex Corporation Method for analyzing a number of samples from a variety of sources for a single analyte
WO2002004680A2 (en) 2000-07-07 2002-01-17 Visigen Biotechnologies, Inc. Real-time sequence determination
AU2001280796A1 (en) 2000-07-25 2002-02-05 The Regents Of The University Of California Electrowetting-driven micropumping
US6773566B2 (en) 2000-08-31 2004-08-10 Nanolytics, Inc. Electrostatic actuators for microfluidics and methods for using same
US7211414B2 (en) 2000-12-01 2007-05-01 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
US7163612B2 (en) 2001-11-26 2007-01-16 Keck Graduate Institute Method, apparatus and article for microfluidic control via electrowetting, for chemical, biochemical and biological assays and the like
US7057026B2 (en) 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
FR2841063B1 (fr) 2002-06-18 2004-09-17 Commissariat Energie Atomique Dispositif de deplacement de petits volumes de liquide le long d'un micro-catenaire par des forces electrostatiques
EP3795577A1 (en) 2002-08-23 2021-03-24 Illumina Cambridge Limited Modified nucleotides
US8349276B2 (en) 2002-09-24 2013-01-08 Duke University Apparatuses and methods for manipulating droplets on a printed circuit board
US6911132B2 (en) 2002-09-24 2005-06-28 Duke University Apparatus for manipulating droplets by electrowetting-based techniques
US7547380B2 (en) 2003-01-13 2009-06-16 North Carolina State University Droplet transportation devices and methods having a fluid surface
WO2005003304A2 (en) * 2003-06-20 2005-01-13 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
WO2005039499A2 (en) 2003-10-24 2005-05-06 Adhesives Research, Inc. Rapidly disintegrating film
JP4773360B2 (ja) 2003-11-17 2011-09-14 コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ 流体を操作するためのシステム
GB0400584D0 (en) 2004-01-12 2004-02-11 Solexa Ltd Nucleic acid chacterisation
EP1704402B1 (en) 2004-01-14 2016-05-11 Luminex Corporation Methods and systems for dynamic range expansion
FR2866493B1 (fr) 2004-02-16 2010-08-20 Commissariat Energie Atomique Dispositif de controle du deplacement d'une goutte entre deux ou plusieurs substrats solides
FR2872715B1 (fr) 2004-07-08 2006-11-17 Commissariat Energie Atomique Microreacteur goutte
FR2872809B1 (fr) 2004-07-09 2006-09-15 Commissariat Energie Atomique Methode d'adressage d'electrodes
JP2006058031A (ja) 2004-08-17 2006-03-02 Hitachi High-Technologies Corp 化学分析装置
JP2008513782A (ja) 2004-09-17 2008-05-01 パシフィック バイオサイエンシーズ オブ カリフォルニア， インコーポレイテッド 分子解析のための装置及び方法
EP1842211B1 (en) 2005-01-20 2010-08-04 Luminex Corporation Microspheres having fluorescent and magnetic properties
US7458661B2 (en) 2005-01-25 2008-12-02 The Regents Of The University Of California Method and apparatus for promoting the complete transfer of liquid drops from a nozzle
US20070023292A1 (en) 2005-07-26 2007-02-01 The Regents Of The University Of California Small object moving on printed circuit board
EP1929274B1 (en) 2005-09-21 2016-07-27 Luminex Corporation Methods and systems for image data processing
US7405281B2 (en) 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
US20070207513A1 (en) 2006-03-03 2007-09-06 Luminex Corporation Methods, Products, and Kits for Identifying an Analyte in a Sample
EP3373174A1 (en) 2006-03-31 2018-09-12 Illumina, Inc. Systems and devices for sequence by synthesis analysis
