CN106459940A

CN106459940A - 新型过氧化氢酶信号序列及利用其的过氧化氢酶表达方法

Info

Publication number: CN106459940A
Application number: CN201580028272.5A
Authority: CN
Inventors: 潘在龟; 金义中; 李东范; 金恩英
Original assignee: JIANGMEN QUANTUM HI-TECH Co Ltd
Current assignee: JIANGMEN QUANTUM HI-TECH Co Ltd
Priority date: 2014-05-27
Filing date: 2015-05-26
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2035-05-26
Also published as: WO2015182941A1; KR20150136729A; CN106459940B; KR101724614B1; WO2015182941A9

Abstract

本发明涉及用于大量表达过氧化氢酶的新型信号序列及其用途，更具体地，涉及新型脂肪酶信号序列、包含所述信号序列和过氧化氢酶基因的表达载体、导入有所述表达载体的重组微生物以及通过培养所述重组微生物来大量生产过氧化氢酶的方法。根据包含本发明的新型信号序列的表达载体，不仅可以诱导特定过氧化氢酶的大量表达及分泌，还可以诱导其它靶蛋白的大量表达及分泌，从而非常有利于特定过氧化氢酶及其它靶蛋白的稳定的大量生产。

Description

新型过氧化氢酶信号序列及利用其的过氧化氢酶表达方法

技术领域

本发明涉及用于大量表达过氧化氢酶的新型信号序列及其用途，更具体地，涉及新型脂肪酶信号序列、包含所述信号序列和过氧化氢酶基因的表达载体、导入有所述表达载体的重组微生物以及通过培养所述重组微生物来大量生产过氧化氢酶的方法。

背景技术

过氧化氢酶是促进过氧化氢(H₂O₂)转换为氧(O₂)和水(H₂O)的酶。大部分的过氧化氢酶酶包含4种多肽亚单位，所述4种多肽亚单位分别具有50000至60000的分子量，每个亚单位具有一个血红素(Heme)(Wasserman and Hultin(1981)Arch.Biochem.Biophys.212:385-392；Hartig and Ruis(1986)Eur.J.Biochem.160:487-490)。

一直以来，通过使用稳定性已经被广泛知晓的酵母(Saccharomyces)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)来制备作为工业用的多种蛋白质，并且，为了表达及分泌靶蛋白，使用由作为转录激活序列的启动子(promoter)、对分泌信号序列进行编码的DNA(脱氧核糖核酸)、靶蛋白的结构基因及转录终止子(transcription terminator)形成的表达分泌质粒载体。

目前，作为为了从黑曲霉分泌靶蛋白而使用的分泌信号序列，有所要表达的基因的自身信号序列和黑曲霉葡糖糖化酶信号序列，作为强有力启动子，有葡糖糖化酶(glaA)启动子。

但是，当前仅通过目前已知的信号序列无法大量表达所需的蛋白质。因此，目前迫切需要能够更有效地大量生产作为产业上重要的酶的过氧化氢酶的信号序列，且对该信号序列的需要正持续增加。

为此，为了克服所述表达的局限，本发明人利用基因工程学方法悉心研究开发了能够大量生产过氧化氢酶的方法，其结果，发掘了用于表达过氧化氢酶的新型信号序列，并确认了在利用所述信号序列的情况下，能够大量表达过氧化氢酶，由此完成了本发明。

在本技术背景部分中记载的上述信息，仅用于提高对本发明背景的理解，因此，有可能不包含对于本发明所属技术领域的普通技术人员而言构成已公知的现有技术的信息。

发明内容

本发明的目的在于，提供用于大量表达过氧化氢酶的新型脂肪酶信号序列、包含所述信号序列和过氧化氢酶基因的表达载体、导入有所述表达载体的重组微生物。

本发明的另一目的在于，提供通过培养所述重组微生物来大量生产过氧化氢酶的方法。

为了达成上述目的，本发明提供由序列号1的氨基酸序列表示的An07g00440脂肪酶信号序列及由序列号2的氨基酸序列表示的变形脂肪酶信号序列。

并且，本发明提供包含对所述信号序列进行编码的核酸和靶蛋白基因的表达载体，以及导入有所述表达载体的重组微生物。

并且，本发明提供靶蛋白的制备方法，其特征在于，包括：步骤(a)，培养所述重组微生物来生成靶蛋白；以及步骤(b)，回收所生成的所述靶蛋白。

附图说明

图1为本发明的表达载体的示意图。A部分为详细示出克隆并***外来基因的cDNA(互补脱氧核糖核酸)时的启动子、信号序列、外来基因及前者终止密码子的各个部分的示意图，B部分为还包含An07g00440脂肪酶信号序列时的示意图，C部分为还包含An07g00440脂肪酶变形信号序列时的示意图。

