CN106442459A - 一种不同亲和配基功能化的金基萃取材料及其在表面等离激元光学亲和夹心分析中的应用 - Google Patents

一种不同亲和配基功能化的金基萃取材料及其在表面等离激元光学亲和夹心分析中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种不同亲和配基功能化的金基萃取材料及其在表面等离激元光学亲和夹心分析中的应用。该萃取材料表面修饰有金薄层，金薄层表面修饰有抗体、分子印迹聚合物或核酸等亲和识别配基或材料。利用不同亲和配基功能化的金基萃取材料将待测样品中目标分析物专一性萃取至萃取材料表面，将修饰了能识别该目标分析物的亲和配基的银基纳米拉曼探针对目标分析物进行标记，得到由萃取材料‑目标化合物‑拉曼探针构成的三明治型复合物，通过检测拉曼信号即可测定目标分析物的含量。本发明萃取材料专一性高，可有效除去复杂样品基体的干扰；检测灵敏度高，可达单分子水平；方法简单，分析速度快；用于活体单细胞分析、活体动物分析、免疫生化分析等。

Description

一种不同亲和配基功能化的金基萃取材料及其在表面等离激 元光学亲和夹心分析中的应用
技术领域
本发明属于生化分析、功能化材料、亲和识别和光谱检测领域，具体涉及一种不同亲和配基功能化的金基萃取材料及其在表面等离激元光学亲和夹心分析中的应用。
背景技术
生命科学研究及临床诊断等领域中经常面临对复杂生物样品的分析。生物样品的组成复杂，结构类似物大量存在，目标分析物的浓度通常极低，而样品基体干扰严重，这些因素为生命分析化学提出了重要的挑战。复杂生物样品分析中面临两个关键问题：一、目标物的专一富集，二、高灵敏检测。免疫分析，尤其是酶联免疫分析，是目前最常见的复杂样品分析手段。该方法采用抗体对目标物进行专一富集，采用化学发光、荧光和放射性同位素检测等实现高灵敏检测。但是，通常的免疫分析法存在着分析时间长、样品需要量大和容易受工作环境和样品环境干扰等缺点，而且不适用于单细胞和活体动物分析。此外，通常的免疫分析法采用抗体和酶等生物分子实现专一识别和信号放大等作用，而这些生物分子的稳定性较差、价格昂贵，不仅对分析结果的可靠性存在影响而且使得分析成本较高。因此，能克服常规免疫分析法的弊端且能适用更宽样品范围的新颖分析方法将具有重要的价值和应用前景。
随着分子识别、功能化材料和光学检测等领域的发展，各种各样的可应用于复杂生物样品的新颖分析方法不断出现。一方面，分子印迹聚合物(MIP)[G.Wulff，A.Sarhan，Angew.Chem.Int.Ed.《应用化学》1972，11，341-345；G.Vlatakis，L.I.Andersson，R.Müller，K.Mosbach，Nature《自然》1993，361，645-647]和核酸适配体[A.B.Iliuk，L.H.Hu，W.A.Tao，Anal.Chem.《分析化学》2011，83，4440-4452]等能专一识别特定化合物的材料和分子逐渐发展成为抗体的重要补充和替代。另一方面，表面等离激元光学[N.P.W.Pieczonka，R.F.Aroca，RF.Chem.Soc.Rev.《化学学会评论》37，946-954]等新兴的检测手段无需酶反应和聚合酶链式反应等步骤繁琐的信号放大方式，可以实现单分子水平的超高检测灵敏度。 我们已经利用分子印迹聚合物和表面增强拉曼散射(SERS)构建了免酶、免抗体的新颖免疫分析法，成功应用于人血清中痕量的糖蛋白疾病标志物的检测(刘震，叶金，一种基于分子印迹技术和拉曼光谱的快速，高灵敏度，专一识别糖蛋白的检测方法的应用，中国发明专利，申请号201410255065.0，申请日期：2014年6月11日)。但该方法的检测限为10-12摩尔/升，不能胜任浓度更低的样品，同时也不能应用于单细胞和活体动物分析。
细胞是生命体结构和生命活动的基本单位。基于细胞的研究是生命科学研究的基础。通常的生命科学研究主要以大量细胞为研究对象。但是，由于同种细胞的不同个体间存在着显著的微观不均一性，基于大量细胞的实验结果难以精准反映生命活动的本质和规律。基于单细胞的生命科学研究将能在更深的层次上揭示生命活动的本质和规律，为探究重大疾病的起因、发展和治疗提供更可靠的科学依据。2015年，美国政府推出“精准医学计划”。精准诊断是精准医学的关键，而精准诊断离不开单细胞分析技术。活体单细胞分析技术在很多应用领域中是至关重要的，如神经科学、干细胞生物学、发育生物学、癌症诊断和个性化药物筛选等等。然而，活体单细胞分析技术面临着巨大的挑战。哺乳动物细胞一般较小(直径通常为10-30微米)，体积为10-13-10-11升，所测组分含量常在10-18-10-15摩尔水平，有时甚至低至10-21摩尔，一些对细胞起关键作用的生物分子的含量更低，使得检测与分析变得非常困难。另一方面，活体单细胞分析要求细胞在分析后仍保持存活，目前的大多数的单细胞分析技术均难以胜任。已有的单细胞分析技术主要分为以下六类：一、微分离技术，二、微流控芯片，三、光学成像，四、质谱分析，五、流式细胞术，六、单细胞测序。这些技术中，目前只有基于激光诱导荧光检测的微分离技术、微流控芯片和光学成像分析能适用于单细胞中低拷贝数(拷贝数≤1000/细胞)蛋白质的分析，但是这些分析技术在进行单细胞分析时，要么需要将被测细胞进行破碎，要么需要在细胞内引入标记试剂从而很难保证细胞的内部组成和状态不受影响。