CA2680532C (en) 2006-04-18 2017-03-21 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based pyrosequencing
US7439014B2 (en) 2006-04-18 2008-10-21 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based surface modification and washing
US7901947B2 (en) 2006-04-18 2011-03-08 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based particle sorting
WO2010027894A2 (en) 2008-08-27 2010-03-11 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuators, modified fluids and methods
CN101490562B (zh) 2006-07-10 2012-12-19 株式会社日立高新技术 液体输送设备
WO2008042067A2 (en) 2006-09-28 2008-04-10 Illumina, Inc. Compositions and methods for nucleotide sequencing
AU2007309504B2 (en) 2006-10-23 2012-09-13 Pacific Biosciences Of California, Inc. Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing
WO2008055256A2 (en) 2006-11-02 2008-05-08 The Regents Of The University Of California Method and apparatus for real-time feedback control of electrical manipulation of droplets on chip
US7955802B2 (en) 2006-12-13 2011-06-07 Luminex Corporation Systems and methods for multiplex analysis of PCR in real time
EP2121983A2 (en) 2007-02-02 2009-11-25 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
US9046514B2 (en) 2007-02-09 2015-06-02 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuator devices and methods employing magnetic beads
WO2008101194A2 (en) 2007-02-15 2008-08-21 Advanced Liquid Logic, Inc. Capacitance detection in a droplet actuator
US8093062B2 (en) 2007-03-22 2012-01-10 Theodore Winger Enzymatic assays using umbelliferone substrates with cyclodextrins in droplets in oil
WO2008116221A1 (en) 2007-03-22 2008-09-25 Advanced Liquid Logic, Inc. Bead sorting on a droplet actuator
WO2008134153A1 (en) 2007-04-23 2008-11-06 Advanced Liquid Logic, Inc. Bead-based multiplexed analytical methods and instrumentation
US20080283414A1 (en) 2007-05-17 2008-11-20 Monroe Charles W Electrowetting devices
CN101679932A (zh) 2007-06-27 2010-03-24 数字化生物*** 用于热交换化学过程的基于数字微流体的装置
WO2009021173A1 (en) 2007-08-08 2009-02-12 Advanced Liquid Logic, Inc. Use of additives for enhancing droplet operations
US8093064B2 (en) 2008-05-15 2012-01-10 The Regents Of The University Of California Method for using magnetic particles in droplet microfluidics
EP2376517B1 (en) 2008-10-24 2013-01-16 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
US9080211B2 (en) * 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
US20110311980A1 (en) * 2008-12-15 2011-12-22 Advanced Liquid Logic, Inc. Nucleic Acid Amplification and Sequencing on a Droplet Actuator
WO2011002957A2 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuator devices and methods
EP3561159B1 (en) 2010-10-08 2023-09-20 President and Fellows of Harvard College High-throughput single cell barcoding
US9284602B2 (en) * 2010-10-27 2016-03-15 President And Fellows Of Harvard College Compositions of toehold primer duplexes and methods of use
US9476095B2 (en) 2011-04-15 2016-10-25 The Johns Hopkins University Safe sequencing system
US9005935B2 (en) 2011-05-23 2015-04-14 Agilent Technologies, Inc. Methods and compositions for DNA fragmentation and tagging by transposases
WO2012170936A2 (en) 2011-06-09 2012-12-13 Illumina, Inc. Patterned flow-cells useful for nucleic acid analysis
