CN106414713B - 全细胞催化生产1, 5-戊二胺的大肠杆菌工程菌及应用 - Google Patents

全细胞催化生产1, 5-戊二胺的大肠杆菌工程菌及应用 Download PDF

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Abstract

提供了全细胞催化生产1,5‑戊二胺的大肠杆菌工程菌及应用。所述工程菌，是在大肠杆菌B系列衍生菌株中过量表达赖氨酸脱羧酶基因cadA并同时适量表达赖氨酸‑戊二胺逆向转运蛋白基因cadB构建的1,5‑戊二胺全细胞催化工程菌；还提供了利用该工程菌催化生产1,5‑戊二胺的方法。

Description

全细胞催化生产1，5-戊二胺的大肠杆菌工程菌及应用
技术领域
本发明总地涉及全细胞催化生产1，5-戊二胺的大肠杆菌工程菌及应用，属于生物技术领域。
背景技术
1，5-戊二胺(1，5-Pentanediamine)，又名尸胺(Cadaverine)、1，5-二氨基戊烷(1，5-Diaminopentane)，与二元酸聚合可合成高分子聚酰胺材料(即尼龙)。全球每年生产约700万吨聚酰胺材料，消耗大量石化资源，因此生物法合成聚酰胺的重要组成单体-1，5-戊二胺，具有重要的经济学和生态学意义。
生物法生产1，5-戊二胺主要采用微生物发酵和催化两种方法。其中，发酵法以葡萄糖为碳源，通过菌种的一系列代谢途径合成戊二胺，其最高产量为88g/L，生产强度为2.2g/L/h(Kind et al，Metabolic Engineering，2014，25：113-123)。全细胞催化法以赖氨酸为底物，通过菌体细胞的赖氨酸脱羧酶催化产生戊二胺。目前，赖氨酸作为大宗氨基酸品种之一，其产能严重过剩，利润率极低。因此，开发高效的以赖氨酸为底物的戊二胺生物催化的生产方法，不但可以开发新型生物基材料市场，还可以推进氨基酸发酵产业的转型升级。
在全细胞催化生产1，5-戊二胺的现有技术中，日本味之素公司(专利US7189543、EP1482055)以pUC18为载体过表达赖氨酸脱羧酶基因cadA，并将该重组质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli，简写为E.coli)K12衍生系列菌株JM109中，获得全细胞催化生产1，5-戊二胺的工程菌。应用该工程菌进行全细胞催化，11h后戊二胺产量达到69g/L，生产强度约为6.2g/L/h。为了提升工程菌的催化性能，采用热处理、冷冻熔融以及超声等细胞处理工艺(专利CN 102782146)，但是这些处理工艺增加了实际生产工艺难度和生产成本。
目前戊二胺生物催化的现有技术存在工程菌细胞催化性能低，催化工艺复杂，严重限制了1，5-戊二胺生物催化的实际工业化生产应用。
发明内容
本发明提供了全细胞催化生产1，5-戊二胺的大肠杆菌工程菌及应用。
本发明提供的工程菌，是在大肠杆菌B株或其衍生菌株中过表达赖氨酸脱羧酶基因，同时适量表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB。
上述工程菌中，所述过表达赖氨酸脱羧酶基因的方法是将所述赖氨酸脱羧酶基因的全部或部分核苷酸序列置于外源表达质粒中的启动子之后进行表达；
所述适量表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB是指将包含或不包含RBS序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因的全部或部分核苷酸序列置于外源表达质粒中的赖氨酸脱羧酶基因的核苷酸序列之后进行表达；或，使用适用于大肠杆菌的能解除cadB转录阻遏的启动子替换大肠杆菌B株或其衍生菌株染色体上的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因自身的启动子；
所述适用于大肠杆菌的能解除cadB转录阻遏的启动子具体为L启动子、trc启动子、T5启动子、lac启动子、tac启动子或T7启动子。
上述任一所述的工程菌中，所述赖氨酸脱羧酶基因是改造的赖氨酸脱羧酶基因cadA，所述改造是将所述赖氨酸脱羧酶基因cadA的第二个密码子突变为GCA，再将所述赖氨酸脱羧酶基因cadA的+7～+33位碱基进行同义密码子替换以增加稀有密码子个数并选择转录产生的mRNA二级结构的最小自由能低和翻译起始效率高的序列；
优选地，所述改造的赖氨酸脱羧酶基因cadA的+1～+35位碱基包括：
5’-ATGGCAGTTATAGCAATATTGAATCATATGGGAGT-3’
5’-ATGGCAGTTATAGCAATATTGAATCACATGGGGGT-3’
5’-ATGGCAGTTATAGCAATATTAAATCACATGGGGGT-3’
5’-ATGGCAGTTATTGCAATATTGAATCACATGGGAGT-3’
5’-ATGGCAGTTATTGCAATATTGAATCATATGGGAGT-3’
5’-ATGGCAGTTATTGCAATATTGAATCACATGGGGGT-3’
5’-ATGGCAGTTATTGCAATATTAAATCACATGGGGGT-3’
5’-ATGGCAGTTATTGCAATATTAAATCATATGGGAGT-3’。
上述任一所述的工程菌中，所述大肠杆菌B株为大肠杆菌BL21(DE3)。
上述任一所述的工程菌中，所述在大肠杆菌B株或其衍生菌株中过表达赖氨酸脱羧酶基因，同时适量表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB的方法为如下(1)或(2)所示：
(1)将含有赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因和包含RBSBCD22的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白编码基因的片段导入所述大肠杆菌B株或其衍生菌株中；
所述片段是通过重组表达载体导入的；
所述重组表达载体具体是将所述片段***pET28a(+)的多克隆位点间得到的；
所述重组表达载体具体构建过程如下：将含有赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因的片段***pET28a(+)的Nco I和Sal I酶切位点间，得到重组表达载体1；再将包含RBSBCD22的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白编码基因的片段***重组表达载体1的Not I和Hind III位点间得到；
所述赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因的核苷酸序列具体如SEQ ID No.2所示；
所述RBSBCD22的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
(2)将所述大肠杆菌B株或其衍生菌株的cadBA操纵子的启动子替换为适用于大肠杆菌的能解除cadB转录阻遏的启动子，再将含有赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因的片段导入所述大肠杆菌B株及其衍生菌株中；或将上述一个或多个替换了启动子的cadB基因***染色体其它位点。
所述将大肠杆菌B株或其衍生菌株的cadBA操纵子的启动子替换为T7启动子的过程如下：将带有T7启动子序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因的质粒导入所述大肠杆菌B株或其衍生菌株中进行同源重组得到；
所述带有T7启动子序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因的质粒是将带有T7启动子序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因***pKOV质粒的BamHI和Not I位点间得到；
所述含有赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因的片段是通过重组表达载体导入的；
所述重组表达载体具体是将所述片段***pET28a(+)的多克隆位点间得到的；
所述重组表达载体具体构建过程如下：将含有赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因的片段***pET28a(+)的Nco I和Sal I酶切位点间；
所述赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因的核苷酸序列具体如SEQ ID No.1所示；
所述含有赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因的片段如SEQ ID No.1所示。
一种制备1，5-戊二胺的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：将上述任一所述的工程菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养，得到种子液；将种子液接入丰富培养基中，发酵培养；加入诱导剂诱导表达，再加入底物赖氨酸和维生素B6开始全细胞催化，即得；
所述诱导剂具体为IPTG或乳糖；
所述底物赖氨酸具体为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发酵液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离赖氨酸、赖氨酸盐干粉或其溶液；
所述维生素B6为吡哆醛、磷酸吡哆醛和/或盐酸吡哆醛；
所述丰富培养基中含有10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，0.9g/L K2HPO4·3H2O，1.14g/L KH2PO4，10g/L(NH4)2SO4，0.3g/L MgSO4·7H2O，5mL/L微量元素储液，50mg/L卡那霉素，余量为水；
所述微量元素储液含有6g/L FeSO4·7H2O，1.35g/L CaCl2，0.8g/L ZnSO4·7H2O，1.5g/L MnSO4·4H2O，0.15g/L CuSO4·5H2O，0.2g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.1g/L H3BO3，0.25g/L CoCl2·6H2O和10mL/L浓盐酸，余量为水。
上述方法中，所述LB液体培养基中卡那霉素的浓度为5-200mg/L，具体为50mg/L；
所述种子液的OD600为2-25，优选为3-5；
所述种子液接入丰富培养基的比例为0.5-30％，具体为5％；
所述发酵培养的温度为25℃-45℃，具体为37℃；
所述发酵培养的DO在50％以上；
所述发酵培养的pH为4.0-9.0；
所述IPTG的终浓度为0.01-10mM，优选为0.05-0.4mM；
所述IPTG加入的时间为发酵培养后2-10h，优选为2-6h；
所述IPTG诱导时还包括0.5-10g/L的速率补加葡萄糖的步骤，所述速率具体为3g/L；
所述赖氨酸盐包括L-赖氨酸盐酸盐或赖氨酸硫酸盐；
所述加入底物赖氨酸和维生素B6开始全细胞催化的时间为诱导开始后的0.5-10h，优选为1-5h；
所述催化过程中pH维持在4.0-10.0之间；
调节pH所用的酸可以是无机酸或有机酸，无机酸可以是盐酸、硫酸、磷酸、硝酸；有机酸可以是己二酸、丁二酸、癸二酸、乙酸、乳酸等。
所述催化还包括如下步骤：按照0-5g/L的速率补加葡萄糖，通气量为0-10vvm，温度控制在25-60℃，搅拌转速为0-1200rpm；
所述催化过程中，所述补加葡萄糖的速率具体为0-2g/L；
所述催化过程中，所述通气量具体为0.5-5vvm；
所述催化过程中，所述温度具体为30-50℃；
所述催化过程中，所述搅拌转速具体为200-1000rpm。
一种制备1，5-戊二胺的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：将权利要求1-4任一所述的工程菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养，得到种子液；将种子液接入无机盐培养基，发酵培养；加入诱导剂诱导表达，再加入底物赖氨酸和维生素B6开始全细胞催化，即得；
所述诱导剂为IPTG或乳糖；
所述底物赖氨酸为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发酵液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离赖氨酸以及赖氨酸盐干粉或其溶液；
所述维生素B6为吡哆醛、磷酸吡哆醛和盐酸吡哆醛；
所述无机盐培养基含有2g/L(NH4)2HPO4，4g/L KH2PO4，0.85g/L柠檬酸，0.7g/LMgSO4·7H2O，10mg/L FeSO4·7H2O，2.25mg/L ZnSO4·7H2O，0.2mg/L CuSO4·5H2O，0.5mg/LMnSO4·5H2O，0.23mg/L NaB4O7·10H2O，2.0mg/L CaCl2·2H2O，0.1mg/L NH4Mo7O24，0.15mg/LCoCl2·6H2O，余量为水。
上述方法中，所述LB液体培养基中卡那霉素的浓度为5-200mg/L，具体为50mg/L；
所述种子液的OD600为2-25，优选为3-5；
所述种子液接入无机盐培养基的比例为0.5-30％，具体为2％；
所述发酵培养的温度为25℃-45℃，具体为37℃；
所述发酵培养的DO在50％以上；
所述发酵培养时葡萄糖的浓度维持在5g/L以下，具体是通过流加补料液实现的，所述补料液含有700g/L葡萄糖和20g/L MgSO4·7H2O，余量为水；
所述IPTG的终浓度为0.01-10mM，优选为0.05-0.4mM；
所述IPTG加入的时间为发酵培养后3-20h，具体为4-12h；
所述赖氨酸盐包括L-赖氨酸盐酸盐或赖氨酸硫酸盐；
所述加入底物赖氨酸和维生素B6开始全细胞催化的时间为诱导开始后的0.5-24h，具体为1-5h；
所述催化过程中pH维持在4.0-10.0之间，具体为6.5；
调节pH所用的酸可以是无机酸或有机酸，无机酸可以是盐酸、硫酸、磷酸、硝酸；有机酸可以是己二酸、丁二酸、癸二酸、乙酸、乳酸等。
所述催化还包括如下步骤：按照0-5g/L的速率补加葡萄糖，通气量为0-10vvm，温度控制在25-60℃，搅拌转速为0-1200rpm；
所述催化过程中，所述补加葡萄糖的速率具体为0-2g/L；
所述催化过程中，所述通气量具体为0.5-5vvm；
所述催化过程中，所述温度具体为30-50℃；
所述搅拌转速具体为200-1000rpm。
上述任一所述的工程菌在制备1，5-戊二胺中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述的工程菌在催化底物赖氨酸和维生素B6生成1，5-戊二胺中的应用也属于本发明的保护范围；
所述底物赖氨酸具体为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发酵液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离赖氨酸以及赖氨酸盐干粉或其溶液，再具体为L-赖氨酸盐酸盐；
所述维生素B6具体为吡哆醛、磷酸吡哆醛和/或盐酸吡哆醛。
大肠杆菌中的1，5-戊二胺操纵子依次包括诱导型启动子PcadB、赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB和赖氨酸脱羧酶基因cadA。在低pH值、高赖氨酸浓度条件下，1，5-戊二胺操纵子上游调节基因cadC被激活，其产物作用于PcadB启动子，激活赖氨酸脱羧酶CadA和赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白CadB的表达。CadA催化细胞内的赖氨酸合成1，5-戊二胺，CadB将合成的1，5-戊二胺转运至细胞外(J Bacteriol，1992，174(8)：2659-2669.)；
与以大肠杆菌K12衍生株出发构建戊二胺全细胞催化工程菌的现有技术不同，本发明从适用于蛋白高效表达的大肠杆菌B系列衍生菌株出发构建戊二胺全细胞催化工程菌。本发明通过在大肠杆菌B系列衍生菌株中过量表达赖氨酸脱羧酶基因cadA并同时适量表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB，解决了菌体生长抑制的问题并显著提高了工程菌的1，5-戊二胺催化性能。本发明进一步提供了利用该工程菌全细胞催化生产1，5-戊二胺的方法，1，5-戊二胺产量达到100-300g/L，1，5-戊二胺生产强度达到50-300g/L/h，实现了高生产强度和高产量地催化生产1，5-戊二胺。与现有技术相比，本发明技术的戊二胺产量和生产速率成倍提高，降低了1，5-戊二胺的生产成本，从而在实践上可用于1，5-戊二胺大规模生产，便于推广应用。
附图说明
图1为pET28a-cadA质粒图谱。
图2为cad操纵子基因的不同过表达组合工程菌的生长曲线。
图3为cadB基因的反转录PCR核酸电泳图。
图4为IPTG和乳糖诱导cadA基因表达的蛋白质电泳图。
图5为底物赖氨酸盐酸盐浓度为300g/L时的1，5-戊二胺全细胞催化过程产量图。
图6为底物赖氨酸盐酸盐浓度为400g/L时的1，5-戊二胺全细胞催化过程产量图。
图7为底物赖氨酸盐酸盐浓度为450g/L时的1，5-戊二胺全细胞催化过程产量图。
图8为底物赖氨酸盐酸盐浓度为500g/L时的1，5-戊二胺全细胞催化过程产量图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
高保真聚合酶KAPA HiFiTMHotStar购自北京阅微基因技术有限公司。
野生型大肠杆菌K12 W3110菌株购自日本技术评价研究所生物资源中心(NITEBiological Resource Center，NBRC)。
pKOV质粒购自Addgene，产品目录号为25769。
实施例1 1，5-戊二胺检测方法
取10μL样品加入含有100μL 4.2g/100mL的碳酸氢钠水溶液的2mL离心管，混匀后加入200μL含有体积百分含量为1％的2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液，混匀；60℃衍生反应60分钟(严格计时，30分钟取出轻微震荡混匀继续衍生反应)。取出避光降温至室温，加入1600μL乙腈，漩涡震荡混匀30秒，有机系滤膜过滤后取15μL进样。
流动相A为pH7.2的5.4g/L磷酸二氢钾水溶液，流动相B为体积百分含量80％的乙腈水溶液，将A和B按照体积比5∶95的比例，1mL/min的流速泵入流动相，所用色谱柱为C18柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6*150mm，Agilent，USA)；柱温：35℃；检测波长：360nm。
以1，5-戊二胺盐酸盐(购自sigma公司)为标准品，1，5-戊二胺盐酸盐的浓度在1-5g/L之间线性关系良好。以标准品的浓度为横坐标，标准品积分峰面积为纵坐标，制作标准曲线，得到标准曲线公式(X＝0.000649*Y+0.0176(R2＝0.9999))。
以下实施例中的1，5-戊二胺浓度均由标准曲线公式计算得到的1，5-戊二胺盐酸盐的测定值换算成1，5-戊二胺浓度值。
实施例2 赖氨酸脱羧酶基因cadA序列的优化及表达载体和工程菌的构建
(一)在pET28a(+)表达载体的T7启动子和RBS之后***优化的赖氨酸脱羧酶基因cadA的ORF。首先，根据pET28a(+)表达载体RBS之后的限制性内切酶Nco I识别碱基序列特征，将赖氨酸脱羧酶基因cadA的第二个密码子突变为高丰度蛋白使用频率较高的第二位密码子GCA。其次，使用稀有密码子对后续的+33位碱基之前的序列进行同义密码子替换，通过增加该区序列的稀有密码子个数以提高基因表达水平；进一步使用RNAfold软件(http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)预测赖氨酸脱羧酶基因cadA的-4～+37位碱基稀有密码子替换后的RNA二级结构的最小自由能，优选自由能低于-6.00kcal/mol的突变序列；进一步应用软件(Salis et al，Nature biotechnology，2009，27(10)：946-950)计算上述突变序列的翻译起始效率(以-33～+33位碱基计算)，在自由能较小的突变序列中再优选翻译起始效率大于7000的突变序列。通过上述设计，获得+4～+33碱基序列优化的cadA基因。
根据上述优化设计的序列设计引物，以野生型大肠杆菌K12 W3110菌株的基因组DNA为模板，使用高保真聚合酶KAPA HiFiTMHotStar，以P1和P2为引物，PCR扩增cadA基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。PCR程序为：98℃变性30秒，65℃退火15秒，72℃延伸150秒，26个循环，通过引物P1引入突变位点N，从而获得改造的赖氨酸脱羧酶基因cadA*的片段。
P1：5’-CATGCCATGGCAGTNATNGCAATATTNAATCANATGGGNGT-3’(SEQ ID No.6)
(下划线所示序列为Nco I酶切识别位点)
P2：5’-ACGCGTCGACCTCCTTATGAGCAAAAAAGGGAAGTG-3’(SEQ ID No.7)
(下划线所示序列为Sal I酶切识别位点)
(二)切胶回收上述PCR电泳条带，使用限制性内切酶Nco I和Sal I双酶切赖氨酸脱羧酶基因cadA*的DNA片段和pET28a(+)质粒，得到酶切后的赖氨酸脱羧酶基因cadA*基因片段和载体大片段；将酶切后的赖氨酸脱羧酶基因cadA*基因片段与载体大片段连接，转化至大肠杆菌EC135(Zhang et al，Plos Genetics，2012，8(9)：e1002987)感受态，在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选，获得含有重组质粒的转化子，提取质粒并将其送测序，将结果正确的质粒命名为pET28a-cadA*质粒示意图见图1。
(三)对照菌1的构建：如图1所示，将携带自身RBS的赖氨酸脱羧酶基因cadA***pET28a(+)载体中T7启动子之后构建对照工程菌，以P3和P2为引物，以野生型大肠杆菌K12W3110菌株的基因组DNA为模板，使用高保真聚合酶KAPA HiFiTMHotStar，进行PCR扩增，条件同上。
P3：5’-TGCTCTAGAACCTGGAGATATGACTATGAACGT-3’(SEQ ID No.8)
(下划线所示序列为Xba I酶切识别位点)
切胶回收上述PCR电泳条带，使用限制性内切酶Xba I和Sal I双酶切该回收的DNA片段和pET28a(+)质粒，得到载体大片段；将回收的基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pET28a-cadA1，将其送测序，结果正确。
对照菌2的构建：如图1所示，将cadA基因第二个密码子缺失，使第四位碱基位为G，作为Nco I内切酶识别位点，构建过表达cadA的载体。以P4和P2为引物进行PCR扩增，条件同上。切胶回收上述PCR电泳条带，使用限制性内切酶Nco I和Sal I双酶切该回收的DNA片段和pET28a(+)质粒，得到载体大片段；将回收的基因片段与载体大片段连接，转化至EC135感受态，在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选，获得含有重组质粒的转化子，提取质粒并将其送测序，将结果正确的质粒命名为pET28a-cadA2。
P4：5’-CATGCCATGGTTATTGCAATATTGAATCACATGGGGGT-3’(SEQ ID No.9)
将上述质粒pET28a-cadA*、pET28a-cadA1和pET28a-cadA2转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA1、E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA2和E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA*，进一步使用摇瓶催化验证工程菌的1，5-戊二胺催化性能。
实施例3 工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA*的全细胞催化性能筛选
将保存在-80℃冻存管的上述构建的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA*和对照工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA1和E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA2分别划线接种于含有50mg/L卡那霉素的LB培养基平板，置于37℃培养箱中培养12h，刮取平板上培养好的菌苔转接入含有3mL液体LB培养基(含有50mg/L卡那霉素)的试管，置于37℃摇床200rpm培养10h。取培养好的菌液按2％接种量(体积比)转接入含有50mL液体LB培养基(含有50mg/L卡那霉素)的500mL摇瓶，置于37℃摇床200rpm培养，培养2.5h加入终浓度为0.2mM的诱导剂IPTG，继续按照相同的条件在摇床中诱导培养2h，测量菌体吸光值OD600，以OD600值乘以0.42计算细胞干重。加入相同体积的400g/L的市售饲用98.5％赖氨酸盐酸盐和0.1g/L磷酸吡哆醛的水溶液，按照相同的条件在摇床中全细胞催化1h，取样后离心，倒出上清液置于-20℃保存，用于1，5-戊二胺浓度检测，检测方法如实施例1所述。
通过摇瓶催化筛选，比较单位细胞量的1，5-戊二胺产量，即比生产速率，计算公式为：比生产速率＝每小时的1，5-戊二胺产量/细胞干重。获得了一系列催化性能显著提高的工程菌，如表1所示，其中51#、55#、59#工程菌的戊二胺比生产速率度分别达到33.94±1.96g/g/h、33.31±3.23g/g/h和31.21±1.42g/g/h，显著高于对照菌株。
表1工程菌的1，5-戊二胺全细胞催化性能比较
工程菌48#、50#、51#、53#、55#、57#、58#和59#相对应的P1引物(见实施例2)序列如下：
P1-48：5-CATGCCATGGCAGTTATAGCAATATTGAATCATATGGGAGT(SEQ ID No.10)
P1-50：5-CATGCCATGGCAGTTATAGCAATATTGAATCACATGGGGGT(SEQ ID No.11)
P1-51：5-CATGCCATGGCAGTTATAGCAATATTAAATCACATGGGGGT(SEQ ID No.12)
P1-53：5-CATGCCATGGCAGTTATTGCAATATTGAATCACATGGGAGT(SEQ ID No.13)
P1-55：5-CATGCCATGGCAGTTATTGCAATATTGAATCATATGGGAGT(SEQ ID No.14)
P1-57：5-CATGCCATGGCAGTTATTGCAATATTGAATCACATGGGGGT(SEQ ID No.15)
P1-58：5-CATGCCATGGCAGTTATTGCAATATTAAATCACATGGGGGT(SEQ ID No.16)
P1-59：5-CATGCCATGGCAGTTATTGCAATATTAAATCATATGGGAGT(SEQ ID No.17)
实施例4赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB的表达优化
一、E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA*55的获得
以P1-55和P2为引物进行PCR扩增，按照见实施例2(一)部分的方法构建pET28a-cadA*55，将质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态，获得E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA*55工程菌，简写为工程菌pA。
二、E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadBA的获得
(一)以野生型大肠杆菌K12 W3110菌株的基因组DNA为模板，使用高保真聚合酶KAPA HiFiTMHotStar，以P5和P6为引物进行PCR扩增，PCR程序为：98℃变性30秒，65℃退火15秒，72℃延伸150秒，26个循环，获得长度为3604bp的cadBA片段(cadB和cadA两个基因在同一个操纵子cadBA上，因此该产物包含两个基因的产物)，其中cadB基因的核苷酸序列如SEQID No.2所示。
P5：5’-CATGCCATGGGTTCTGCCAAGAAGATCGGGCT-3’(SEQ ID No.18)
(下划线所示序列为Nco I酶切识别位点)
P6：5’-CCCAAGCTTGCAAGCCACTTCCCTTGTACGAGCTA-3’(SEQ ID No.19)
(下划线所示序列为Hind III酶切识别位点)
(二)Nco I和Hind III双酶切上述PCR得到的DNA分子，得到基因片段；Nco I和Hind III双酶切pET28a(+)，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，转化至EC135感受态，在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选，获得含有重组质粒的转化子，提取质粒并将其送测序，将结果正确的质粒命名为pET28a-cadBA。
(三)将重组质粒pET28a-cadBA转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadBA，简写为工程菌pBA。
二、E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA*55-RBSnative-cadB的获得
(一)以野生型大肠杆菌K12 W3110菌株的基因组DNA为模板，使用高保真聚合酶KAPA HiFiTMHotStar，以P7和P9为引物进行PCR扩增，PCR程序为：98℃变性30秒，65℃退火15秒，72℃延伸150秒，26个循环，获得含有自身RBS的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因序列RBSnative-cadB，。
P7：5’-CCCAAGCTTTGAAATTAGGAGAAGAGCATG-3’(SEQ ID No.20)
(下划线所示序列为Hind III酶切识别位点)
P8：5’-CCCAAGCTTCTAGGAAGTAGAGCATGAGTTCTGCCAAGA-3’(SEQ ID No.21)
(下划线所示序列为Hind III酶切识别位点)
P9：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAATGTGCGTTAGACGCGGT-3’(SEQ ID No.22)