活体动物分析是生命科学研究的重要研究手段之一。在活体层面原位地获取与生物功能和疾病相关的生物/化学信息，对于准确地阐述疾病发生发展的规律和机制以及实现疾病的早期诊断与治疗等具有十分重要的意义。目前用于活体动物分析的主要有以下几类：一、活体动物成像分析技术，二、选择性光、电、生 物传感技术，三、基于活体取样的联用分析技术。这些方法通常需要使用体积较大或结构较复杂的仪器设备，主要用于实验室内的分析，难以应用于床旁检测和现场分析。
发明内容
针对活体单细胞、活体动物、血液、尿液等复杂样品体系中痕量组分分析存在的样品前处理与检测方法瓶颈问题，本发明的目的在于提供一种不同亲和配基功能化的金基萃取材料以及基于该金基萃取材料的表面等离激元光学亲和夹心分析法，利用该萃取材料及方法在活体单细胞、活体动物、血清、尿液中的蛋白质、核酸和糖类等生物分子分析检测中的应用，以及在其它具有重要检测意义的可通过金基萃取材料萃取识别的化合物中的应用。
该技术包括萃取材料(含萃取阵列和萃取探针)和纳米拉曼探针的制备。萃取材料、目标分析物和纳米拉曼探针间通过免疫或亲和作用形成三明治型复合物。萃取材料和纳米拉曼探针表面的抗体、核酸或人工抗体的专一性、表面等离激元光学的高灵敏度使得该方法可以实现对复杂环境中痕量分析物进行快速识别和专一性检测。
为了解决发明内容中的技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种不同亲和配基功能化的金基萃取材料，包括萃取材料，在萃取材料的表面修饰有金薄层形成基础萃取材料，在基础萃取材料的表面修饰有抗体、分子印迹聚合物或核酸等亲和识别配基或材料。金基萃取材料能专一识别待测化合物，且在激光照射下能产生表面等离子波，该表面等离子波能显著增强标记到萃取材料表面的银基纳米拉曼探针的表面增强拉曼散射信号。
萃取材料形式主要有萃取探针和萃取阵列两种形式。萃取探针分为微探针和一般探针两种。
上述不同亲和配基功能化萃取材料的制备方法，所述萃取材料的表面通过化学还原的方法修饰有金薄层，还原温度为35-55℃，还原时间为4-5小时，得到修饰有金薄层的萃取材料为基础萃取材料，然后在基础萃取材料的表面修饰分子印迹聚合物(MIP)、抗体、核酸或者硼酸等具有识别特定目标分析物作用的亲和配基。
所述的不同亲和配基功能化的金基萃取材料在表面等离激元光学和亲和夹 心分析中的应用。
该应用又称为表面等离激元光学亲和夹心分析法，原理及特征如下：利用上述不同亲和配基功能化的金基萃取材料直接从待测样品中萃取特定的目标分析物，随后与修饰了能识别所述目标分析物的亲和配基的银基纳米拉曼探针温育，从而形成萃取材料-目标分析物-拉曼探针三明治型复合物结构，再当激光光束照射在所述三明治型复合物结构表面时会发生表面等离激元光学效应，银基拉曼探针产生表面增强拉曼散射，金基萃取材料产生表面等离子波，该表面等离子波进一步增强银基拉曼探针的表面增强拉曼散射信号，从而大大增强检测灵敏度，检测限可达单分子水平。通过检测拉曼信号即可测定待测复杂样品中目标分析物的含量。根据分析样品的不同，该技术包含活体单细胞分析、活体动物分析、免疫生化分析和植物分析等亚技术。
所述不同亲和配基功能化的银基纳米拉曼探针是由能有效增强拉曼信号的银纳米粒子、拉曼活性分子以及能识别目标分析物的亲和配基组成。具体结构为：所述的不同亲和配基功能化的银基纳米拉曼探针的内核为银纳米颗粒，所述纳米拉曼探针的表面修饰了具有拉曼活性分子并用不同的亲和配基(抗体、核酸、硼酸等)进一步修饰，该纳米拉曼探针能专一识别目标化合物，并能产生显著的表面增强拉曼散射信号。
上述银基纳米拉曼探针制备方法为：以柠檬酸钠还原AgNO3形成的粒径一般为30-100nm的银纳米粒子为纳米拉曼探针的核，在银核的表面修饰一层具有拉曼增强作用的报告分子与能对萃取出的目标分析物具有识别作用的亲和配基。
所述表面等离激元光学亲和夹心分析法中，萃取材料萃取时间为2-30分钟；纳米拉曼探针的温育时间为2-30分钟。
该发明所述的待测样品，不仅包括活体单细胞、活体动物、血清、尿液，还包括其它具有重要检测意义的可通过亲和夹心法识别的化合物，例如食品、果蔬、植物、中成药等典型的复杂待测样品。
该发明所述的目标分析物，不仅包括蛋白质(糖蛋白、非糖蛋白)、核酸(DNA、RNA)、糖类等生物分子，还包括其它类型的具有重要检测意义的痕量组分分子，例如蔬菜瓜果的农残组分、食品中的掺杂组分、植物中的活性成分等。