图2为表示实施例1-实施例2的表达载体的图。A部分表示使用glaA启动子和pdcA终止因子且可克隆包含自身信号序列的cDNA的载体(pASP503)，B部分表示使用glaA启动子和pdcA终止因子且包含An07g00440脂肪酶信号序列的载体(pASPW504)，C部分表示使用glaA启动子和pdcA终止因子且包含An07g00440脂肪酶变形信号序列的载体(pASPV505)。

图3为表示实施例5的重组微生物培养液分析结果的图，A部分表示重组微生物pASPF503PMC的培养液分析结果，B部分表示重组微生物pASPW504PMC的培养液分析结果，C部分表示重组微生物pASPV505PMC的培养液分析结果。

具体实施方式

除非另有定义，本说明书中所使用的所有技术及科学术语，具有与本发明所属技术领域的普通技术人员的常规理解相同的含义。通常，在本说明书中使用的命名法是本技术领域中的常规使用法。

在本发明中，制备了可大量表达特定过氧化氢酶和其它靶蛋白的An07g00440脂肪酶信号序列、以及变形脂肪酶信号序列；包含所述信号序列和靶蛋白基因的表达载体；以及导入有所述表达载体的重组微生物。其结果，确认到通过培养所制备的重组微生物可大量生产过氧化氢酶。

在本发明的一实施例中，作为对靶蛋白进行编码的核酸使用序列号6的马尔尼菲青霉过氧化氢酶基因，并使用本发明的新型信号序列的情况下，确认到可大量生产过氧化氢酶。但是，所述实施例仅为例示性实施例，本发明不仅适用于特定过氧化氢酶，还可以适用于其他靶蛋白。

因此，本发明的一实施方式，涉及由序列号1的氨基酸序列表示的An07g00440脂肪酶信号序列及对所述信号序列进行编码的核酸。

本发明的特征在于，所述An07g00440脂肪酶信号序列来自黑曲霉(Aspergillusniger)，但并不限定于此。

本发明的特征在于，对所述信号序列进行编码的核酸由序列号3的碱基序列表示，但并不限定于此。

本发明的另一实施方式，涉及由序列号2的氨基酸序列表示的变形脂肪酶信号序列及对所述变形脂肪酶信号序列进行编码的核酸，所述变形脂肪酶信号序列的特征在于，作为所述An07g00440脂肪酶信号序列的第二个氨基酸的酪氨酸(tyrosine；T)被带正电荷的精氨酸(arginine；R)取代，作为第三个氨基酸的异亮氨酸(isoleucine；I)被色氨酸(tryptophane；T)取代。

本发明的特征在于，对所述变形脂肪酶信号序列进行编码的核酸由序列号4的碱基序列表示，但并不限定于此。

本发明的又一实施方式，涉及包含对所述脂肪酶信号序列进行编码的核酸及靶蛋白基因的表达载体。

在本发明中，“载体(vector)”是指包含DNA(脱氧核糖核酸)序列的DNA产品，所述DNA序列可运转地连接于能够在适合的宿主内表达DNA的适合的调节序列上。载体可以为质粒、噬菌体颗粒或简单的潜在性基因组***物。若转化成适当的宿主，则可使载体与宿主基因组无关地实现复制及作用，或者在部分情况下可整合在基因组自身。质粒为目前载体的最常见的使用形态，因此，在本发明的说明书中，“质粒(plasmid)”及“载体(vector)”有时可互换使用。

从本发明的目的考虑，优选地使用质粒载体。可使用于这种目的的典型质粒载体，具有包括：(a)复制起始点，以使每个宿主细胞包含数百个质粒载体的方式有效地实现复制；(b)抗生素耐药性基因，以使转化成质粒载体的宿主细胞被筛选；以及(c)限制酶切断部位，以使外来DNA片段***；的结构。即使不存在适当的限制酶切断部位，通过使用常规方法的合成寡核苷酸连接物(oligonucleotide adaptor)或交联剂(linker)，也可使载体和外来DNA容易地连接(ligation)。