(下划线所示序列为Not I酶切识别位点)
(二)Not I和Hind III双酶切上述PCR得到的DNA分子，得到基因片段；Not I和Hind III双酶切pET28a-cadA*55，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，转化至EC135感受态，在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选，获得含有重组质粒的转化子，提取质粒并将其送测序，将结果正确的质粒命名为pET28a-cadA*55-RBSnative-cadB。
(三)将pET28a-cadA*55-RBSnative-cadB转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA*55-RBSnative-cadB，简写为工程菌pA-B。
三、E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA*55-RBSBCD22-cadB的获得
(一)以野生型大肠杆菌K12 W3110菌株的基因组DNA为模板，使用高保真聚合酶KAPA HiFiTMHotStar，以P8和P9为引物进行PCR扩增，PCR程序为：98℃变性30秒，65℃退火15秒，72℃延伸150秒，26个循环，获得包含弱RBS部分序列(Mutalik et al，Nature methods，2013.10(4)：354-360.)的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因序列RBSBCD22-cadB，其中RBSBCD22片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。(二)Not I和Hind III双酶切上述PCR得到的DNA分子，得到基因片段；Not I和Hind III双酶切pET28a-cadA*55，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，化转至EC135感受态，在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选，获得含有重组质粒的转化子，提取质粒并将其送测序，将结果正确的质粒命名为pET28a-cadA*55-RBSBCD22-cadB。
(三)将pET28a-cadA*55-RBSBCD22-cadB转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA*55-RBSBCD22-cadB，简写为工程菌pA-RBSBCD22-B。
四、在大肠杆菌染色体上替换cadB基因的启动子
(一)以大肠杆菌BL21(DE3)菌株基因组DNA为模板，以引物P10和P11、P12和P13分别进行PCR扩增，获得长度分别为510bp和610bp的两条DNA片段，分别如SEQ ID No.4和SEQID No.5所示。其中，T7启动子序列和lac调控序列由引物P9和P10引入。PCR按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸30s(30个循环)。其中，引物序列如下：
P10：5’-CGCGGATCCTGCGCCATTCTCAACATCCTT-3’(SEQ ID No.23)
(下划线所示序列为BamHI酶切识别位点)
P11：5’-TCCGCTCACAATTCCCCTATAGTGAGTCGTATTATGCCGCAACATATTATACCAACAG-3’(SEQ ID No.24)
P12：5’-ACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCGAAATTAGGAGAAGAGCATGAG-3’(SEQ ID No.25)
P13：5’-ATTGCGGCCGCTCCGCAGTATTCCAGTTAGCT-3’(SEQ ID No.26)
(下划线所示序列为Not I酶切识别位点)
(二)将SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的DNA分子的混合物为模板，以P10和P13为引物，通过Overlap PCR扩增到长约1.1kb的Overlap片段，如SEQ ID No.29所示。其中PCR程序为：94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸60秒，26个循环。
SEQ ID No.29中自5’末端起第477位至第495位核苷酸所示的序列为T7启动子序列，SEQ ID No.29中自5’末端起第496位至第520位核苷酸所示的序列为lac调控序列。
Bam HI和Not I双酶切SEQ ID No.29所示的DNA分子，得到基因片段；Bam HI和NotI双酶切pKOV质粒，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pKOV-PT7-cadB，并其送测序，验证其含有正确T7启动子和lac调控基因序列，保存备用。
(三)将构建好的pKOV-PT7-cadB质粒电转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，于30℃、150rpm，在LB培养基中复苏2h后，根据Addgene公司的pKOV质粒的商品指南，挑选出同源重组阳性的单克隆，经测序确认其染色体上的cadB基因的自身启动子被替换为T7启动子，将该菌株命名为E.coli BL21 PcadB：：PT7，进一步将质粒pET28a-cadA*55转化至该菌中，获得工程菌E.coli BL21PcadB：：PT7/pET28a-cadA*55，简写为Chr-T7-B。
实施例5反转录PCR验证cadB诱导表达
按照实施例3菌体培养和诱导的方法，收集添加诱导剂2h后的工程菌pA和工程菌Chr-T7-B，提取RNA并通过反转录PCR验证cadB基因的诱导表达情况。使用天根生化科技有限公司的细菌总RNA提取试剂盒，并按照其说明提取RNA具体步骤如下：收集新鲜培养的菌液稀释至OD600约为0.8，取1mL稀释液4℃低温13,400×g离心2min，并用去离子水重新悬浮，离心2min。用含0.40mg/mL溶菌酶的TE缓冲液100μL彻底重悬菌体，孵育8min。加入350μL裂解液RL，使用涡旋振荡器混匀，若出现不溶性沉淀，13,400×g离心2min，将上清转移至另一离心管中。加入250μL无水乙醇，混匀。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，吸附柱放在收集管中，13,400×g离心1min，倒掉废液，将吸附柱CR3放回收集管中。向吸附柱CR3中放入350μL去蛋白液RW1，13,400×g离心1min，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱CR3中放入80μL DNase I溶液，室温放置30min，向吸附柱CR3中放入350μL去蛋白液RW1，13,400×g离心1min，倒掉废液，将吸附柱CR3放回收集管中。向吸附柱CR3中放入500μL漂洗液RW，室温放置2min，13,400×g离心1min，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。重复漂洗一次后，13,400×g离心2min，倒掉废液，将吸附柱CR3置于室温放置8min以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加60μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，13,400×g离心2min，得到RNA溶液。取1.5μg总RNA的量加入2μL loading buffer，凝胶电泳检测，检测合格后将提取的RNA在-80℃中存储备用。
使用天根生化科技有限公司FastQuant cDNA第一链合成试剂盒，将模板RNA在冰上解冻，5×gDNA buffer，FQ-RT primer Mix，10×Fast RT buffer，RNase-Free ddH2O在室温解冻，解冻后迅速置于冰上，使用前每种溶液涡旋振荡均匀，简短离心以收集残留在试管壁的液体。按照表2的基因组DNA(gDNA)的去除体系配置混合液，彻底混匀，简短离心，置于42℃，孵育30min，然后至于冰上。
表2 gDNA去除反应体系
按照相同的反应体系(10.00μL)配置反转录反应体系，如下表3所示
表3反转录反应体系
将反转录体系中的RT Enzyme Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀，42℃孵育30min之后加热至95℃维持5min，然后放在冰上，得到的cDNA储存在-20℃备用。其中反向引物为P14，正向引物为P15：
P14：5’-TACCGTTGCTGTCGACTTCA-3’(SEQ ID No.27)
P15：5’-CTCCGTTTGCAATCAGTGCT-3’(SEQ ID No.28)
以诱导后的工程菌pA和工程菌Chr-T7-B的cDNA为模板，以BL21染色体基因组为阳性对照模板(+)，以反转录前去除gDNA的RNA为阴性对照模板(A-和TB-)，以gapA基因作为内参基因(GPA和GPB)，以P14和P15为引物，使用Taq DNA聚合酶进行PCR。PCR产物的核酸电泳图(见图3)表明，内参基因泳道GPA和GPB可以观察到目的条带，表明反转录成功；阴性对照(A-和TB-)和工程菌pA(A)的cDNA均扩增不出目的条带，而阳性对照(+)和工程菌Chr-T7-B的cDNA均可以扩增出目的条带(186bp)，表明工程菌Chr-T7-B的cadB基因成功诱导表达。
实施例6、诱导表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB对工程菌生长和戊二胺催化的影响
一、将保存在-80℃冻存管的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA*55(图2中简写为pA)、E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadBA(图2中简写为pBA)、E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA*55-RBSnative-cadB(图2中简写为pA-B)和E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA*55-RBSBCD22-cadB(图2中简写为pA-RBSBCD22-B)和E.coli BL21(DE3)PcadB：：PT7/pET28a-cadA*55(图2中简写为Chr-T7-B)分别划线接种于含有50mg/L卡那霉素的LB培养基平板，置于37℃培养箱中培养12h，刮取平板上培养好的菌苔转接入含有3mL液体LB培养基(含有50mg/L卡那霉素)的试管，置于37℃摇床200rpm培养10h。取培养好的菌液按3％接种量(体积比)转接入含有50mL液体LB培养基(含有50mg/L卡那霉素)的500mL摇瓶，置于37℃摇床200rpm培养，每隔2h取样检测600nm波长的吸光值(OD600)。在2.5h后分别加入终浓度0.2mM的诱导剂IPTG，诱导后的菌体生长趋势如图2所示。加入诱导剂后，按照固有的基因排列顺序在质粒上过表达cadBA操纵子的工程菌pBA几乎不再生长，而在质粒上调整基因表达顺序的工程菌pA-B和pA-RBSBCD22-B，以及染色体上整合强启动子T7的工程菌则可以继续生长，与对照菌pA差异不大。进一步发现与工程菌pA-B相比，在质粒上使用活性较弱的RBSBCD22或者在染色体上使用强启动子替换的方法过表达cadB基因，可以提高cadB诱导表达后工程菌的生长速率。
按照实施例3的方法，通过摇瓶全细胞催化比较工程菌的催化性能，发现工程菌Chr-T7-B的催化生产戊二胺的性能最高，比对照工程菌pA提高了13.9％。
实施例7、不同诱导剂IPTG和乳糖诱导目的蛋白表达
将保存在-80℃冻存管的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA2-RBSBCD22-cadB划线于含有50mg/L卡那霉素的LB培养基平板，置于37℃培养箱中培养12h，刮取平板上培养好的菌苔转接入含有3mL液体LB培养基(含有50mg/L卡那霉素)的试管，置于37℃摇床200rpm培养10h。取培养好的菌液按3％接种量(体积比)转接入含有50mL液体LB培养基(含有50mg/L卡那霉素)的500mL摇瓶，置于37℃摇床200rpm培养，3.5h后分别加入终浓度0.1mM的IPTG、2mM和100mM的乳糖，继续培养4h。将加入诱导剂前后的培养液离心后，加入pH7.5的0.05M Tris-HCl缓冲液重悬菌体，调整OD600＝4.0，得到悬浊液，分别取16μL悬浊液加入6μL5倍浓度的Loading Buffer，95℃处理10分钟。取5μL处理后的样品进行SDS-PAGE蛋白电泳，染色并脱色后的电泳结果如图4所示。
图4表明，与加入诱导剂前的对照0号泳道相比，加入0.1mM IPTG的1号泳道、加入2mM和100mM乳糖的2号和3号泳道均有81kD的目的蛋白(CadA蛋白)条带，说明使用IPTG和乳糖均可诱导目的蛋白表达。
实施例8使用丰富培养基的菌体培养和1，5-戊二胺催化连续进行的生产工艺
刮取工程菌E.coli BL21(DE3)PcadB：：PT7/pET28a-cadA*55(简写为Chr-T7-B)菌苔接入含有50mL LB(含50mg/L卡那霉素(5-200mg/L均可)培养基的500mL三角瓶中，在37℃220rpm摇床中培养4h，得到种子液，OD600为4-5；将培养所得的种子液按5％的接种量接入含有2L丰富培养基的7.5L发酵罐中，培养温度为37℃，DO控制在50％以上，pH4.0-9.0，必要时可增压或通纯氧。3h加入0.4mM IPTG诱导，按照3g/L的速率补加葡萄糖。培养6h后OD600为25.1，加入300g/L的L-赖氨酸盐酸盐和0.08g/L的磷酸吡哆醛，开始全细胞催化。催化过程中pH迅速升高，补加硫酸调节pH维持在6.5。催化过程中通气量为1vvm，温度控制在37℃，搅拌桨转速为500rpm。
丰富培养基成分如下：酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，K2HPO4·3H2O 0.9g/L，KH2PO41.14g/L，(NH4)2SO410g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，微量元素储液5mL/L，卡那霉素50mg/L，余量为水。
微量元素储液：6g/L FeSO4·7H2O，1.35g/L CaCl2，0.8g/L ZnSO4·7H2O，1.5g/LMnSO4·4H2O，0.15g/L CuSO4·5H2O，0.2g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.1g/L H3BO3，0.25g/LCoCl2·6H2O和10mL/L浓盐酸，余量为水。
分别在催化时间为0.5、1.0和1.5h时，从发酵罐中取2mL催化产物，12000×g离心5分钟，倒出上清液，检测上清液中的1，5-戊二胺含量。按照实施例1的1，5-戊二胺检测方法检测全细胞催化过程中1，5-戊二胺产量，结果如表4所示，在该工艺下工程菌1.5h可催化产生151.5g/L(1.48mol/L)1，5-戊二胺。
表4各催化时间的1，5-戊二胺产量
催化时间(h) 1，5-戊二胺浓度(g/L)
0.5 75.1
1.0 115.2
1.5 151.5
实施例9使用无机盐培养基的菌体培养和1，5-戊二胺催化的生产工艺
种子液培养条件与实施例6相同，培养所得的种子液按2％的接种量接入含有2L无机盐培养基的7.5L发酵罐中，培养温度为37℃，DO控制在50％以上，必要时可增压或通纯氧。通过流加补料液使培养液中葡萄糖的浓度维持在5g/L以下。培养7h左右，菌体OD600达到40-50时加入0.1mM诱导剂IPTG，2h后菌体培养液OD600达到80以上。离心获得湿菌体，称取20g湿菌体分别加入2L(粗略计入预留的补加菌体悬浮液和磷酸的体积)含有600g、800g、900g和1000g赖氨酸盐酸盐和0.16g磷酸吡哆醛的全细胞催化水溶液体系中，开始催化生产1，5-戊二胺。催化过程中流加磷酸调节pH维持在6.5，通气量为1vvm，温度控制在37℃，搅拌桨转速为500rpm。
其中无机盐培养基成分和补料液成分如下：
无机盐培养基：2g/L(NH4)2HPO4.4g/L KH2PO4，0.85g/L Citric acid(柠檬酸)，0.7g/L MgSO4·7H2O，10mg/L FeSO4·7H2O，2.25mg/L ZnSO4·7H2O，0.2mg/L CuSO4·5H2O，0.5mg/L MnSO4·5H2O，0.23mg/L NaB4O7·10H2O，2.0mg/L CaCl2·2H2O，0.1mg/L NH4Mo7O24，0.15mg/L CoCl2·6H2O，余量为水。
补料液包含700g/L葡萄糖和20g/L MgSO4·7H2O，余量为水。
每隔0.5h从发酵罐中取出催化液，12000×g离心5分钟，倒出上清液，检测上清液中的1，5-戊二胺含量。按照实施例1的1，5-戊二胺检测方法检测全细胞催化过程中1，5-戊二胺产量，结果如图5至图8所示，从图5至图8中可以看出，戊二胺的最终产量随着底物赖氨酸盐酸盐浓度的提高而提高，当底物浓度为500g/L时，催化10h戊二胺产量可达到282.85g/L，而底物赖氨酸盐酸盐浓度为300-450g/L催化批次的戊二胺产量均在2.5h达到最高值，分别为170.49g/L、229.08g/L和256.60g/L。底物赖氨酸盐酸盐添加量为300g/L、400g/L、450g/L和500g/L的前0.5h戊二胺全细胞催化合成速率(即生产强度)分别达到154.50g/L/h、206.01g/L/h、265.04g/L/h和296.97g/L/h，而总体生产强度分别为68.20g/L/h、91.63g/L/h、102.64g/L/h和28.29g/L/h。

Claims (25)

1.工程菌，其特征在于，是在大肠杆菌B株或其衍生菌株中过表达赖氨酸脱羧酶基因，同时适量表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB；
所述过表达赖氨酸脱羧酶基因是将改造的赖氨酸脱羧酶基因的全部核苷酸序列置于外源表达质粒中的启动子和RBS之后进行表达；
所述适量表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因是指将包含RBS序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因的全部核苷酸序列置于外源表达质粒中的赖氨酸脱羧酶基因的核苷酸序列之后进行表达；或，使用适用于大肠杆菌的能解除cadB转录阻遏的启动子替换大肠杆菌B株或其衍生菌株染色体上的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因自身的启动子，所述适用于大肠杆菌的能解除cadB转录阻遏的启动子具体为T7启动子,
所述在大肠杆菌B株或其衍生菌株中过表达赖氨酸脱羧酶基因，同时适量表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB的方法为如下(1)或(2)所示：
(1)将含有赖氨酸脱羧酶蛋白基因和包含RBS序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因的片段导入所述大肠杆菌B株或其衍生菌株中；
所述片段是通过重组表达载体导入的；
所述重组表达载体具体是将所述片段***pET28a(+)的多克隆位点间得到的；
所述重组表达载体具体构建过程如下：将含有赖氨酸脱羧酶蛋白基因的片段***pET28a(+)的NcoI和SalI酶切位点间，得到重组表达载体1；再将包含RBS序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因的片段***重组表达载体1的NotI和HindIII位点间得到；
(2)将所述大肠杆菌B株或其衍生菌株的cadBA操纵子的启动子替换为适用于大肠杆菌的能解除cadB转录阻遏的启动子，再将含有赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因的片段导入所述大肠杆菌B株及其衍生菌株中；
所述将大肠杆菌B株或其衍生菌株的cadBA操纵子的启动子替换为T7启动子的过程如下：将带有T7启动子序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因的质粒导入所述大肠杆菌B株或其衍生菌株中进行同源重组得到；
所述带有T7启动子序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因的质粒是将带有T7启动子序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因***pKOV质粒的BamHI和NotI位点间得到；
所述含有赖氨酸脱羧酶蛋白基因的片段是通过重组表达载体导入的；
所述重组表达载体具体是将所述片段***pET28a(+)的多克隆位点间得到的；
所述重组表达载体具体构建过程如下：将含有赖氨酸脱羧酶蛋白基因的片段***pET28a(+)的NcoI和SalI酶切位点间；
所述赖氨酸脱羧酶基因是改造的赖氨酸脱羧酶基因cadA，所述改造是指赖氨酸脱羧酶基因cadA的第二个密码子突变为大肠杆菌使用频率较高的第二位密码子；再将所述赖氨酸脱羧酶基因cadA的+7～+33位碱基进行同义密码子替换以增加稀有密码子个数并选择转录产生的mRNA二级结构的最小自由能低和翻译起始效率高的序列，所述改造的赖氨酸脱羧酶基因cadA的+1～+35位碱基包括:
5’-ATGGCAGTTATAGCAATATTGAATCATATGGGAGT-3’
5’-ATGGCAGTTATAGCAATATTGAATCACATGGGGGT-3’
5’-ATGGCAGTTATAGCAATATTAAATCACATGGGGGT-3’
5’-ATGGCAGTTATTGCAATATTGAATCACATGGGAGT-3’
5’-ATGGCAGTTATTGCAATATTGAATCATATGGGAGT-3’
5’-ATGGCAGTTATTGCAATATTGAATCACATGGGGGT-3’
5’-ATGGCAGTTATTGCAATATTAAATCACATGGGGGT-3’
5’-ATGGCAGTTATTGCAATATTAAATCATATGGGAGT-3’；
所述赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因如SEQ ID NO.2所示，所述RBS序列如SEQ IDNO.3所示。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌B株为大肠杆菌BL21(DE3)。
3.一种制备1,5-戊二胺的方法，包括如下步骤：将权利要求1或2所述的工程菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养，得到种子液；将种子液接入丰富培养基中，发酵培养；加入诱导剂诱导表达，直接在培养液中加入或收集去除发酵液的菌体细胞再加入底物赖氨酸和维生素B6开始全细胞催化，即得；
所述诱导剂具体为IPTG或乳糖；
所述底物赖氨酸具体为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发酵液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离赖氨酸、赖氨酸盐干粉或其溶液；
所述维生素B6为吡哆醛、磷酸吡哆醛和/或盐酸吡哆醛；
所述丰富培养基中含有10g/L酵母提取物,20g/L胰蛋白胨,0.9g/L K2HPO4·3H2O,1.14g/L KH2PO4,10g/L(NH4)2SO4,0.3g/L MgSO4·7H2O,5mL/L微量元素储液，50mg/L卡那霉素，余量为水；
所述微量元素储液含有6g/L FeSO4·7H2O,1.35g/L CaCl2,0.8g/L ZnSO4·7H2O,1.5g/L MnSO4·4H2O,0.15g/L CuSO4·5H2O,0.2g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O,0.1g/L H3BO3,0.25g/L CoCl2·6H2O和10mL/L浓盐酸，余量为水。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述LB液体培养基中卡那霉素的浓度为5-200mg/L；
所述种子液的OD600为2-25；
所述种子液接入丰富培养基的比例为0.5-30％；
所述发酵培养的温度为25℃-45℃；
所述发酵培养的DO在50％以上；
所述发酵培养的pH为4.0-9.0；
所述IPTG的终浓度为0.01-10mM；
所述IPTG加入的时间为发酵培养后2-10h；
所述IPTG诱导时还包括0.5-10g/L的速率补加葡萄糖的步骤；
所述赖氨酸盐为L-赖氨酸盐酸盐；
所述加入底物赖氨酸和维生素B6开始全细胞催化的时间为诱导开始后的0.5-10h；
所述催化过程中pH维持在4.0-10.0之间；
所述催化还包括如下步骤：按照0-5g/L的速率补加葡萄糖，通气量为0-10vvm，温度控制在25-60℃，搅拌转速为0-1200rpm。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述LB液体培养基中卡那霉素的浓度为50mg/L。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述种子液的OD600为3-5。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述种子液接入丰富培养基的比例为5％。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的温度为37℃。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述IPTG的终浓度为0.05-0.4mM。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述IPTG加入的时间为发酵培养后2-6h。
11.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述IPTG诱导时还包括3g/L的速率补加葡萄糖的步骤。
12.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述加入底物赖氨酸和维生素B6开始全细胞催化的时间为诱导开始后的1-5h。
13.一种制备1,5-戊二胺的方法，包括如下步骤：将权利要求1或2所述的工程菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养，得到种子液；将种子液接入无机盐培养基，发酵培养；加入诱导剂诱导表达，直接在培养液中加入或收集去除发酵液的菌体细胞后再加入底物赖氨酸和维生素B6开始全细胞催化，即得；
所述诱导剂为IPTG或乳糖；
所述底物赖氨酸为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发酵液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离赖氨酸以及赖氨酸盐干粉或其溶液；
所述维生素B6为吡哆醛、磷酸吡哆醛和盐酸吡哆醛。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述LB液体培养基中卡那霉素的浓度为5-200mg/L；
所述种子液的OD600为2-25；
所述种子液接入无机盐培养基的比例为0.5-30％；
所述发酵培养的温度为25℃-45℃；
所述发酵培养的DO在50％以上；
所述发酵培养时葡萄糖的浓度维持在5g/L以下；
所述IPTG的终浓度为0.01-10mM；
所述IPTG加入的时间为发酵培养后3-20h；
所述赖氨酸盐为L-赖氨酸盐酸盐；
所述加入底物赖氨酸和维生素B6开始全细胞催化的时间为诱导开始后的0.5-24h；
所述催化过程中pH维持在4.0-10.0之间；
所述催化还包括如下步骤：按照0-50g/L的速率补加葡萄糖，通气量为0-10vvm，温度控制在25-60℃，搅拌转速为0-1200rpm。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述LB液体培养基中卡那霉素的浓度为50mg/L。
16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述种子液的OD600为3-5。
17.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述种子液接入无机盐培养基的比例为2％。
18.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的温度为37℃。
19.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述发酵培养时，通过流加补料液实现葡萄糖的浓度维持在5g/L以下，所述补料液含有700g/L葡萄糖和20g/L MgSO4·7H2O，余量为水。
20.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述IPTG的终浓度为0.05-0.4mM。
21.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述IPTG加入的时间为发酵培养后4-12h。
22.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述加入底物赖氨酸和维生素B6开始全细胞催化的时间为诱导开始后的1-5h。
23.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述催化过程中pH维持在6.5。
24.权利要求1或2所述的工程菌在制备1,5-戊二胺中的应用。
25.权利要求1或2所述的工程菌在催化底物赖氨酸和维生素B6生成1,5-戊二胺中的应用；
所述底物赖氨酸具体为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发酵液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离赖氨酸以及赖氨酸盐干粉或其溶液，其中赖氨酸盐干粉包括L-赖氨酸盐酸盐和赖氨酸硫酸盐；
所述维生素B6具体为吡哆醛、磷酸吡哆醛和/或盐酸吡哆醛。
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生物法合成戊二胺研究进展;李东霞等;《生物工程学报》;20140225;第30卷(第2期);161-174

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