US20130143774A1 (en) 2011-12-05 2013-06-06 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for generating polynucleic acid fragments
WO2013117595A2 (en) 2012-02-07 2013-08-15 Illumina Cambridge Limited Targeted enrichment and amplification of nucleic acids on a support
NO2694769T3 (zh) 2012-03-06 2018-03-03
EP2898096B1 (en) * 2012-09-21 2024-02-14 The Broad Institute, Inc. Methods for labeling of rnas
US20160122753A1 (en) * 2013-06-12 2016-05-05 Tarjei Mikkelsen High-throughput rna-seq
KR20230074639A (ko) * 2013-08-28 2023-05-30 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 대량의 동시 단일 세포 분석
KR102433825B1 (ko) * 2013-12-30 2022-08-31 아트레카, 인크. 핵산 바코드를 이용하는 단일 세포와 관련된 핵산의 분석

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120010091A1 (en) * 2009-03-30 2012-01-12 Illumina, Inc. Gene expression analysis in single cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ISLAM ET AL: "Quantitative single-cell RNARNARNA-seq with unique molecular identifiers", 《NATURE METHODS》 *
ISLAM SAIFUL ET AL: ""Highly multiplexed and strand-specific single-cell", 《NATURE PROTOCOLS》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112980667A (zh) * 2017-08-29 2021-06-18 伯乐实验室有限公司 用于分离和分析细胞的***和方法
WO2019061196A1 (zh) * 2017-09-28 2019-04-04 深圳华大生命科学研究院 一种用于检测的pcr引物及其应用
CN111148836A (zh) * 2017-09-28 2020-05-12 深圳华大生命科学研究院 一种用于检测的pcr引物及其应用
CN108611346A (zh) * 2018-05-06 2018-10-02 湖南大地同年生物科技有限公司 一种单细胞基因表达量检测文库的构建方法
CN110835783A (zh) * 2018-08-17 2020-02-25 深圳华大生命科学研究院 用于长读长高质量测序的核酸文库的构建方法、测序方法及试剂
CN110835783B (zh) * 2018-08-17 2023-06-20 深圳华大生命科学研究院 用于长读长高质量测序的核酸文库的构建方法、测序方法及试剂
CN112424380A (zh) * 2018-11-01 2021-02-26 Illumina公司 用于体细胞变体检测的方法和组合物
CN112867801A (zh) * 2018-11-30 2021-05-28 Illumina公司 使用单一测定分析多种分析物
CN112867800A (zh) * 2018-12-17 2021-05-28 Illumina公司 用于制备测序文库的方法和手段
CN113166797A (zh) * 2018-12-21 2021-07-23 Illumina公司 基于核酸酶的rna耗尽
CN113166797B (zh) * 2018-12-21 2024-04-12 Illumina公司 基于核酸酶的rna耗尽
WO2020259303A1 (zh) * 2019-06-25 2020-12-30 北京全式金生物技术有限公司 一种快速构建rna 3'端基因表达文库的方法
WO2022021279A1 (zh) * 2020-07-31 2022-02-03 北京寻因生物科技有限公司 多种核酸共标记支持物及其制作方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015168161A3 (en) 2015-12-30
WO2015168161A2 (en) 2015-11-05
AU2021203246A1 (en) 2021-06-10
US20170044525A1 (en) 2017-02-16
JP2017514487A (ja) 2017-06-08
AU2021203246B2 (en) 2023-11-30
US20210079386A1 (en) 2021-03-18
AU2018226493A1 (en) 2018-09-27
SG11201609053YA (en) 2016-11-29
JP6412954B2 (ja) 2018-10-24
AU2018226493B2 (en) 2021-02-25
CA3060708A1 (en) 2015-11-05
SG10201912516SA (en) 2020-02-27
EP3680333A1 (en) 2020-07-15
AU2024201323A1 (en) 2024-03-21
EP3137601A2 (en) 2017-03-08
AU2015253299B2 (en) 2018-06-14
CA2947426A1 (en) 2015-11-05
CA2947426C (en) 2020-01-07
AU2015253299A1 (en) 2016-11-17
EP3137601B1 (en) 2020-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106459967A (zh) 使用模板转换和标签化的多重单细胞基因表达分析
JP7351950B2 (ja) 単一細胞の核酸配列分析
US20210198659A1 (en) Nucleic Acid Sequence Analysis from Single Cells
US20200277672A1 (en) Single Cell Genomic Sequencing Using Hydrogel Based Droplets
CN109312396A (zh) 用于构建标准化核酸文库的方法和***
WO2014106167A1 (en) Digital microfluidic gene synthesis and error correction
US20230227901A1 (en) Selective Addition of Reagents to Droplets

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination