CN105385623A - 防治大豆疫霉病的放线菌菌株jsx-1及其菌剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防治大豆疫霉病的放线菌菌株,属于植物保护技术领域。该菌株为链霉菌属(Streptomyces?sp.),名称为放线菌JSX-1。所述放线菌菌株的单菌落为圆形,白色,表面干而不透明;菌丝较细,生长缓慢,菌落质地致密,且带有泥腥味。所述放线菌菌株革兰氏染色呈紫色,为阳性。JSX-1菌剂对大豆疫霉病的防效为55-60%。本发明为不易使大豆疫霉菌产生抗性、不污染环境的防治大豆疫霉病的放线菌菌株及其菌剂,该菌剂可以在大豆出苗后通过灌根使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物领域,具体涉及一种防治大豆疫霉病的放线菌菌株JSX-1及其菌剂。
背景技术
大豆是农业生产上最重要的作物之一,由大豆疫霉菌(Phytophthorasojae)引起的大豆疫霉病是危害大豆生产的世界性病害。该病害是一种危害极其严重的土传病害,也是我国一种重要的对外检疫对象。大豆疫霉病最早于1948年在美国印第安纳州发现,以后逐渐在美国和世界许多国家发生,我国直到1989年由沈崇尧首次在东北大豆产区分离到大豆疫霉,目前该病害在我国的部分大豆产区也已经发生并造成严重危害。
大豆疫霉菌可以在土壤中长期存活,引起大豆种子、根和茎腐烂,在大豆整个生育期均可感染,一般减产10-30%,严重发生减产50-70%,有的甚至绝收。如果大豆在出芽前受到侵染,可以引起种子腐烂,出苗后子叶不张开最后枯死;若大豆在成株期受到侵染,最初在茎节处出现水渍状褐斑,病斑向上向下扩展,植株上下部叶片逐渐变黄萎蔫,病部缢缩,病斑逐渐变为黑褐色,根部出现水渍状,根系发育不良,导致植株枯萎死亡;大豆在生长后期受到侵染,其症状主要表现在下部叶片变黄干枯,但不易脱落,近地面茎基部及茎部病斑深褐色,茎部干枯易折断,易形成瘪荚、瘪粒。大豆疫霉菌具有复杂、多重循环的生活史,大豆疫霉一旦传入,可在病区长期存活,难以根治。
大豆疫霉菌隶属于卵菌,卵菌虽然在生长习性及营养方式与真菌相似,但实际上卵菌在进化上远不同于真正意义上的真菌,而是与原生藻类更为相似,卵菌的致病机理也与真菌差异显著,因此,针对真菌的普通杀菌剂对疫霉菌无效。目前,大豆疫病的主要防治方法是化学防治,但是由于大豆疫霉菌具有变异复杂、繁殖速度快、传播迅速、生存能力强等特点,且一般的化学防治药剂作用位点单一,容易是该病产生抗药性;而且化学药剂具有对生态环境破坏大,以及对人畜高毒性的缺陷,因此急需寻求新的防治措施。开发一种对环境、人畜安全的非化学防治方法已经成为防治大豆疫霉病的重点,而利用土壤中的放线菌以及菌剂来进行生物防治是最有效的途径之一。
目前,缺乏一种不易使大豆疫霉产生抗性、不污染环境的防治大豆疫霉病的放线菌菌株及其菌剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供了一种不易使大豆疫霉菌产生抗性、不污染环境的防治大豆疫霉病的放线菌菌株JSX-1及其菌剂。
为了实现上述目的,本发明通过如下技术方案实现:一种防治大豆疫霉病的放线菌菌株,该菌株为链霉菌(Streptomycessp.);保藏名称为放线菌JSX-1。
进一步地,所述放线菌菌株的单菌落为圆形,白色,表面干而不透明;菌丝较细,生长缓慢,菌落质地致密,且带有泥腥味。