本发明中，通过双抗体或人工抗体的使用，以确保检测的高专一性。由于常 规抗体制备困难、稳定性差且价格昂贵，因此，本发明中采用人工抗体(分子印迹聚合物)替代常规抗体。分子印迹技术作为一种既能模拟抗体又能克服抗体缺陷的方法逐渐发展起来。分子印迹技术是先将模板分子与功能单体按一定比例形成配合物，再加入交联剂形成聚合物从而将模板分子固定并包裹在聚合物中，然后采用合适的方法将模板分子去除，从而在聚合物中留下形状与模板分子互补的空腔及选择性的结合位点。分子印迹技术具有以下优点：一、预定性，可以根据使用目的的不同而制备不同的分子印迹聚合物；二、专一性，能专一地识别模板分子，与模板分子间形成类似于抗体与抗原间的相互作用(分子印迹聚合物因此被称为“塑料抗体”或“人工抗体”)；三、实用性，分子印迹聚合物可以通过化学合成大规模制备，价格低廉，而且适用于各种反应条件、稳定性高、使用寿命长。近年来，刘震等在分子印迹技术方面取得了重要的进展，发展了一系列硼亲和分子印迹仿生材料作为抗体的替代品[刘震，李澧，一种专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物及其制法和应用。中国发明专利，专利号：2011104161988，授权日期：2014.01.08；刘震，王双寿，毕晓东，一种可控、通用的定向表面印迹方法以及所得分子印迹聚合物生物应用。中国发明专利，申请号：201310339600.6；Xiaodong Bi，Zhen Liu，Anal.Chem.《分析化学》2014，86，12382-12389；Zijun Bie，Yang Chen，Jin Ye，Shuangshou Wang，Zhen Liu，Angew.Chem.Int.Ed.《德国应用化学》2015，54，1-6]，不但很好地保留了类似于抗体的专一性与结合力，同时比抗体稳定、廉价。本发明中所述人工抗体是指通过硼亲和可控定向表面印迹法[S.S.Wang，J.Ye，Z.J.Bie，Z.Liu，Chem.Sci.《化学科学》2014，5，1135-1140；X.D.Bi，Z.Liu，Anal.Chem.《分析化学》2014，86，959-966]制备而成的分子印迹聚合物。
本发明金基萃取材料的可应用性已从以下几个方面得到实验证实：第一、活体单细胞分析。已经成功检测到单个活细胞中低拷贝数的目标蛋白质和核酸，根据蛋白质或核酸癌症标志物表达量的差异，可以区分正常细胞和癌细胞。该技术可以应用于单细胞质量分析、单细胞疾病标志物分析，以及单细胞生化研究。第二、活体动物分析。已经实现活体动物中的癌症标志物蛋白质和核酸的检测和表达差异分析。该技术可以用活体动物疾病标志物检测，以及基于活体动物的生化及医学研究。第三、免疫生化分析。已经实现了血清中的疾病标志物碱性磷酸酶 的专一灵敏检测。常规的免疫分析采用抗体识别目标蛋白质，而本技术除抗体外，还可以通过分子印迹聚合物或核酸对目标蛋白实现专一识别。常规的免疫分析采用紫外-可见光吸收、荧光或化学发光等方式检测，存在着分析步骤长和易受样品及工作环境的影响等不利因素，而本技术采用表面等离增强拉曼散射检测，可克服这些不利因素，而且具有灵敏度高的优点。该技术可以用于基于血液、尿液等复杂生化样品的分析。第四、体育运动***检测。体育运动中的很多违禁药品在检测时的浓度极低，是对检测方法的严重挑战。利用本方法，实现了人体尿样中人***的快速、专一、灵敏检测。可以扩展到其他蛋白质***的检测。第五、苹果等水果内单糖等糖类化合物的分析。该技术与便携式拉曼光谱仪结合，可以用于床旁检测和现场分析。
在免疫生化分析方面的应用，萃取阵列可专一萃取和富集添加到其表面的血液、尿液等生化样品中的目标化合物，萃取阵列经标记后，通过读取探针表面的拉曼信号测定目标物的含量。该技术可以用于血液、尿液等生化样品中的疾病标志物的分析，还可以用于体育运动中***的检测。
在所述的植物分析方面，萃取探针可直接***到植物的果实、根、茎、叶等部位，其表面修饰的亲和识别材料或配基能高效地萃取和富集待测部位内的目标化合物，萃取探针经标记后，通过读取探针表面的拉曼信号测定目标物的含量。该技术可以应用于果蔬农药残留检测、植物活性成分分析和相关研究等领域。
有益效果：本发明首次描述了一种基于亲和萃取和表面等离激元光学的高专一性、高灵敏度的快速亲和夹心法及相关材料(适用于活体单细胞、活体动物、复杂待测样品中痕量目标分析物检测分析的萃取材料和纳米拉曼探针)的制备技术。与其它分析技术相比，该方法具有以下显著优点：第一、使用了抗体、核酸、人工抗体以及对应的二抗或亲和配基双重识别特定分析物分子，方法特异性很强；第二、采用独特的金属微、纳探针组合获得特殊的表面等离激元光学效应，极大地放大了拉曼光谱信号，检测限达单分子水平，可检测到活体单细胞、活体动物、复杂样品中极低浓度的特定分析物分子(蛋白、核酸、糖类等)；第三、该方法的分析速度快，从特定分析物的萃取到最终信号的读取，仅需要5-60分钟；第四、该分析方法对活体单细胞、活体动物的损伤极小，进行分析后单细胞和动物仍存活。该方法可应用于基于单细胞和活体动物的疾病标志物分析，药物 筛选以及基于活体动物分析的相关研究，细胞质量控制分析、个性化药物筛选和基于活体单细胞分析的相关应用，血液、尿液等中的疾病标志物或违禁成分的分析；第五、该技术可以用于床旁检测和现场分析。
本发明提出了一种基于亲和微萃取及表面等离激元光学检测的高专一性、高灵敏度、分析速度快的表面等离激元亲和夹心法。该方法利用抗体、分子印迹聚合物和核酸等作为亲和配基，可实现从活体单细胞和活体动物等复杂样品体系中的痕量目标化合物的高专一性萃取。该方法采用新颖的表面等离激元光学检测，检测灵敏度达到单分子检测水平，可以检测活体单细胞及活体动物中低拷贝数的蛋白质以及血清等复杂样品中的痕量蛋白质、核酸或糖类等物质。现有的表面等离激元光学检测技术需要使用粗糙的表面和特殊的纳米结构，不适用于对活体单细胞和活体动物的活体萃取。而能适用于活体单细胞和活体动物的活体萃取需要表面光滑的微萃取探针，不利于高灵敏度的获得。为了解决该问题，本技术创造性地利用光滑的金基微萃取探针与银基纳米拉曼探针相结合，利用金基萃取材料产生的表面等离子波增强银基纳米拉曼探针的表面增强拉曼散射信号(表面等离增强拉曼散射，PERS)，从而达到高灵敏度检测和活体萃取的和谐与统一。为了达到技术的通用性，本发明采用抗体、分子印迹聚合物和核酸等作为亲和萃取配基，适用的目标分析物包括(但不限于)蛋白、micro RNA和糖类化合物。
附图说明
图1为本发明中亲和萃取材料用于表面等离激元光学亲和夹心分析法的原理示意图。
图2为本发明中不同形式的萃取材料表征及其在不同分析对象中的应用。图2a为适用于活体单细胞分析的微萃取探针外观表征图；图2b为微萃取探针***活体单细胞中萃取特定目标分析物的静态显微图片；图2c为适用于活体动物分析的微萃取探针外观表征图；图2d为微萃取探针***活体动物体中特定部位萃取目标分析物的照片；图2e为适用于血清、尿液等临床复杂样品的微萃取阵列，其中，左图为未萃取样品前的阵列外观表征图，右图为萃取样品后的阵列外观图。
图3为本发明中纳米拉曼探针扫面电镜表征图，其中，图3a为适用于分子 印迹聚合物功能化萃取材料的纳米拉曼探针；图3b为适用于抗体功能化萃取材料的纳米拉曼探针；图3c为适用于核酸功能化萃取材料的纳米拉曼探针。
图4为不同材质萃取材料、纳米拉曼探针组合的拉曼信号强度柱状图。
图5为用于不同分析对象的萃取材料的干扰性实验。其中，图5a为分子印迹聚合物萃取材料的干扰性实验，干扰物质分别为：牛血清白蛋白(BSA)、转铁蛋白(TRF)、辣根过氧化物酶(HRP)、果糖(Fru)及葡萄糖(Glu)，浓度均为1mg/mL，干扰物浓度为目标蛋白碱性磷酸酶(ALP)(1500U/L，5.95×10-9M)浓度的3300倍；图5b为抗体功能化萃取材料的干扰性实验，干扰物质分别为：牛血清白蛋白、转铁蛋白、辣根过氧化物酶、果糖及葡萄糖，浓度均为1mg/mL，约为目标蛋白survivin(100ng/mL)的10000倍；图5c为核酸修饰的萃取材料的干扰性实验，干扰物质分别为：单碱基错配序列(miR-21A)、双碱基错配序列(miR-21B)以及四碱基错配序列(miR-21C和miR-21D)。
图6为不同类型萃取材料对不同浓度目标分析物的相应曲线。其中，图6a为ALP印迹萃取材料检测ALP的信号强度与浓度的关系；图6b为anti-survivin功能化萃取材料检测survivin的信号强度与浓度的关系；图6c为核酸功能化材料检测microRNA的信号强度与浓度的关系。
图7为本发明中不同亲和配基功能化萃取材料在活体单细胞中的分析应用。图7a为萃取微探针***单个细胞中的示意图；图7b为ALP印迹聚合物萃取微探针对HeLa细胞中的ALP进行萃取后，经纳米拉曼探针标记之后，从针尖开始进行扫描得到的拉曼信号分布情况；图7c和图7d，分子印迹聚合物萃取微探针对正常细胞(L-02)、肝癌细胞(HepG-2)、海拉细胞(HeLa)和乳腺癌细胞(MCF-7)中碱性磷酸酶(ALP)的分析结果及数据统计结果；图7e和图7f，抗体功能化的微探针在正常细胞(L-02)、肝癌细胞(HepG-2)、海拉细胞(HeLa)、乳腺癌细胞(MCF-7)中对survivin蛋白的分析结果及数据统计结果。
图8为本发明中不同亲和配基功能化萃取材料用于活体单细胞检测分析中，ALP印迹微探针在不同细胞系的不同单个细胞中检测ALP的拉曼光谱图。图8a，正常肝细胞(L-02)；图8b，肝癌细胞(HepG-2)；图8c，海拉(HeLa)细胞；图8d，乳腺癌细胞(MCF-7)。
图9为本发明中不同亲和配基功能化萃取材料用于活体单细胞检测分析 中，anti-survivin抗体功能化的微探针在不同细胞系中不同单个细胞检测survivin蛋白的拉曼光谱图。图9a，正常肝细胞(L-02)；图9b，肝癌细胞(HepG-2)；图9c，海拉(HeLa)细胞；图9d，乳腺癌细胞(MCF-7)。
图10为萃取探针在活体小动物中的应用。其中图10a为anti-survivin抗体功能化的微探针对正常裸鼠、腋下种植了HepG-2细胞、乳腺癌细胞(MCF-7)、海拉细胞(HeLa)和胃癌细胞(MGC-803)的裸鼠肿瘤部位中survivin蛋白的检测；图10b为用anti-survivin抗体功能化的微探针检测上述组织中survivin蛋白后的平均拉曼信号强度；图10c为ALP印迹微探针对正常裸鼠、腋下种植了HepG-2细胞、乳腺癌细胞(MCF-7)、海拉细胞(HeLa)和胃癌细胞(MGC-803)的裸鼠肿瘤部位中ALP的检测；图10d表示用ALP印迹微探针检测上述组织中ALP后的平均拉曼信号强度。
图11为本发明中采用不同亲和配基功能化萃取材料检测种植了不同肿瘤的裸鼠的肿瘤部位中ALP的拉曼光谱图。图11a，正常裸鼠；图11b，种植了HepG-2细胞的裸鼠；图11c，种植了MCF-7细胞的裸鼠；图11d，种植了HeLa细胞的裸鼠；图11e，种植了MGC-803细胞的裸鼠。
图12为本发明中采用不同亲和配基功能化萃取材料检测种植了不同肿瘤的裸鼠的肿瘤部位中survivin蛋白的拉曼光谱图。图12a，正常裸鼠；图12b，种植了HepG-2细胞的裸鼠；图12c，种植了MCF-7细胞的裸鼠；图12d，种植了HeLa细胞的裸鼠；图12e，种植了MGC-803细胞的裸鼠。
图13为本发明中采用不同亲和配基功能化萃取材料在血清样品中的检测分析。其中，图13a为ALP印迹的微萃取阵列对血清样品中ALP以及标准加入法检测的拉曼信号柱状图；图13b为相应的拉曼光谱图。
图14为本发明中采用不同亲和配基功能化萃取材料分析人尿及加标人尿样品中的人***(EPO)。其中，图14a为EPO印迹的微萃取阵列对人尿及加标人尿样品中EPO进行分析的拉曼光谱图；图14b为EPO印迹的微萃取阵列对人尿及加标人尿样品中EPO进行分析的拉曼信号柱状图。
图15为本发明中不同亲和配基功能化萃取材料用于正常乳腺细胞(MCF-10A)和乳腺癌细胞(MCF-7)的不同活体单细胞中microRNA-21分析的信号强度比较。
图16为本发明中不同亲和配基功能化萃取材料用于不同细胞系中microRNA-21检测的拉曼光谱图，其中16a为海拉(HeLa)细胞系中不同个体活体单细胞中microRNA-21检测的拉曼光谱图；图16b为MCF-7细胞系中不同个体活体单细胞中microRNA-21检测的拉曼光谱图。
图17为本发明中采用不同亲和配基功能化萃取材料分析苹果中果糖的分布。其中，图17a为果糖印迹的萃取探针***苹果中的纵剖面示意图；图17b为果糖印迹的萃取探针对苹果中果糖进行萃取后，经过纳米拉曼探针标记之后，将萃取探针置于拉曼光谱仪中，从针尖开始扫描得到的拉曼信号分布图谱。
具体实施方式
下面通过图1以及具体实施例来进一步阐明本发明基于表面等离激元光学的高专一性、高灵敏度快速亲和夹心法，应该说明的是，下面的实施例不以任何形式限定本发明，凡是用等同替换或等效方式所获得的技术方案，均在本发明的保护范围之内。
如图1所示，该方法的工作原理为：利用不同亲和配基(不同亲和配基包括MIP、抗体、核酸、硼酸等)功能化的金基萃取材料直接从复杂待测样品中萃取特定的痕量目标分析物，专一性萃取至微萃取材料表面，清洗除去非特异吸附的干扰物后，将修饰了能识别该目标分析物的亲和配基(能识别该目标分析物的亲和配基包括二抗、核酸、硼酸等)的银基纳米拉曼探针温育，即银基纳米拉曼探针对目标分析物进行标记；清洗除去过量的纳米拉曼探针后，从而形成萃取材料-特定目标分析物-拉曼探针三明治型复合物结构，当激光光束照射在三明治结构表面时会发生表面等离激元光学效应，极大地增强拉曼探针的拉曼光谱信号，通过检测放大后的拉曼信号即可检测待测复杂样品中目标分析物的浓度。
为了适用于活体单细胞、活体动物及血清、尿液等复杂待测样品，萃取材料的形式分为萃取阵列和萃取微探针两种形式。微探针的尖端直径一般为0.5-3微米，由玻璃棒、玻璃管或金属丝拉制后经后续化学处理而成，主要用于活体单细胞的萃取。一般探针的尖端直径一般为100-400微米，可直接用中医针灸针或 由金属丝拉制后经后续化学处理而成，主要用于活体动物萃取，也可用于植物果实、根茎、叶片等的萃取。萃取阵列由尺寸合适的玻璃片、塑料片或金属片等二维基片经后续化学处理而成，也可设计为与酶标仪等高通量读取仪联用的高通量阵列或孔板形状，主要用于血液、尿液等样品的萃取和富集。
实施例1：萃取材料与纳米拉曼探针材质的考察
萃取材料的材质和纳米拉曼探针的材质对拉曼信号有很大的影响，金、银是常用的两种贵金属，因此用这两种金属分别作为萃取材料和拉曼探针，选择拉曼信号最强的一种金属组合。
不同材质萃取材料的制备：将直径为0.2mm的金丝、银丝剪切成长度约为0.5cm的小段分别作为两种材质的抓取基底，将小段的金丝、银丝分别浸入150μL3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，150uL二次纯水和3.7mL无水乙醇的混合溶液中，室温反应12小时，使得金丝、银丝的表面修饰上氨基，然后用乙醇清洗两次，再将表面已经修饰上氨基的金丝、银丝分别浸入10mg/mL醛基苯硼酸甲醇溶液中，室温反应24小时，最后分别用纯水、无水乙醇清洗两次，40℃真空干燥。
不同材质纳米拉曼探针的制备[制备方法参见但不限于以下文献Yu-Ju Liao，Yen-Chun Shiang，Chih-Ching Huang and Huan-Tsung Chang，Langmuir，《兰格缪尔》2012，28，8944-8951；p.c.1ee，d.mesel，J.Phys.Chem.《物理化学杂志》1982，86，3391-3395]：合成粒径约为60nm的金、银纳米粒子，取金、银纳米粒子溶液各1mL，分别往金、银纳米粒子溶液中加入1mM巯基苯硼酸溶液8μL，室温下反应1小时。
以1mg/mL葡萄糖标准溶液为样品，将两种材质的硼酸功能化的萃取材料分别浸入其中，萃取30分钟，取出萃取探针后用pH 8.5的磷酸盐缓冲溶液清洗两次，然后浸入纳米拉曼探针溶液中标记2分钟，标记后再用pH 8.5的磷酸盐缓冲溶清洗两次，将萃取材料置于拉曼显微镜下进行检测。结果如图4示，当以金为萃取材料，银纳米粒子为纳米拉曼探针，检测葡萄糖时的拉曼信号明显强于其它组合，和常规的SERS检测比较(金、银基的纳米拉曼探针在玻璃表面检测)，信号强度增强20-40倍。
实施例2：基础萃取材料的制备
基础萃取材料采用酸还原反应制备。将不同形式的萃取材料(萃取材料包括玻璃棒、玻璃毛细管、针灸针、金属针、金属丝、玻璃片等)浸入含氯金酸12mM，碳酸氢钾0.5M和葡萄糖25mM的混合溶液中，35-55℃还原4-5小时，萃取材料的表面修饰上一层金薄层，即得到所述基础萃取材料。将得到的基础萃取材料在100℃的真空条件下干燥12小时，最后放在室温下储存备用。基础萃取材料的整体外观形貌如图2a，2c和2e左图所示。
实施例3：硼酸功能化萃取材料的制备
将实施例2中制备的基础萃取材料浸入3mL由3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、二次纯水和无水乙醇按照体积比5∶5∶9组成的混合溶液中，室温下反应12小时，反应完毕后用无水乙醇洗涤3-5次除去未反应的试剂。由此得到氨基功能化的萃取材料。
将上述制备的氨基功能化萃取材料浸入40mL含10mg/mL 4-甲酰基苯硼酸和1％(w/w)氰基硼氢化钠的甲醇混合溶液中，室温下反应24小时，反应完毕后分别用二次纯水、无水乙醇洗涤3-5次除去未反应的试剂，随后在40℃真空干燥12小时，由此得到硼酸功能化的萃取材料。
实施例4：人工抗体功能化萃取材料的制备
人工抗体功能化的萃取材料采用硼亲和可控定向表面印迹法[S.S.Wang，J.Ye，Z.J.Bie，Z.Liu，Chem.Sci.《化学科学》2014，5，1135-1140；X.D.Bi，Z.Liu，Anal.Chem.《分析化学》2014，86，959-966]制备而成。
以ALP作为模板分子为例，制备步骤如下：
将实施例3中制备得到的硼酸功能化的萃取材料浸入1mL ALP样品溶液(该样品溶液是由ALP溶于50mM，pH 9.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中制得，其中ALP浓度为150000U/L)，室温反应20分钟后，用不含ALP的50mM，pH 9.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液清洗3-5次，这样就制得了结合了ALP的萃取材料。然后将固定有ALP模板的萃取材料浸入1mL预聚液中，室温反应1小时，反应结 束后将萃取材料从预聚液中取出，依次用去离子水、体积浓度为1％的醋酸溶液、去离子水清洗，制备好的印迹涂层4℃下保存备用。其中预聚液由多巴胺、3-氨基苯硼酸(APBA)和过硫酸铵(APS)溶于0.1M，pH 8.5磷酸盐缓冲溶液制得，浓度分别为2.0，1.6和1.2mg/mL。
此外，制备修饰了非印迹涂层的萃取材料作为对照，以说明分子印迹萃取材料的识别性能。非印迹涂层的制备除了没有添加模板以外，其他步骤相同。
实施例5：抗体功能化萃取材料的制备
以anti-survivin抗体为例，制备步骤如下：
将实施例2中制备得到的基础材料浸入1mg/mL 11-巯基十一酸的乙醇溶液中，室温反应12小时，使得基础材料表面修饰上羧基，然后用无水乙醇清洗两次，40℃真空干燥12小时。将表面修饰上羧基的萃取材料浸入1mL体积比为1∶1的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)混合溶液中(分别为100mM和25mM)10分钟，取出萃取材料后用pH 4.5的磷酸盐缓冲液清洗两次。然后将萃取材料置于1mL浓度为23μg/mL的anti-survivin单克隆抗体溶液中，室温反应2小时，取出萃取材料后用pH 7.4的磷酸盐缓冲液清洗两次，然后浸入1mL 2.5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中封闭2小时，以减少表面的非特异性吸附。最后用pH 7.4的磷酸盐缓冲液清洗两次，室温晾干，置于4℃下贮存备用。
实施例6：核酸功能化萃取材料的制备
以microRNA-21为例，制备步骤如下：
将实施例2中制备得到的基础萃取材料浸入30μL，浓度为10μM的3’端修饰氨基的寡核苷酸序列(3’AUCGAAUAGU)溶液中室温下反应1-3小时，取出反应后的萃取材料，用磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)清洗两次，室温晾干，储存在4℃冰箱中备用。
实施例7：硼酸功能化纳米拉曼探针的制备
首先制备银纳米粒子[制备方法参见但不限于以下文献Yu-Ju Liao， Yen-ChunShiang，Chih-Ching Huang and Huan-Tsung Chang，Langmuir，《兰格缪尔》2012，28，8944-8951；P.C.Lee，D.Mesel，J.Phys.Chem.《物理化学杂志》1982，86，3391-3395]，具体制备步骤如下：
利用柠檬酸钠还原硝酸银的方法合成粒径约30-100nm左右的银纳米粒子，具体为，将36mg硝酸银溶解于200mL水中，搅拌加热至沸腾，快速加入新配制的柠檬酸钠溶液(1％，4mL)，继续加热搅拌大约1小时，然后自然冷却到室温，4℃储存备用。
硼酸功能化银纳米粒子的制备：
取8μL 4-巯基苯硼酸(1mM，溶解于0.2M NaOH溶液)分别加入到1mL银纳米粒子溶液中，室温下搅拌反应60分钟，即得到硼酸功能化的银纳米粒子。
实施例8：抗体功能化纳米拉曼探针的制备
以anti-survivin抗体为例，具体步骤如下：
步骤1)，4-巯基苯胺(PATP)功能化银纳米粒子的合成
取合成好的粒径约为60nm的银纳米粒子10mL，往银纳米粒子溶液中加入20uL浓度为1mM的PATP乙醇溶液，室温下磁力搅拌反应1小时，然后加入四乙氧基硅烷溶液(TEOS)(TEOS 4mL，乙醇16mL，氨水280μL)，室温下磁力搅拌反应70分钟。10000rpm离心10分钟。弃上清，将沉淀物分散于50mL乙醇中。加入150μL(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)，室温下磁力搅拌反应1小时，离心，10000rpm，10分钟，弃上清，沉淀物重新分散于10mL戊二醛(0.5％)溶液中，磁力搅拌反应2小时，10000rpm离心10分钟。二次纯水清洗两次，分散于10mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液中备用。
步骤2)，anti-survivin抗体功能化银纳米粒子的合成
如步骤1)中所述，取PATP功能化的银纳米粒子10mL，加入10μg/mL的anti-survivin多克隆抗体，室温下磁力搅拌反应2小时。10000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀物用pH 7.4的磷酸盐缓冲液清洗5分钟，然后加入1％w/v BSA封闭2小时，以减少表面的非特异性吸附。再用pH 7.4的磷酸盐缓冲液清洗5分钟，将合成好的抗体功能化拉曼标记探针分散于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，4℃下贮存备用。
实施例9：核酸功能化的纳米拉曼探针制备
以识别microRNA-21为例，步骤如下：
将实施例7中第一步制备好的银纳米粒子取出1mL，往其中同时加入浓度均为100μM的5’端修饰巯基的寡核苷酸序列与拉曼报告分子，体积比为1∶2，室温反应1-3小时。10000转离心10分钟，弃上清，将沉淀物溶解于1mL的Tris缓冲溶液(20mM，pH7.6)中，4℃冰箱储存备用。
实施例10：ALP印迹微萃取材料用于活体单细胞中ALP的检测分析
肝癌细胞(HepG-2)，正常肝细胞(L-02)，海拉细胞(HeLa)和乳腺癌细胞(MCF-7)均用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基培养2-3天(37℃，5％C02)。去除培养基将细胞用1×PBS清洗两次，然后使细胞保存于1×PBS中置于细胞显微操作平台的显微镜下，将ALP印迹微探针固定在细胞显微操作平台上，通过显微操作平台使微探针精确地***单个细胞中萃取目标分子3分钟，萃取后取出微探针用50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.5)清洗两次，然后用5μL巯基苯硼酸功能化的纳米拉曼探针标记2分钟，标记后再用50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.5)清洗两次，直接将微探针置于拉曼显微镜下进行拉曼检测，结果如图7c和图7d所示。
实施例11：anti-survivin抗体功能化的微萃取材料用于活体单细胞中survivin蛋白的检测分析
肝癌细胞(HepG-2)，正常肝细胞(L-02)，海拉细胞(HeLa)和乳腺癌细胞(MCF-7)均用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基培养2-3天(37℃，5％CO2)。去除培养基将细胞用1×PBS清洗两次，然后使细胞保存于1×PBS中置于细胞显微操作平台的显微镜下，将anti-survivin抗体功能化的微探针固定在细胞显微操作平台上，通过显微操作平台使微探针精确地***单个细胞中萃取目标分子3分钟，萃取后取出微探针用1×PBS清洗两次，然后用5μL修饰了PATP anti-survivin抗体的纳米拉曼探针标记2分钟，标记后再用1×PBS清洗两次，将微探针置于拉曼显微镜下进行拉曼检测，结果如图7e和图7f所示。
实施例12：ALP印迹微萃取材料用于肿瘤裸鼠模型中ALP的检测分析
分别将正常裸鼠、腋下种植了HepG-2细胞、HeLa细胞、MCF-7细胞和MGC-803细胞的裸鼠分别置于VMR动物麻醉机的鼠仓中，开启麻醉机安全锁阀门至最***醉剂量使小鼠迅速麻醉，然后调小麻醉剂量维持5分钟左右使小鼠处于完全麻醉状态。将麻醉的小鼠从鼠仓中取出，平放在实验台上，用印迹了ALP的或者非印迹的微探针轻轻旋转式***小鼠肿瘤内，让微探针尖端停留在肿瘤内部萃取10min。萃取后取出微探针用50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.5)浸泡15min清洗数次，然后用5μL巯基苯硼酸功能化的纳米拉曼探针标记20分钟，标记后再用50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.5)清洗数次，直接将微探针置于拉曼显微镜下进行SERS检测，结果如图10c和10d所示。