并且，当所述基因和其它核酸序列以功能性关系配置时，可实现“可运转地连接(operably linked)”。这可以为适当的分子(例如，转录激活蛋白)与(多个)调节序列相结合时以能够表达基因的方式相连接的基因及(多个)调节序列。例如，针对前序列(pre-sequence)或分泌前导子(leader)的DNA作为参与多肽分泌的全蛋白进行表达的情况下，可运转地连接于针对多肽的DNA上；当对序列的转录起到影响时，启动子或增强子可运转地连接于编码序列上；当对序列的转录起到影响时，核糖体结合部位可运转地连接于编码序列上；或者，当以容易翻译的方式配置时，核糖体结合部位可运转地连接于编码序列上。

通常“可运转地连接”，是指所连接DNA序列相接触，并且，分泌前导子的情况下是指完成接触并存在于阅读框(reading frame)内。但是，增强子(enhancer)无需相接触。在方便的限制酶部位通过连接实现这些序列的连接。当不存在这种部位时，使用根据常规的方法的合成寡核苷酸连接物(oligonucleotide adaptor)或交联剂(linker)。

本发明的特征在于，所述靶蛋白为过氧化氢酶，所述过氧化氢酶为序列号5的马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei)过氧化氢酶蛋白质，但并不限定于此。

本发明的特征在于，所述表达载体还包含糖化酶启动子，但并不限定于此。

本发明的特征在于，所述表达载体为pASPW504PMC或pASPV505PMC，但并不限定于此。

在本发明的另一实施方式，涉及导入有对所述脂肪酶信号序列进行编码的核酸和靶蛋白基因的重组微生物，或者导入有所述表达载体的重组微生物。

本发明的特征在于，所述重组微生物为黑曲霉，但并不限定于此。

作为所述重组微生物，通常是以DNA的导入效率高，且所导入的DNA的表达效率高的宿主细胞，是包含原核细胞和真核细胞的所有微生物，可利用细菌、酵母、霉等，虽然在本发明的实施例中使用了黑曲霉，但并不限定于此，只要是可充分表达所述过氧化氢酶，则能够使用任何种类的微生物。

虽然在表达本发明的DNA序列的过程中，所有载体并不是发挥同等的功能，同样地，对相同的表达***，所有宿主并不是发挥相同的功能。但是，只要是本发明所属技术领域的普通技术人员，在无需付出创造性劳动并在未脱离本发明范围的状态下，可在其他多种载体、表达调节序列及宿主中适当地进行选择而应用。例如，在选择载体时需要考虑宿主，这是因为需要使载体在宿主内完成复制，因此还需要考虑载体的复制数量、可调节复制数量的能力及根据该载体进行编码的其它蛋白质的表达，例如抗生素标记的表达。

上述转化的重组微生物可根据公知的任一转化方法来制备。本发明的“转化(transformation)”是指：将DNA导入宿主，从而DNA作为染色体因子或通过染色体合并可进行复制，是向细胞内导入外部的DNA从而人为地引起遗传变化的现象。

并且，在本发明中，作为向宿主细胞的染色体***所述基因的方法，可使用公知的基因操作方法，作为一例，可举出利用逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体、慢病毒载体或非病毒载体的方法。

并且，除了利用表达载体的方法以外，转化方法还可利用向宿主细胞的染色体直接***的方法。

通常，可利用电穿孔法(electroporation)、脂质体转染(Lipofection)、弹道法、病毒颗粒、脂质体、免疫脂质体、多价阳离子或脂质：核酸接合物、裸DNA、人工病毒(viron)、化学物质促进DNA引入、磷酸钙(CaPO₄)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、显微注射法(microinjection)、乙酸锂-二甲基亚砜(DMSO)法等。

也可以将利用声孔效应(sonoporation)的方法，例如利用Sonitron2000***(Rich-Mar)的方法适用于核酸的传递中，其他代表性的核酸传递***包括AmaxaBiosystems(Cologne，Germany)，Maxcyte，Inc.(Rockville，Maryland)及BTX MolesularSyetem(Holliston，MA)的方法。脂质体转染方法记载于美国专利第5,049,386号、美国专利第4,946,787号及美国专利第4,897,355号中，脂质体转染试剂已被市售，例如，有TRANSFECTAMTM及LIPOFECTINTM。适合于多核苷酸的有效受体识别脂质体转染的阳离子或中性脂质，包括Felgner脂质(WO91/17424及WO91/16024)，可通过体外导入向细胞传递或者通过体内导入向靶组织传递。包含免疫脂质复合体等靶脂质体的脂质：核酸复合体的制备方法已被本技术领域所公知(Crystal，Science.，270:404-410，1995；Blaese et al.，Cancer Gene Ther.，2:291-297，1995；Behr et al.，Bioconjugate Chem.，5:382389，1994；Remy et al.，Bioconjugate Chem.，5:647-654，1994；Gao et al.，Gene Therapy.，2:710-722，1995；Ahmad et al.，Cancer Res.，52:4817-4820，1992；美国专利第4,186,183号；美国专利第4,217,344号；美国专利第4,235,871号；美国专利第4,261,975号；美国专利第4,485,054号；美国专利第4,501,728号；美国专利第4,774,085号；美国专利第4,837,028号；美国专第第4,946,787号)。

本发明的又一实施方式，涉及靶蛋白的制备方法，其特征在于，包括：步骤(a)，培养所述重组微生物来生成靶蛋白；以及步骤(b)，回收上述所生成的靶蛋白。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明。这些实施例仅用于例示本发明，本发明所属技术领域的普通技术人员应当理解本发明的范围并不限定于这些实施例。

实施例1：表达载体pASPW504及pASPW505的制备

1-1：An07g00440脂肪酶信号序列及An07g00440脂肪酶变形信号序列的化学合成

为了向黑曲霉的外部分泌过氧化氢酶，将由序列号3或序列号4表示的An07g00440脂肪酶信号序列和An07g00440脂肪酶变形信号序列进行了化学合成。由所述序列号3或序列号4的An07g00440脂肪酶信号序列和An07g00440脂肪酶变形信号序列进行编码(encipherment)的蛋白质的氨基酸序列，分别为下述序列号1或序列号2。

序列号1的An07g00440脂肪酶信号序列，由N-结构域(domain)2个氨基酸、H-结构域12个氨基酸、C-结构域5个氨基酸(共计19个氨基酸)构成。序列号2的An07g00440脂肪酶变形信号序列是，将作为第二个氨基酸的酪氨酸转化为带正电荷的精氨酸氨基酸，并将作为第三个氨基酸的异亮氨酸转化为色氨酸的信号序列。

An07g00440脂肪酶信号序列氨基酸序列(序列号1)：

myipsvlllaaslfhgata

An07g00440脂肪酶变形信号序列氨基酸序列(序列号2)：

mrwpsvlllaaslfhgata

An07g00440脂肪酶信号序列碱基序列(序列号3)：

atgtatatcccctcggtgctgcttctggccgcgagcctgttccatggcgcaacg

An07g00440脂肪酶变形信号序列碱基序列(序列号4)：

atgcgctggccctcggtgctgcttctggccgcgagcctgttccatggcgcaacggcc

1-2：表达载体pASPW504及pASPV505的制备

在信号序列碱基序列的两个末端分别化学合成69bp大小的单链寡核苷酸(oligonucleotide)，以具有限制酶ClaI和限制酶NaeI的识别部位，为了从所述单链寡核苷酸制备出双链寡核苷酸，实施了退火(annealing)反应。分别回收69bp大小的片段。在pASPF503载体中以限制酶ClaI和限制酶NaeI切割所回收的片段，并进行克隆后，分别命名为pASPW504、pASPV505(图1及图2)。

pASPF503载体包含glaA启动子和pdcA终止因子，包含潮霉素抗性基因，潮霉素B磷酸转移酶(图1及图2)。潮霉素B***于核糖体内的肽基-tRNA(转移核糖核酸)，从而阻碍肽基-tRNA的翻译(translation)。由于潮霉素B磷酸转移酶使潮霉素B非活性化，因此可筛选重组微生物。

实施例2：过氧化氢酶表达载体pASP503PMC、pASPW504PMC及pASPV505PMC的制备

序列号5的来自马尔尼菲青霉的过氧化氢酶蛋白质编码共计734个氨基酸，并包含19个信号序列(mrglyslgtlaglvvaasa)和23个前序列(acpmltgelpagsvanphhhgkr)氨基酸。通过使PMC(马尔尼菲青霉过氧化氢酶)碱基序列的两个末端分别具有限制酶ClaI和限制酶NotI的识别部位，将2205bp大小的序列号6的来自马尔尼菲青霉的过氧化氢酶基因化学合成，克隆在pGEM-B1载体。

包含信号序列的PMC DNA以ClaI和NotI进行切断，并克隆在实施例1-1的pASPF503载体，并且命名为pASP503PMC。

序列号6中未包含信号序列的PMC DNA，通过利用在序列的5'末端不具有限制酶识别部位的序列号7的PMCVF1引物(gcctgcccaatgctgacaggcg)和在序列的3'末端具有单一限制酶NotI识别部位的序列号8的PMCNotR1引物(gcggccgcctatttatccacagcaaagc)来进行化学合成，并利用两个引物进行聚合酶链反应(PCR)，由此获得2145bp片段。将所获得的片段克隆在实施例1-1的pASPW504、pASPV505载体NaeI和NotI限制酶之间，并分别命名为pASPW504PMC、pASPV505PMC。

实施例3：导入表达载体的重组微生物的制备及重组微生物的筛选方法

向黑曲霉导入实施例2的表达载体pASP503PMC、pASPW504PMC及pASPV505PMC，进行转化(Tilburn et al.，Gene.，26：205-221，1983)。为了转化，在液体培养的菌丝体处理细胞壁降解酶，从而制备原生质体后，将pASP600s DNA***基因组。并且，为了筛选重组微生物，在添加有潮霉素的琼脂培养基进行筛选，并进行传代培养。

实施例4：重组微生物的烧瓶培养

将实施例3的重组微生物中对潮霉素B具有抗性的重组微生物，点接种在相同的琼脂培养基中，以进行第一次传代。4天后，将重组微生物孢子均匀地分散在琼脂完全培养基，然后在30℃的温度下培养5～6天，直到孢子均匀地形成。

通过0.1％的Tween80，从培养5天的培养皿中以1×10⁶cell/mL收获无性孢子，并将该稀释液接种于1mL的液体完全培养基。在振荡培养器中以28℃、200rpm培养4天。将该培养液以10000g进行10分钟的离心分离，由此去除菌体，并在所回收的培养上清液中确认了活性。

实施例5：检测过氧化氢酶的酶活性

1U为每分钟分解1mole的过氧化氢的酶的量。在pH7.0的50mM磷酸钾缓冲液(Potassium phosphate buffer)49.9mL，添加30％的过氧化氢(Hydrogen Peroxide)0.1mL来制备基质。添加30ul发酵液，并在255nm的条件下检测吸光度。

其结果，分别包含pASP503PMC、pASPW504PMC、pASPV505PMC的重组微生物均呈现了过氧化酶活性，在pASP503PMC重组微生物的情况下，效价为2300unit/mL，在pASPW504PMC重组微生物的情况下，效价为26000unit/mL，在pASPV505PMC重组微生物的情况下，效价为53000unit/ml。与自身信号序列相比，在An07g00440脂肪酶信号序列中的表达量高11.3倍，在An07g00440脂肪酶变形信号序列中的表达表高2.03倍。

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)分析结果，确认到虽然PMC过氧化氢酶的分子量为75.9kD大小，但已被糖基化(Glycosylation)，因此实际大小为100kD。由此能够确认，通过本发明的An07g00440脂肪酶信号序列及An07g00440脂肪酶变形信号序列，使重组基因向黑曲霉的外部分泌(图3)。

以上，对本发明内容的特定部分进行了详细说明，但是，对于本发明所属技术领域的普通技术人员而言，上述的具体说明仅为优选实施方式，应当理解为本发明的范围并不限定在上述实施方式。因此，本发明实质上的保护范围由所附的权利要求和它们的等同物定义。

工业实用性

根据本发明的包含新型信号序列的表达载体，不仅可以诱导特定过氧化氢酶的大量表达及分泌，还可以诱导其它靶蛋白的大量表达及分泌，因此，非常有利于特定过氧化氢酶及其它靶蛋白的稳定的大量生产。

序列表Free Text

附上了电子文件。

<110> 杰诺福克斯公司

<120> 新型过氧化氢酶信号序列及利用其的过氧化氢酶表达方法

<130> PP-B1571

<150> KR 10-2014-0063977

<151> 2014-05-27

<160> 8

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 黑曲霉

<400> 1

Met Tyr Ile Pro Ser Val Leu Leu Leu Ala Ala Ser Leu Phe His Gly

1 5 10 15

Ala Thr Ala

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 黑曲霉

<400> 2

Met Arg Trp Pro Ser Val Leu Leu Leu Ala Ala Ser Leu Phe His Gly

1 5 10 15

Ala Thr Ala

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 黑曲霉

<400> 3

atgtatatcc cctcggtgct gcttctggcc gcgagcctgt tccatggcgc aacg 54

<210> 4

<211> 57

<212> DNA

<213> 黑曲霉

<400> 4

atgcgctggc cctcggtgct gcttctggcc gcgagcctgt tccatggcgc aacggcc 57

<210> 5

<211> 734

<212> PRT

<213> 马尔尼菲青霉

<220>

<221> SIGNAL

<222> (1)..(19)

<400> 5

Met Arg Gly Leu Tyr Ser Leu Gly Thr Leu Ala Gly Leu Val Val Ala

1 5 10 15

Ala Ser Ala Ala Cys Pro Met Leu Thr Gly Glu Leu Pro Ala Gly Ser

20 25 30

Val Ala Asn Pro His His His Gly Lys Arg Asp Asp Ser Lys Ala Ser

35 40 45

Ser Glu Thr Glu Thr Phe Leu Ser Glu Phe Tyr Leu Asn Asp Asn Asp

50 55 60

Ser Phe Leu Thr Ser Asp Val Gly Gly Pro Ile Glu Asp Gln His Ser

65 70 75 80

Leu Lys Ala Gly Ile Arg Gly Ser Thr Leu Leu Glu Asp Phe Ile Phe

85 90 95

Arg Gln Lys Ile Gln His Phe Asp His Glu Arg Ile Pro Glu Arg Ala

100 105 110

Val His Ala Arg Gly Ala Gly Ala His Gly Val Phe Thr Ser Tyr Ala

115 120 125

Asp Trp Ser Asn Ile Thr Ala Ala Ser Phe Leu Gly Ala Ala Gly Lys

130 135 140

Glu Thr Pro Thr Phe Val Arg Phe Ser Thr Val Ala Gly Ser Arg Gly

145 150 155 160

Ser Ala Asp Thr Ala Arg Asp Val His Gly Phe Ala Thr Arg Phe Tyr

165 170 175

Thr Glu Glu Gly Asn Tyr Asp Ile Val Gly Asn Asn Ile Pro Val Phe

180 185 190

Phe Ile Gln Asp Ala Ile Leu Phe Pro Asp Leu Ile His Ala Val Lys

195 200 205

Pro Gln Pro Ala Asn Glu Ile Pro Gln Ala Ala Thr Ala His Asp Thr

210 215 220

Ala Tyr Asp Phe Phe Gly Gln Gln Pro Ser Thr Leu His Thr Leu Phe

225 230 235 240

Trp Ala Met Ser Gly His Gly Ile Pro Arg Ser Phe Arg His Val Asp

245 250 255

Gly Phe Gly Val His Thr Tyr Arg Phe Val Thr Asp Asn Gly Ser Ser

260 265 270

Lys Leu Val Lys Phe His Trp Thr Ser Leu Gln Gly Arg Ala Ser Leu

275 280 285

Val Trp Glu Glu Ala Gln Ala Thr Ala Gly Lys Asn Ala Asp Tyr Met

290 295 300

Arg Gln Asp Leu Tyr Asp Ser Ile Lys Ala Gly Arg Tyr Pro Glu Trp

305 310 315 320

Glu Leu Gly Val Gln Ile Ile Asn Glu Ser Asp Val Leu Ser Tyr Gly

325 330 335

Phe Asp Leu Leu Asp Pro Thr Lys Ile Leu Pro Val Glu Glu Val Pro

340 345 350

Ile Thr Pro Leu Gly Lys Met Gln Leu Asn Arg Asn Pro Leu Asn Tyr

355 360 365

Phe Ala Glu Thr Glu Gln Val Met Phe Gln Pro Gly His Ile Val Arg

370 375 380

Gly Ile Asp Phe Thr Glu Asp Pro Leu Leu Gln Gly Arg Leu Phe Ser

385 390 395 400

Tyr Leu Asp Thr Gln Leu Asn Arg Asn Gly Gly Pro Asn Phe Glu Gln

405 410 415

Ile Pro Ile Asn Arg Pro Arg Val Pro Ile His Asn Asn Asn Arg Asp

420 425 430

Gly Phe Gly Gln Met Phe Ile Pro Leu Asn Gln Ala Ala Tyr Ser Pro

435 440 445

Asn Thr Leu Asn Ser Gly Ser Pro Lys Gln Ala Asn Glu Thr Val Gly

450 455 460

Asn Gly Phe Phe Thr Thr Pro Gly Arg Ser Ala Asp Gly His Leu Val

465 470 475 480

Arg Ala Thr Ser Pro Thr Phe Ala Asp Val Trp Ser Gln Pro Gly Leu

485 490 495

Phe Tyr Asn Ser Leu Thr Ala Thr Glu Gln Gln Phe Val Ile Asn Gly

500 505 510

Leu Arg Phe Glu Leu Ser Asn Val Gly Ser Glu Asp Val Lys Arg Asn

515 520 525

Phe Ile Thr Gln Val Asn Arg Val Asn Asn Thr Leu Ala Thr Leu Val

530 535 540

Ala Thr Ala Ile Gly Val Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Thr Tyr Tyr

545 550 555 560

His Lys Asn Lys Thr Ser Asn Val Gly Thr Phe Gly Thr Pro Leu Lys

565 570 575

Lys Leu Asp Gly Leu Arg Val Ala Val Leu Ala Ser Val Asn Asp Glu

580 585 590

Arg Ser Ile Ala Glu Gly Gln Ala Leu Ala Lys Arg Leu Ala Asn Ser

595 600 605

Asn Val Asp Val Val Ile Val Ala Glu Lys Leu Ala Ser Asn Val Thr

610 615 620

Ala Thr Tyr Ser Glu Ser Asp Ala Thr Asn Phe Asp Ala Val Ile Val

625 630 635 640

Thr Ser Gly Ala Asp Gly Leu Phe Gly Leu Gln Thr Phe Thr Ser Thr

645 650 655

Ser Asn Ile Thr Leu Tyr Pro Ala Gly Arg Pro Thr Gln Ile Met Val

660 665 670

Asp Ala Phe Arg Phe Gly Lys Pro Val Gly Ala Val Gly Ser Ala Arg

675 680 685

Ser Ala Leu Ser Ala Val Asp Ile Ser Thr Asn Arg Thr Gly Val Val

690 695 700

Ile Gly Asp Ser Val Asn Asp Asp Phe Val Asn Gln Leu Thr Lys Asp

705 710 715 720

Leu Ala Thr Phe Lys Phe Leu Asp Arg Phe Ala Val Asp Lys

725 730

<210> 6

<211> 2205

<212> DNA

<213> 马尔尼菲青霉

<220>

<221> sig_peptide

<222> (1)..(49)

<223> 信号序列

<400> 6

atgcgaggat tatactccct cggaactttg gccggtctcg ttgtagctgc ttcggctgcc 60

tgcccaatgc tgacaggcga gctcccagcg ggcagtgttg cgaaccctca tcaccacgga 120

aagcgtgacg actccaaggc ttcctctgaa acagaaacgt ttctatccga gttttacctc 180

aacgacaatg attccttcct tacctccgat gtaggcggtc caattgagga tcaacacagc 240

ttgaaggctg gcatccgtgg gtcaacactc ttggaagatt tcatcttccg tcagaagatc 300

cagcattttg atcatgagcg tataccggaa cgcgccgtgc atgctcgagg tgcaggcgct 360

catggtgtat tcacctcata tgccgactgg tccaacatca ctgctgcctc attcttagga 420

gctgccggaa aggaaacgcc cacttttgtt cgcttctcga ctgttgcagg cagccgcgga 480

agtgctgata ccgctcgcga cgttcacggt ttcgctactc ggttctatac tgaggaagga 540

aattacgaca tcgttggaaa caacatcccc gtcttcttca tccaagatgc catcttattc 600

ccagatctca tccatgctgt caagccacag ccagccaatg aaatcccaca ggctgctact 660

gcacacgaca ctgcatatga cttctttggc caacagccga gcaccttgca tacccttttc 720

tgggcaatgt caggtcacgg tatcccacgg tctttccgtc acgttgatgg gttcggtgtt 780

cacacctatc ggtttgtgac tgacaatggt tcctccaagc tggtcaaatt ccactggaca 840

tctctacagg gccgagccag tcttgtctgg gaggaggctc aagctactgc cggcaagaat 900

gccgactata tgagacagga tttgtacgat agtatcaaag ctggccgtta tccggagtgg 960

gagctcggtg tgcaaattat caatgagtcg gatgttctaa gctacggatt cgacctcttg 1020

gatccaacca agattcttcc agtcgaagaa gttccaatca ctccgctggg aaaaatgcaa 1080

ctcaaccgta atcctttgaa ttattttgcc gagaccgagc aagtcatgtt ccaacccggt 1140

cacattgttc gtggtatcga tttcactgag gatcctctcc tccaaggtcg tctattttca 1200

tacctcgaca ctcaattgaa tcgcaatggt ggtcccaact ttgaacaaat tccgatcaac 1260

cgtccccgtg ttcctattca caataataac cgcgacggat ttggccaaat gtttatccca 1320

ctaaaccaag cagcatactc ccccaacacc ttaaacagcg gctctccaaa acaggcaaac 1380

gaaactgtcg gaaatggctt tttcacaacc ccggggcgtt cggcagatgg acaccttgtt 1440

cgtgccacta gcccaacatt tgcagacgtg tggtctcagc ctggtttgtt ctataattca 1500

ttgacagcca ccgagcagca gttcgtgatc aatggtttgc ggttcgagtt gtccaatgta 1560

ggaagtgagg acgttaaaag aaacttcatt actcaggtca accgtgtgaa caacacgctg 1620

gcgacgcttg tggctacagc aattggagtc cccgctccaa aacctgagcc aacatactac 1680

cacaagaaca agacgtctaa tgttggaaca tttggtaccc cattgaagaa gcttgacggt 1740

ctcagagtcg ctgtccttgc ttcagtgaac gatgaacgca gtattgccga gggacaagca 1800

ttagcaaaac gtctggcaaa ttctaacgtg gacgtcgtca ttgtcgccga gaaacttgcg 1860

tcaaatgtga cggctaccta ctccgagtca gacgcaacaa actttgacgc ggttatcgtg 1920

acttcgggag ctgatggtct cttcggactt cagactttca caagcacatc taacataact 1980

ctttaccccg caggccgtcc tactcagatt atggtcgatg cttttcgatt cggcaagcca 2040

gtaggagcgg tgggcagcgc caggtcagcc ttgtcagcgg tggatatcag cactaatcgc 2100

actggtgtgg ttattggcga ttccgtcaat gacgactttg tcaaccagct aacgaaggac 2160

ctagcaacat tcaagttcct ggatcgcttt gctgtggata aatag 2205

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PMCVF1引物

<400> 7

gcctgcccaa tgctgacagg cg 22

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PMCNotR1引物

<400> 8

gcggccgcct atttatccac agcaaagc 28

Claims

1.一种脂肪酶信号序列，其特征在于，由序列号1的氨基酸序列表示。

2.根据权利要求1所述的脂肪酶信号序列，其特征在于，所述脂肪酶信号序列来自黑曲霉。

3.一种核酸，其特征在于，对权利要求1所述的脂肪酶信号序列进行编码。

4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述核酸由序列号3的碱基序列表示。

5.一种由序列号2的氨基酸序列表示的变形脂肪酶信号序列，其特征在于，作为权利要求1所述的脂肪酶信号序列的第二个氨基酸的酪氨酸被带正电荷的精氨酸取代，作为第三个氨基酸的异亮氨酸被色氨酸取代。

6.一种核酸，其特征在于，对权利要求5所述的变形脂肪酶信号序列进行编码。

7.根据权利要求6所述的核酸，其特征在于，所述核酸由序列号4的碱基序列表示。

8.一种表达载体，其特征在于，包含对权利要求1或5所述的脂肪酶信号序列进行编码的核酸及靶蛋白基因。

9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述靶蛋白为过氧化氢酶。

10.根据权利要求9所述的表达载体，其特征在于，所述过氧化氢酶是序列号5的马尔尼菲青霉过氧化氢酶蛋白质。

11.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，还包括糖化酶启动子。

12.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pASPW504PMC或pASPV505PMC。

13.一种重组微生物，其特征在于，导入有对权利要求1或5所述的脂肪酶信号序列进行编码的核酸和靶蛋白基因。

14.一种重组微生物，其特征在于，导入有权利要求8所述的表达载体。

15.根据权利要求14所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物为黑曲霉。

16.一种靶蛋白的制备方法，其特征在于，包括：

步骤(a)，培养权利要求13所述的重组微生物来生成靶蛋白；以及

步骤(b)，回收所述生成的靶蛋白。

17.一种靶蛋白的制备方法，其特征在于，包括：

步骤(a)，培养权利要求14所述的重组微生物来生成靶蛋白；以及

步骤(b)，回收所述生成的靶蛋白。