进一步地,所述放线菌菌株革兰氏染色呈紫色,为阳性。
本发明所述的放线菌制备的防治大豆疫霉病的放线菌菌剂。
进一步地,所述的防治大豆疫霉病的放线菌菌剂,其活性成分为如下(a)、(b)和(c)中的至少一种:
(a)权利要求1所述放线菌;
(b)权利要求1所述放线菌的发酵上清液;
(c)权利要求1所述放线菌的发酵培养物。
本发明所述的防治大豆疫霉病的放线菌菌剂的制备方法,包括如下步骤:
(1)所述放线菌菌株JSX-1为链霉菌,放线菌菌种在高氏一号培养基中上生长,温度为28-30℃,在恒温培养箱中黑暗放置进行培养,培养时间为2-4d,获得放线菌菌株;
(2)按照上述步骤(1)中所述的,当放线菌菌种培养2-4d时,将放线菌菌种接种于49-51ml发酵培养基中,温度为28-30℃、转速为160-180r/min下振荡培养70-72h,然后在转速为6000-8000r/min下进行离心分离15-20min,丢弃底部沉淀,取发酵上清经过0.2μm的细菌过滤器过滤,制得放线菌菌剂。
进一步地,在步骤(1)中,所述高氏一号培养基由可溶性淀粉19.9-20.1g,氯化钠0.4-0.6g,硝酸钾0.9-1.1g,磷酸氢二钾0.4-0.6g,硫酸镁0.4-0.6g,硫酸亚铁0.009-0.011g,琼脂15-20g组成,pH为7.1-7.3,用蒸馏水将上述组分定容至1000ml,在温度为120-121℃下灭菌19-21min;在步骤(2)中,所述放线菌发酵培养基由玉米粉9.9-10.1g,蔗糖9.9-10.1g,氯化钠1.9-2.1g,硫酸铵2.9-3.1g,碳酸钙1.9-2.1g组成,pH为7.2-7.4,用蒸馏水将上述组分定容至1000ml,在温度为120-121℃下灭菌19-21min。
本发明所述放线菌菌剂在防治大豆疫霉病的应用。
有益效果:本发明提供了一种不易使大豆疫霉菌产生抗性、不污染环境的防治大豆疫霉病的放线菌菌株JSX-1及其菌剂。放线菌菌剂属于生物制剂,与化学药剂引起的化学抗药性等问题不同,是一种安全无污染的防治大豆病的生物途径,因而有利于大豆的无公害生产,符合农业可持续发展的要求。农民可以在大豆生产过程中不用或减少其他防治大豆疫霉的农药的用量,进而减少农民节省开支。同时,该放线菌菌剂对大豆疫霉病的防治效果可达50-60%。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明做进一步的具体描述,但不能理解为是对本发明保护范围的限定。
实施例1
菌株的16SrRNA分子的鉴定
放线菌菌株JSX-1在高氏一号平板上在温度为28℃下进行活化培养,高氏一号培养基:可溶性淀粉19.9-20.1g,氯化钠0.4-0.6g,硝酸钾0.9-1.1g,磷酸氢二钾0.4-0.6g,硫酸镁0.4-0.6g,硫酸亚铁0.009-0.011g,琼脂15-20g组成,pH为7.1-7.3,用蒸馏水将上述组分定容至1000ml,在温度为120-121℃下灭菌19-21min。
培养时间为2-4d后观察发现,JSX-1的单菌落为圆形,白色,表面干而不透明;菌丝较细,生长缓慢,菌落质地致密,且带有泥腥味。菌株JSX-1革兰氏染色呈紫色,为阳性。
菌株JSX-1的形态特征与常见细菌***鉴定手册中链霉菌属放线菌(Streptomycessp.)最为相似。