实施例13：抗体功能化的微萃取材料用于小鼠模型中survivin蛋白的检测分析
分别将正常裸鼠、腋下种植了HepG-2细胞、HeLa细胞、MCF-7细胞和MGC-803细胞的裸鼠分别置于VMR动物麻醉机的鼠仓中，开启麻醉机安全锁阀门至最***醉剂量使小鼠迅速麻醉，然后调小麻醉剂量维持5分钟左右使小鼠处于完全麻醉状态。将麻醉的小鼠从鼠仓中取出，平放在实验台上，将anti-survivin抗体或者非抗体功能化的微探针扎入小鼠肿瘤部位，萃取10分钟，拔出微萃取探针针浸泡15min清洗数次，然后用5μL PATP和anti-survivin抗体功能化的纳米拉曼探针标记20分钟，标记后再用1×PBS清洗数次，将针灸针的尖端置于拉曼显微镜下进行拉曼检测，结果如图10a和10b所示。
实施例14：ALP印迹微萃取材料在血清样本中的应用
往血清样品中加入不同浓度的ALP标准溶液，混合均匀。每个阵列点上加入5μL含ALP标准溶液的血清湿盒孵育20min。用1×PBS清洗两次，再用5μL硼亲和拉曼探针标记5min。每个点用磷酸盐溶液(10mM，pH＝8.5)清洗两次，干燥后直接将阵列置于拉曼显微镜下进行拉曼检测，结果如图13所示。
实施例15：EPO印迹萃取材料在尿液样本中的应用
每个阵列点上加入5μ L尿液(PBS，pH＝7.4)湿盒孵育20min。用PBS清洗2次，再用5μL硼亲和SERS探针标记5min。每个点用磷酸盐溶液(10mM，pH＝8.5)清洗2次，干燥后直接将阵列置于拉曼显微镜下进行拉曼检测，结果如图14所示。
实施例16：果糖印迹萃取探针探测苹果中果糖的含量分布
将果糖印迹的萃取探针轻轻***苹果中，直至针尖靠近果核部位(如图17a所示)，萃取10分钟后，轻轻拔出萃取探针，用pH 7.4的磷酸缓冲盐清洗萃取探针两次，然后用纳米拉曼探针(MPBA功能化的银纳米粒子)标记3分钟。标记之后的萃取探针再次用pH 7.4的磷酸缓冲盐清洗两次，室温晾干，然后将萃取探针置于拉曼光谱仪中，从针尖开始扫描得到拉曼信号分布图谱，结果如图17所示。

Claims (10)

1.一种不同亲和配基功能化的金基萃取材料，其特征在于，包括萃取材料，在萃取材料的表面修饰有金薄层形成基础萃取材料，在基础萃取材料的表面修饰有抗体、分子印迹聚合物或核酸等亲和识别配基或材料。
2.根据权利要求1所述不同亲和配基功能化的金基萃取材料，其特征在于，萃取材料形式主要有萃取探针和萃取阵列两种形式。
3.根据权利要求1所述不同亲和配基功能化的萃取材料的制备方法，其特征在于，在萃取材料的表面通过化学还原的方法修饰有金薄层，还原温度为35-55℃，还原时间为4-5小时，得到修饰有金薄层的萃取材料为基础萃取材料，然后在基础萃取材料的表面修饰分子印迹聚合物、抗体或核酸等具有专一识别作用的亲和配基或材料。
4.根据权利要求1所述的不同亲和配基功能化的金基萃取材料在表面等离激元光学和亲和夹心分析中的应用。
5.根据权利要求4所述的不同亲和配基功能化的金基萃取材料在表面等离激元光学和亲和夹心分析中的应用，其特征在于，所述的不同亲和配基功能化的金基萃取材料直接将待测样品中目标分析物专一性萃取至金基萃取材料表面，随后与修饰了能识别所述目标分析物的亲和配基的银基纳米拉曼探针温育，从而形成萃取材料-目标分析物-拉曼探针三明治型复合物结构，再当激光光束照射在所述三明治型复合物结构表面时会发生表面等离激元光学效应：银基纳米拉曼探针产生表面增强拉曼散射；同时，金基萃取材料表面产生等离子波，等离子波进一步增强银基纳米拉曼探针的表面增强拉曼散射信号，通过检测拉曼信号即可测定待测样品中目标分析物的含量。
6.根据权利要求5所述的不同亲和配基功能化的金基萃取材料在表面等离激元光学和亲和夹心分析中的应用，其特征在于，所述的目标分析物包括蛋白质、核酸和糖类等生物分子，以及其它具有重要检测意义的可通过亲和夹心法识别的化合物。
7.根据权利要求5所述的不同亲和配基功能化的金基萃取材料在表面等离激元光学和亲和夹心分析中的应用，其特征在于，所述待测样品包括活体单细胞、活体动物、血清、尿液，以及其它具有重要检测意义的可通过亲和夹心法识别的化合物。
8.根据权利要求5所述的不同亲和配基功能化的金基萃取材料在表面等离激元光学和亲和夹心分析中的应用，其特征在于，所述金基萃取材料萃取时间为2-30分钟，银基纳米拉曼探针的温育时间为2-30分钟。
9.根据权利要求5所述的不同亲和配基功能化的金基萃取材料在表面等离激元光学和亲和夹心分析中的应用，其特征在于，所述不同亲和配基功能化的银基纳米拉曼探针的内核为银纳米颗粒，所述探针的表面修饰了具有拉曼活性分子并用不同的亲和配基进一步修饰。
10.根据权利要求5或9所述的不同亲和配基功能化的金基萃取材料在表面等离激元光学和亲和夹心分析中的应用，其特征在于，所述不同亲和配基功能化的银基纳米拉曼探针的制备方法为：以柠檬酸钠还原AgNO3形成的粒径一般为30-100nm的银纳米粒子为纳米拉曼探针的核，在银核的表面修饰一层具有拉曼增强作用的报告分子与能对萃取出的目标分析物具有识别作用的亲和配基。
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