以JSX-1基因组总DNA为模板,PCR扩增16SrRNA得到长度约1.5Kb的扩增产物,这与16SrRNA在所有细菌中大多高度保守并且长度恒定为1.5Kb左右的报道吻合。整理测序结果可得到进行***发育分析的16SrRNA序列的总长度为1485bp,将测序结果在NCBI网站GenBank数据库中Blast搜索,与已登录的16SrRNA序列进行核苷酸同源性比较,发现菌株JSX-1的16SrRNA序列与链霉菌属(Streptomycessp.)相似度较高,大于99%,结合该菌株的培养特性结果,将放线菌菌株JSX-1初步鉴定为链霉菌属放线菌(Streptomycessp.)。
本发明提供了一种不易使大豆疫霉菌产生抗性、不污染环境的防治大豆疫霉病的放线菌菌株JSX-1及其菌剂。放线菌菌剂属于生物制剂,与化学药剂引起的化学抗药性等问题不同,是一种安全无污染的防治大豆疫霉病的生物途径,因而有利于大豆的无公害生产,符合农业可持续发展的要求。农民可以在大豆生产过程中不用或减少其他防治大豆疫霉的农药的用量,进而减少农民节省开支。同时,该放线菌菌剂对大豆疫霉病的防治效果可达60%以上。
实施例2
大豆疫霉游动孢子悬浮液制备方法步骤如下:
(1)按照1∶100(w/v)的比例在V8蔬菜汁中加入CaCO3,然后在转速为6000-8000r/min下进行离心分离8-10min,丢弃底部沉淀,向离心上清液中加入9倍体积的蒸馏水,配制成10%的V8蔬菜汁培养基,固体培养基按照1.5-1.8%的比例加入琼脂。温度为120-121℃,灭菌时间为15-20min。
(2)将保存的大豆疫霉菌株在V8培养基上活化生长,温度为24-26℃,在恒温培养箱中黑暗放置进行培养,活化生长时间为5-6d。
(3)将上述培养5-6d的大豆疫霉菌株,用手术刀切取2-3mm×2-3mm大小的菌丝块。
(4)将10-20块上述菌丝块置于14-16ml的10%液体V8蔬菜汁中,24-26℃,黑暗条件进行培养,培养时间为2-3d。
(5)培养2-3d后,用无菌枪头小心挑动大豆疫霉菌丝,去除菌丝上的培养基,将菌丝挑入无菌自来水中缓慢冲洗,重复3-4次,至菌丝基本为白色即可。
(6)将上述菌丝置于无菌培养皿中,加入10-15ml无菌自来水,均匀覆盖菌丝。
(7)在温度为24-26℃下,恒温培养箱中黑暗放置进行培养,培养时间为20-24h,诱导产生游动孢子。
(8)将游动孢子悬浮液用无菌水调节至浓度约为1×104个/ml。
本发明的一种防治大豆疫霉病的放线菌菌株JSX-1,该菌株为链霉菌(Streptomycessp.)。
所述放线菌菌株的单菌落为圆形,白色,表面干而不透明;菌丝较细,生长缓慢,菌落质地致密,且带有泥腥味。所述放线菌菌株革兰氏染色呈紫色,为阳性。
本发明所述的放线菌制备的防治大豆疫霉病的放线菌菌剂。其活性成分为如下(a)、(b)和(c)中的至少一种:
(a)权利要求1所述放线菌;
(b)权利要求1所述放线菌的发酵上清液;
(c)权利要求1所述放线菌的发酵培养物。
本发明所述的防治大豆疫霉病的放线菌菌剂的制备方法,包括如下步骤:
(1)将所述放线菌菌株JSX-1为链霉菌,放线菌菌种在高氏一号培养基中上生长,温度为28℃,在恒温培养箱中黑暗放置进行培养,培养时间为2-4d,获得放线菌菌株;所述高氏一号培养基由可溶性淀粉19.9-20.1g,氯化钠0.4-0.6g,硝酸钾0.9-1.1g,磷酸氢二钾0.4-0.6g,硫酸镁0.4-0.6g,硫酸亚铁0.009-0.011g,琼脂15-20g组成,pH为7.1-7.3,用蒸馏水将上述组分定容至1000ml,在温度为120-121℃下灭菌19-21min;
(2)按照上述步骤(1)中所述的,当放线菌菌种培养2-4d时,将放线菌菌种接种于49-51ml发酵培养基中,温度为28-30℃、转速为160-180r/min下振荡培养70-72h,然后在转速为6000-8000r/min下进行离心分离15-20min,丢弃底部沉淀,取发酵上清经过0.2μm的细菌过滤器过滤,制得放线菌菌剂。所述放线菌发酵培养基由玉米粉9.9-10.1g,蔗糖9.9-10.1g,氯化钠1.9-2.1g,硫酸铵2.9-3.1g,碳酸钙1.9-2.1g组成,pH为7.2-7.4,用蒸馏水将上述组分定容至1000ml,在温度为120-121℃下灭菌19-21min。
本发明所述放线菌菌剂在防治大豆疫霉病的应用。
放线菌菌剂平板防治效果测定
大豆疫霉菌株在10%V8培养基中培养4-5d备用;按照1∶10(v/v)的比例将培养至预定时间的放线菌菌剂与V8培养基均匀混合,制备成含放线菌JSX-1的放线菌菌剂的培养基(以加入等比例的发酵培养基上清液的V8培养基作为对照)。用打孔器(d=5mm)取大豆疫霉菌丝外边缘,将大豆疫霉菌菌碟接种于上述培养基中,于接种后的第3-10d每隔24h测量疫霉菌的直径,统计放线菌菌剂对大豆疫霉菌的平板拮抗效果。防治效果效果的计算公式是:防效(%)=(对照组疫霉菌直径-处理组疫霉菌直径)/对照组疫霉菌直径×100%。
表1为放线菌JSX-1的放线菌菌剂对大豆疫霉的平板抑制率随天数的变化情况。
表1
如表1可以得出,平板防治效果测定结果表明培养72h的JSX-1放线菌菌剂对大豆疫霉菌的生长有一定程度的抑制作用。在接种3d时JSX-1放线菌菌剂对大豆疫霉菌丝抑制率最高,随着接种天数的增加,其对大豆疫霉菌丝的抑制率有下降的趋势,但抑制率仍然保持在20%以上。平板拮抗实验表明放线菌JSX-1的菌剂在培养72h时该放线菌产生的活性物质对大豆疫霉菌丝的生长有一定程度的抑制作用。表中数值抑制率的平均值±标准误。
实施例3
离体叶片防治效果测定
将放线菌菌剂培养至预定的时间备用;该菌剂可以在出苗后2-3d灌根使用。从生长整齐的大豆植株上采集大小一致的健康叶片,用浓度为0.5%的吐温20浸泡大豆叶片约9-10s后,用无菌水轻轻漂洗,取出在超净工作台中晾干。叶片吹干后在放线菌菌剂中浸泡1min,取出在超净工作台中晾干(以放线菌发酵培养基上清液浸泡处理叶片作为对照),在叶片上接4-6μl大豆疫霉游动孢子悬浮液,各处理重复6-8次。在24-26℃,相对湿度80-90%,黑暗条件培养48h后测量病斑直径,评估防效。防效的计算公式是:防效(%)=(对照组病斑直径-处理组病斑直径)/对照组病斑直径×100%。
表2为放线菌JSX-1的放线菌菌剂对大豆疫霉的离体叶片防治效果测定。
表2
如表2可以得出,大豆离体叶片实验结果表明培养72h的JSX-1放线菌菌剂对大豆疫霉菌株在离体叶片上有一定程度的防治效果。48h后JSX-1放线菌菌剂对大豆疫霉游动孢子的离体防效为21.21%。离体叶片实验结果表明放线菌JSX-1的菌剂在培养72h时该放线菌产生的活性物质对大豆疫霉有一定程度的抑制作用。表中不同的字母表示在0.05水平上差异显著。
实施例4
盆栽防治效果测定
实施例4与实施例3的区别在于:向长出2片真叶的大豆幼苗根部灌入放线菌菌剂,每株大豆灌2.9-3.1ml(以根部位置灌入等体积的发酵培养基上清液的幼苗为对照)。灌根3d后,采用下胚轴接种的方法在大豆子叶下方0.9-1.1cm处接种大豆疫霉菌丝块,各处理接种20-22株大豆植株。在24-26℃培养,接种4d后计算植株发病率和防治效果。各参数计算公式如下:
发病率(%)=(发病植株数/总植株数)×100%
防治效果(%)=[(对照组发病率-处理组发病率)/对照组发病率]×100%
表3为放线菌JSX-1放线菌菌剂对大豆疫病的盆栽防治效果测定。
表3
如表3可以得出,在接种大豆疫霉菌丝块4d后检测,盆栽实验结果表明经过放线菌JSX-1的菌剂灌根处理,大豆植株能有效抵御大豆疫病的感染,防效达58.70%;表中不同的字母表示在0.05水平上差异显著。
根据以上各实施例可以证明:以本发明所述的放线菌菌剂的有效成分的药剂是一种新型的农业杀菌剂。这种药剂特别是对大豆疫霉病显示出卓越的效果,而且对环境污染小,抗药性低的特点。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
Claims (8)
1.一种防治大豆疫霉病的放线菌菌株,其特征在于:该菌株为链霉菌属(Streptomycessp.),名称为放线菌JSX-1。
2.根据权利要求1所述的防治大豆疫霉病的放线菌菌株,其特征在于:所述放线菌菌株的单菌落为圆形,白色,表面干而不透明;菌丝较细,生长缓慢,菌落质地致密,且带有泥腥味。
3.根据权利要求2所述的防治大豆疫霉病的放线菌菌株,其特征在于:所述放线菌菌株革兰氏染色呈紫色,为阳性。
4.根据权利要求1所述的放线菌制备的防治大豆疫霉病的放线菌菌剂。
5.根据权利要求4所述的防治大豆疫霉病的放线菌菌剂,其活性成分为如下(a)、(b)和(c)中的至少一种:
(a)权利要求1所述放线菌;
(b)权利要求1所述放线菌的发酵上清液;
(c)权利要求1所述放线菌的发酵培养物。
6.制备权利要求1或2所述防治大豆疫霉病的放线菌菌剂的方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)所述放线菌菌株JSX-1为链霉菌属,放线菌菌种在高氏一号培养基中上生长,温度为28-30℃,在恒温培养箱中黑暗放置进行培养,培养时间为2-4d,获得放线菌菌株;
(2)按照上述步骤(1)中所述的,当放线菌菌种培养2-4d时,将放线菌菌种接种于49-51ml发酵培养基中,温度为28-30℃、转速为160-180r/min下振荡培养70-72h,然后在转速为6000-8000r/min下进行离心分离15-20min,丢弃底部沉淀,取发酵上清经过0.2μm的细菌过滤器过滤,制得放线菌菌剂。
7.根据权利要求1所述的放线菌菌剂的制备方法,其特征在于:在步骤(1)中,所述高氏一号培养基由可溶性淀粉19.9-20.1g,氯化钠0.4-0.6g,硝酸钾0.9-1.1g,磷酸氢二钾0.4-0.6g,硫酸镁0.4-0.6g,硫酸亚铁0.009-0.011g,琼脂15-20g组成,pH为7.1-7.3,用蒸馏水将上述组分定容至1000ml,在温度为120-121℃下灭菌19-21min;在步骤(2)中,所述放线菌发酵培养基由玉米粉9.9-10.1g,蔗糖9.9-10.1g,氯化钠1.9-2.1g,硫酸铵2.9-3.1g,碳酸钙1.9-2.1g组成,pH为7.2-7.4,用蒸馏水将上述组分定容至1000ml,在温度为120-121℃下灭菌19-21min。
8.权利要求4~5所述放线菌菌剂在防治大豆疫霉病的应用。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160309 |