CN106414416B - 结晶型ARB-NEPi复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

公开了结晶型ARB‑NEPi复合物及其制备方法和应用，ARB‑NEPi复合物是指[3‑((1S，3R)‑1‑联苯‑4‑基甲基‑3‑乙氧基羰基‑1‑丁基氨甲酰基)丙酸‑(S)‑3’‑甲基‑2’‑(戊酰基{2”‑(四唑‑5‑基)联苯‑4’‑基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O，并公开了含有效量结晶型[3‑((1S，3R)‑1‑联苯‑4‑基甲基‑3‑乙氧基羰基‑1‑丁基氨甲酰基)丙酸‑(S)‑3’‑甲基‑2’‑(戊酰基{2”‑(四唑‑5‑基)联苯‑4’‑基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O药物组合物及其在制备治疗或预防与中性内肽酶有关的疾病、心血管、抗高血压、急慢性心衰如、充血性心衰、左心室机能障碍、肥厚性心肌病、糖尿病性心肌病、室上性和室性心律不齐、心房纤维颤动、心房扑动或有害的血管重构等药物中的用途。

Description

结晶型ARB-NEPi复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体地，本发明涉及双重作用的ARB-NEPi复合物新晶型及其制备方法和应用。
背景技术
中性内肽酶(EC 3.4.24.11；脑啡肽酶；必肽酶；NEP)是一种可以在芳族氨基酸的氨基末端上裂解各种肽底物的包含锌的金属蛋白酶。这种酶的底物非限制性地包括心钠素(ANF，也被称为ANP)、脑钠肽(BNP)、met和leu脑啡肽、缓激肽、神经激肽A和P物质。
ANF是一族血管舒张、利尿和抗高血压的肽类，一种形式——ANF 99-126是在心脏扩张情况中由心脏释放的循环肽激素。ANF的功能是维持盐和水的体内平衡以及调节血压。ANF在循环中被至少两个过程迅速灭活：受体-介导的清除和在NEP进行的酶灭活。NEP抑制剂增强了实验动物进行药理学ANF注射后的低血压、利尿、促尿钠***和血浆ANF响应。通过两种特定的NEP抑制剂进行的ANF的增强，1988年，美国专利US4749688中一般性地公开了可以用NEP来增强ANF。同年，美国专利US4740499中公开了噻奥芬(thiorphan)和凯拉托芬也可以用于增强心房肽的应用。此外，NEP抑制剂可降低血压和发挥ANF-样作用如在一些形式的实验性高血压中的利尿和增加环鸟苷3’，5’-单磷酸(cGMP)***的作用。因为ANF的抗体将抵消血压的降低，所以NEP抑制剂的抗高血压作用是通过ANF介导的。长期和不进行控制的高血压血管疾病最终将导致靶器官如心和肾的各种病理学改变。持续的高血压也能导致中风的发生率增加。因此，强烈需要对抗高血压治疗的功效进行评估，即对除了血压降低以外的其它心血管终点事件进行检查以进一步发现联合治疗的益处。
1993年，Gary Ksander等在美国专利US5217996中公开了一类联芳基取代的4-氨基丁酸衍生物，该类化合物被发现具有明显的NEP抑制活性，其中最具代表性的一个化合物为N-(3-羧基-1-氧代丙基)-(4S)-对-苯基苯基甲基)-4-氨基-2R-甲基丁酸乙酯(又称AHU-377)。
Figure GPA0000221424930000031
血管紧张素II是引起血管收缩的激素，而血管收缩又导致高血压和心脏劳损。人们已经知道血管紧张素II能够与靶细胞表面上的受体相互作用。目前已经鉴别出血管紧张素II的两种受体亚型，称为AT1和AT2。最近一段时间，人们付出了巨大的努力鉴定能够与AT1受体结合的物质。现在已经知道，血管紧张素受体阻断剂(ARBs，血管紧张素II拮抗剂)能够通过阻止血管紧张素II与其在血管壁上的受体结合，从而导致血压降低。由于能够抑制AT1受体，所以此类拮抗剂可以用于抗高血压，或者用于治疗充血性心衰以及其它适应症。
2008年，中国专利CN101098689公开了一种血管紧张素剂拮抗剂(ARB)和中性内肽酶抑制剂(NEPi)双重作用的复合物(特别是超分子络合物)，具有如下通式所述：[ARB(NEPi)]Na1-3·xH2O，其中x为0-3，优选2.5，具体指[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·2.5H2O(LCZ696)，简化结构如下所示：
Figure GPA0000221424930000032
还公开了结晶形式[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·2.5H2O(LCZ696)的晶型粉末衍射的数据为：
Figure GPA0000221424930000041
对于一种给定的物质，验证X-射线衍射实检测方法获得的晶格平均晶面间距和强度的好的方法是检测这些值是否与复杂的单晶结构解析计算的数据相一致。
单晶结构测定得到晶胞常数和原子位置，通过计算机辅助计算的方法可以将单晶衍射图能够对应于相应固体。采用的程序为应用软件Materials Studio(Accelrys)中的Powder Pattern。下表显示了这些通过XRPD测定和计算单晶数据得到的数据比较，即[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]三钠半五水合物的重要的晶格平面间隔和强度的XRPD测定值和单晶计算值的数据比较。
Figure GPA0000221424930000051
该专利还公开了结晶型[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·2.5H2O的熔化初始温度(onset temperature)和最大峰温度(Peak temperature)分别为139℃和145℃。
此类复合物也可以通过采用傅里叶变换衰减全反射红外光谱法(ATR-FTIR)光谱仪(Nicolet Magna-IR 560)而得到的红外吸收光谱定性，采用下面所述的重要波段(以波长数据的倒数(cm-1)表示)定性：2956(w)，1711(st)，1637(st)，1597(st)，1488(w)，1459(m)，1401(st)，1357(w)，1295(m)，1266(m)，1176(w)，1085(m)，1010(w)，1942(w)，907(w)，862(w)，763(st)，742(m)，698(m)，533(st)。络合物的特征特别在于下列峰：1711(st)，1637(st)，1597(st)和1401(st)。ATR-IR的所有吸收波段的误差为±2cm-1。吸收波段的强度表示如下：(w)＝弱；(m)＝中；和(st)＝强。
此类复合物也可以通过由拉曼色谱仪测定的拉曼色谱定性，该色谱仪具有785nm激光激发源(Kaiser Optical Systems，Inc.)，以下列重要波段(以波长数据的倒数(cm-1)表示：3061(m)，2930(m，宽)，1612(st)，1523(m)，1461(w)，1427(w)，1287(st)，1195(w)，1108(w)，11053(w)，1041(w)，1011(w)，997(m)，866(w)，850(w)，822(w)，808(w)，735(w)，715(w)，669(w)，643(w)，631(w)，618(w)，602(w)，557(w)，522(w)，453(w)，410(w)，328(w)。所有的拉曼波段的误差±2cm-1。吸收波段的强度表示如下：(w)＝弱；(m)＝中；和(st)＝强。
单晶X-射线结构测定的无中心间隔群P21为常规的对映体纯的分子的间隔群。该间隔群中有两个一般位置(general position)，这意味着对于单位晶胞中的12个结构单位，在不对称单元中一定有18个钠离子和15个水。
基于单晶结构解析，[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]三钠半五水合物超分子的不对称单元每一个均含有6个ARB和NEPi部分、18个钠原子和15个水分子。[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]三钠半五水合物可以称为钠超分子络合物，可以被氧配基配位。这些氧来自上述部分的12个羧酸盐基团和18个羰基基团以及15个水分子中的13个。该结晶是这些钠络合物的无限三维空间网状结构。
中国专利CN101098689公开了一种血管紧张素剂拮抗剂(ARB)和中性内肽酶抑制剂(NEPi)双重作用的复合物，具体指[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·2.5H2O(LCZ696)。LCZ696理化性质具有明显的缺点，即在较高的湿度下，容易卤化(固体吸附水分后液化)。在药学上，化合物固体卤化对药物开发和产品等各方面带来十分不利的影响。比如，吸湿液化后难以制成固体口服制剂，药物含量也难以准确定量。在压片过程中，容易发生粘冲和片剂产生花斑，硬性制剂质量。另外，化合物液化后化学性质不够稳定，影响疗效。因此，化合物的液化对药物产品的方方面都有不利的影响。因此急需要找到新的更加稳定的LCZ696新晶型或者新的水合物，来改善或克服卤化问题。本发明中发现新的水合物及其结晶态，在吸湿性上与CN101098689中报道的三钠半五水合物(LCZ696)相比，有明显进步和提高。
发明内容
为了解决现有技术存在的缺陷，发明人在深入研究的技术上提出了一种ARB-NEPi复合物新晶型及其制备方法和应用，ARB-NEPi复合物是指[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O，本发明得到的新晶型和水合物具有更好的理化性质，改善了现有技术中晶型的卤化性质，更利于药学上可开发的晶型，易于保存，质量稳定可靠，其制备方法，可工业应用，具有广阔的药用前景。
本发明一方面提供了一种结晶型[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O，其粉末X射线衍射图包括位于：4.1±0.2°，4.9±0.2°，5.2±0.2°，9.6±0.2°，12.5±0.2°，16.9±0.2°，18.1±0.2°，19.4±0.2°和27.1±0.2°的衍射角(2θ)处的峰。
作为进一步优选的方案，其粉末X射线衍射图优选还包括位于8.3±0.2°，154±0.2°，17.4±0.2°，18.8±0.2°，20.0±0.2°，21.3±0.2°，22.6±0.2°，22.9±0.2°，24.7±0.2°，25.2±0.2°，25.7±0.2°，27.8±0.2°，和29.9±0.2°的衍射角(2θ)处的峰。
最优选，其粉末X射线衍射图与图1中显示的衍射角(2θ)处的峰基本上相同，其X射线粉末衍射数据如表1所示：
表1
Figure GPA0000221424930000071
作为进一步优选的方案，Burker D8粉末衍射仪测定的粉末X射线衍射图包括下列晶格平面间隔：
Figure GPA0000221424930000072
18.2±0.1，16.9±0.1，10.7±0.1，7.1±0.1，5.2±0.1，4.9±0.1，4.6±0.1，4.2±0.1，3.9±0.1，3.5±0.1和3.0±0.1。
作为进一步优选的方案，其粉末X射线衍射图优选还包括位于：7.9±0.2°，14.7±0.2°，15.5±0.2°，16.1±0.2°，20.2±0.2°，20.8±0.2°，25.5±0.2°，27.7±0.2°，27.9±0.2°和29.2±0.2°的衍射角(2θ)处的峰；优选的，其粉末X射线衍射图与图5中显示的衍射角(2θ)处的峰基本上相同。
作为进一步优选的方案，其粉末X射线衍射图优选还包括位于：8.9±0.2°，14.5±0.2°，15.2±0.2°，16.0±0.2°，25.8±0.2°和27.9±0.2°的衍射角(2θ)处的峰；优选的，其粉末X射线衍射图与图17中显示的衍射角(2θ)处的峰基本上相同。
作为进一步优选的方案，其粉末X射线衍射图优选还包括位于：14.7±0.2°，15.1±0.2°，17.6±0.2°，18.7±0.2°，22.6±0.2°，23.2±0.2°，24.5±0.2°和29.1±0.2°的衍射角(2θ)处的峰；优选的，其粉末X射线衍射图与图13中显示的衍射角(2θ)处的峰基本上相同。
作为进一步优选的方案，其粉末X射线衍射图优选还包括位于：6.3±0.2°，13.6±0.2°，14.2±0.2°，14.8±0.2°，15.2±0.2°，17.6±0.2°，18.7±0.2°，22.6±0.2°，23.3±0.2°，24.6±0.2°和29.2±0.2°的衍射角(2θ)处的峰；优选的，其粉末X射线衍射图与图21中显示的衍射角(2θ)处的峰基本上相同。
本文所使用的关于X射线衍射峰位置的术语“基本上相同的”意指考虑典型的峰位置和强度可变性。例如，本领域技术人员将理解，峰位置(2θ)将由于XRPD仪器不同，而造成测量值有所变化，有时这种变化达有时多达0.2°。此外，本领域技术人员将理解，XRPD样品制样方法，XRPD仪器，样品结晶度，样品用量以及晶体择优取向等因素将导致样品XRPD衍射图中相对峰强度的改变。
作为进一步优选的方案，所述X选自2.0～9.0，优选自2.5～6.5，更优选自2.5～3.5，更优选自2.5～3.5，最优选自2.5、3.0±0.2。
作为更进一步优选的方案，本发明提供了一种结晶型[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O，所述结晶型[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O是超分子结构的结构简式，其包含不对称单位，每个不对称单元均含有6个ARB、6个NEPi、18个钠原子及12-54个水分子，其中所述的ARB为(S)-N-戊酰基-N-{[2’-(1H-四唑-5-基)联苯-4-基]甲基}-缬氨酸，所述的NEPi为(2R，4S)-5-联苯-4-基-4-(3-羧基-丙酰基氨基)-2-甲基-戊酸乙基酯。
优选的，每个不对称单元均含有6个ARB、6个NEPi、18个钠原子及15-39个水分子。
更优选的，每个不对称单元均含有6个ARB、6个NEPi、18个钠原子及15个水分子或18±0.5个水分子。
更优选的，每个不对称单元均含有6个ARB、6个NEPi、18个钠原子及17.5个水分子，其结构如下：
Figure GPA0000221424930000091
更优选的，所述每个不对称单元中包含15个配位水分子，2.5个网络空间水分子。
更优选的，所述超分子结构的单晶呈无色片状，单斜晶系，空间群为P21，晶胞参数：
Figure GPA0000221424930000092
α＝90°，β＝119.278(9)°，γ＝90°。
更优选的，所述超分子结构的单晶大小为0.36x 0.34x 0.10mm，晶胞体积
Figure GPA0000221424930000093
Figure GPA0000221424930000094
晶胞内分子数Z＝2，单位晶格的独立区域中有两个单元。
其单晶的具体培养方法为：称取约510mg样品至20mL玻璃瓶中，加入17mL98％丙酮/水，在65℃条件下将样品溶解，并平均趁热过滤至17个新的4mL玻璃瓶，放置45℃条件下，恒温放置，得到上述单晶。其单晶衍射及解析如下：
1、单晶衍射试验：
在Rigaku XtaLAB P200衍射仪上，-100℃时收集衍射强度数据，CuKα辐射，人工多层膜聚焦镜，准直管φ＝0.30mm，晶体与Pilatus200K探测器距离为35mm，管压40kV，管流30mA，ω扫描，最大2θ角为146.9°，扫描范围为0-180°，回摆角度为1°，间隔为1°，扫描速度为5-10s/°，每个画面扫描一次，总计摄取3579幅图像，总衍射点为251362个，独立衍射点为59848个(Rint＝0.0769)，可观察点(F2≥2σF2)为48100个，θ角到67.687°时数据完整度为99.3％。
2、单晶解析方法：
在微机上用直接法(sir2011)解析晶体结构，从E图上获得全部非氢原子位置，使用最小二乘法(SHELXL-2014/7)修正结构参数和判别原子种类，使用几何计算法和差值Fourier法获得氢原子位置，最终可靠因子R1＝0.0700，wR2＝0.1691，S＝1.070，Flack因子为0.07(2)。最终确定最小化学计量式为C288H365N36Na18O65.50，计算单个分子的分子量为5792.93，计算晶体密度为1.240g/cm3。
Figure GPA0000221424930000101
3、解析结果：
单晶解析结果表明：每个超分子AHU-377-缬沙坦-钠单晶的不对称单元中包含6个缬沙坦、6个AHU-377、18个钠离子和17.5个水分子。该晶体结构是由缬沙坦和AHU-377配位形成的钠盐复合物。这些配位氧原子来自缬沙坦和AHU377分子中12个羧基的氧、18个羰基以及15个水分子中的氧。这些氧原子与18个钠离子配位形成一个配位的网络结构，网络空隙间有2.5个水分子，分子间存在氢键联系，晶态下配位的网络结构以氢键作用力和范德华力维系其在空间的稳定排列。形成一个钠盐复合物的无限的三维网络结构。晶体各个组成部分之间的摩尔比为AHU-377∶缬沙坦∶钠离子∶水分子＝1∶1∶3∶2.9，即所述结晶型[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O结构简式中X得取值约为2.9。
更优选的，每个不对称单元均含有6个ARB、6个NEPi、18个钠原子及17.5个水分子，其结构如下：
Figure GPA0000221424930000102
更优选的，所述每个不对称单元中为16个配位水分子，2.5个网络空间水分子。
更优选的，所述超分子结构的单晶呈无色片状，单斜晶系，空间群为P21，晶胞参数：
Figure GPA0000221424930000103
α＝90°，β＝119.561(2)°，γ＝90°。
更优选的，所述超分子结构的单晶大小为0.42×0.36×0.18mm，晶胞体积
Figure GPA0000221424930000111
晶胞内分子数Z＝2，单位晶格的独立区域中有一个分子。
其单晶的具体培养方法：
1.称取约100mg实施例5得到的白色固体，至20-mL玻璃瓶中，加入5mL乙腈，超声将样品充分分散，再加入100uL H2O，60℃水浴加热，将样品溶解至清。
2.趁热将步骤1中得到的样品过滤至5个4-mL的玻璃瓶中，盖紧瓶盖。
将步骤2中得到的样品放置循环水槽进行程序降温实验(程序：60℃平衡1小时，用24小时降至20℃)得到上述单晶。其单晶衍射及解析如下：
1、单晶衍射：
用Rigaku Saturn70 CCD面探测仪收集衍射强度数据，MoKα辐射，人工多层膜聚焦镜，准直管φ＝0.30mm，晶体与CCD距离为45mm，管压50kV，管流16mA，在φ分别为0，90，180°时采用ω扫描，最大2θ角为56°，扫描范围为0-180°，回摆角度为0.5°，间隔为0.5°，扫描速度为10s/°，每个画面扫描一次，总计摄取1080幅图像，总衍射点为130648个，独立衍射点为68235个(Rint＝0.0479)，可观察点(F2≥2σF2)为53754个，数据完整度为98.9％。
2、单晶解析：
在微机上用直接法(sir-2011)解析晶体结构，从E图上获得全部非氢原子位置，使用最小二乘法修正结构参数和判别原子种类，使用几何计算法和差值Fourier法获得全部氢原子位置，最终可靠因子R1＝0.0651，wR2＝0.1447，S＝1.046，Flack因子为-0.01(10)。最终确定最小化学计量式为C288H365N36Na18O66.50，计算单个分子的分子量为5811.99，计算晶体密度为1.263Mg/m3
晶态下分子排列属P21空间群，分子的绝对构型可以通过Flack因子和已知手型有机分子的绝对构型确定。
Figure GPA0000221424930000112
3、解析结果：
结果表明：该化合物分子主要骨架是有机分子缬沙坦和AHU377，形成的Na盐，在不对称单元中有六个缬沙坦，六个AHU-377和18个Na离子，这18个Na离子分别和六个缬沙坦，六个AHU-377中羧基的氧，酰胺基的氧配位，形成一个配位的网络结构，网络空隙间由2.5个水，分子间存在氢键联系，晶态下配位的网络结构以氢键作用力和范德华力维系其在空间的稳定排列。晶体各个组成部分之间的摩尔比为AHU-377∶缬沙坦∶钠离子∶水分子＝1∶1∶3∶3.1，即所述结晶型[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O结构简式中X得取值约为3.1。
本发明另一方面还提供一种结晶型[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O的制备方法，包括如下步骤：
(1)将(S)-N-戊酰基-N-{[2′-(1H-四唑-5-基)-联苯-4-基]-甲基}-缬氨酸和(2R，4S)-5-联苯-4-基-4-(3-羧基-丙酰基氨基)-2-甲基-戊酸乙酯溶于适当的有机溶剂；
(2)与碱性钠化合物相混合，加入方式可以直接加入或者将碱性钠化合物溶于适当的溶剂中加入；
(3)自然产生沉淀、降温、加入晶种诱导析晶或通过创造过饱和条件来产生固体沉淀物；
(4)固液分离；
(5)控制干燥环境的湿度烘干步骤(4)分离得到的固体。
作为进一步优选的方案，步骤2)与碱性钠化合物相混合的方式可以在步骤1)体系中直接加入碱性钠化合物或者将碱性钠化合物溶于适当的溶剂中然后再加入步骤1)体系中。
作为进一步优选的方案，步骤(1)中所述有机溶剂包括但不限定于以下溶剂：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、乙腈、丙酮、甲乙酮、四氢呋喃、二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、醋酸异丙酯、乙酸乙酯或其混合物。
作为进一步优选的方案，步骤(2)中所述碱性钠化合物选自氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠、甲醇钠、甲酸钠、丙酸钠、丙烯酸钠、苯甲酸钠或其混合物；优选氢氧化钠、碳酸氢钠或其混合物。
作为进一步优选的方案，步骤(3)中所述的创造过饱和条件的方法包括降温析晶、降温-超声耦合析晶、蒸发溶剂析晶、加入反溶剂逼晶或反溶剂替换等方式。反溶剂是指目标固体溶解度较低的溶剂。反溶剂替换方式是指，除去一部分原有溶剂，加入一部分反溶剂，平衡后再除去一部分原有溶剂，直至基本上更换为反溶剂。
作为进一步优选的方案，步骤5)的干燥环境的湿度控制在45％～70％；优选干燥环境的湿度控制在50％～65％；更优选干燥环境的湿度控制在55％～65％。
作为进一步优选的方案，步骤(5)中所述的烘干方法可以采用真空干燥、蒸发、氮气干燥等。
作为更进一步优选的方案，任选的，步骤(5)中得到的固体中水含量为4.6～11.6％，优选4.6～6.6％。
本发明另一方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效剂量的前述结晶型[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O以及药学上可接受的载体或赋形剂。
作为更进一步优选的方案，所述的X选自2.5、3、6.5；最优选3。
本发明的另一方面提供了前述结晶型[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O或前述其药物组合物在制备治疗或预防与中性内肽酶有关的疾病、心血管、抗高血压的药物中的用途。
通过改善功效和具有更高的相应率而产生了更有效的抗高血压治疗，不论是对于恶性高血压、原发性高血压、肾血管性高血压、糖尿病性高血压、单纯收缩期高血压还是对于其它继发性高血压而言都是如此。
本发明的另一方面提供了前述结晶型[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O或前述其药物组合物在制备治疗或预防急慢性心衰如、充血性心衰、左心室机能障碍、肥厚性心肌病、糖尿病性心肌病、室上性和室性心律不齐、心房纤维颤动、心房扑动或有害的血管重构药物中的用途。
本发明的在一方面提供前述结晶型[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O或前述其药物组合物在制备治疗或预防心肌梗塞及其后遗症、动脉粥样硬化、心绞痛、糖尿病性或非糖尿病性肾机能不全、继发性醛固酮增多症、原发性或继发性肺高血压、糖尿病性肾病、肾小球肾炎、硬皮病、肾小球硬化、原发性肾病的蛋白尿、肾血管高血压、糖尿病性视网膜病、偏头痛、外周血管病、雷诺氏病、腔的增生、认知机能障碍、青光眼或中风药物中的用途。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/药学上可接受的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以或其他组分例如生理学/药学上可接受的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明制备得到的结晶型[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O的新晶型X取值为2.5、2.9、3.0、3.1的水合物，较之前公开的2.5水合物，具有更高的配位水分子，实验结果显示具有更好的抗吸湿性，从而明显改善了药物的理化性质，有利于药物的应用与开发。大大降低了该药物制剂、化学稳定性、包装与存储等方面的风险。
附图说明
图1为实施例1中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·2.5H2O粉末X射线衍射图；纵坐标为强度，横坐标为2θ(°)。
图2为实施例1中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·2.5H2O粉末热重分析(TGA)图；纵坐标为重量变化百分比(％)，横坐标为温度(℃)。
图3为实施例4中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·6.5H2O粉末X射线衍射图；纵坐标为强度，横坐标为2θ(°)。
图4为实施例4中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·6.5H2O粉末热重分析(TGA)图；纵坐标为重量变化百分比(％)，横坐标为温度(℃)。
图5为实施例5中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·3.1H2O粉末X射线衍射图；纵坐标为强度，横坐标为2θ(°)。
图6为实施例5中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·3.1H2O粉末热重分析(TGA)图；纵坐标为重量变化百分比(％)，横坐标为温度(℃)。
图7为实施例2中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·2.5H2O粉末X射线衍射图；纵坐标为强度，横坐标为2θ(°)。
图8为实施例2中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·2.5H2O粉末热重分析(TGA)图；纵坐标为重量变化百分比(％)，横坐标为温度(℃)。
图9为实施例7中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·3H2O粉末X射线衍射图；纵坐标为强度，横坐标为2θ(°)。
图10为实施例7中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·3H2O粉末热重分析(TGA)图；纵坐标为重量变化百分比(％)，横坐标为温度(℃)。
图11为实施例3中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·2.5H2O粉末X射线衍射图；纵坐标为强度，横坐标为2θ(°)。
图12为实施例3中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·2.5H2O粉末热重分析(TGA)图；纵坐标为重量变化百分比(％)，横坐标为温度(℃)。
图13为实施例8中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·2.9H2O粉末X射线衍射图；纵坐标为强度，横坐标为2θ(°)。
图14为实施例8中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·2.9H2O粉末热重分析(TGA)图；纵坐标为重量变化百分比(％)，横坐标为温度(℃)。
图15为实施例5中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]6Na18·18.5H2O超分子络合物的晶胞(cell)图示，它包括两个不对称单元。
图16为实施例5中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]6Na18·18.5H2O超分子络合物单晶的热重分析(TGA)图；纵坐标为重量变化百分比(％)，横坐标为温度(℃)。
图17为实施例6中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]6Na1818.5H2O粉末X射线衍射图；纵坐标为强度，横坐标为2θ(°)。
图18为实施例6中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]6Na18·18.5H2O粉末热重分析(TGA)图；纵坐标为重量变化百分比(％)，横坐标为温度(℃)。
图19为实施例8中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]6Na18·17.5H2O超分子络合物的晶胞(cell)图示，它包括两个不对称单元。
图20为实施例8中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]6Na18·17.5H2O超分子络合物单晶的热重分析(TGA)图；纵坐标为重量变化百分比(％)，横坐标为温度(℃)。
图21为实施例9中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]6Na18·17.5H2O粉末X射线衍射图；纵坐标为强度，横坐标为2θ(°)。
图22为实施例9中[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]6Na18·17.5H2O粉末热重分析(TGA)图；纵坐标为重量变化百分比(％)，横坐标为温度(℃)。
图23模型诱导过程中动物体重的变化；纵坐标为动物体重(克)，横坐标为时间(周数)。
图24模型诱导过程中鼠尾动脉收缩压的变化；纵坐标为动物收缩压(毫米汞柱)，横坐标为时间(周数)。
图25模型诱导过程中鼠尾动脉舒张压的变化；纵坐标为动物舒张压(毫米汞柱)，横坐标为时间(周数)。
图26模型诱导过程中鼠尾动脉平均压的变化；纵坐标为平均动脉压(毫米汞柱)，横坐标为时间(周数)。
图27药物A和药物B给药后鼠尾动脉收缩压的变化；纵坐标为动物收缩压(毫米汞柱)，横坐标为时间(周数)。
图28模药物A和药物B给药后鼠尾动脉舒张压的变化；纵坐标为动物舒张压(毫米汞柱)，横坐标为时间(周数)。
图29药物A和药物B给药后鼠尾动脉平均压的变化；纵坐标为平均动脉压(毫米汞柱)，横坐标为时间(周数)。
图30药物C和药物D给药期间动物心率的变化。
图31药物C和药物D给药期间动物收缩压的变化。
图32药物C和药物D给药期间动物舒张压的变化。
图33药物C和药物D给药期间动物平均动脉压的变化。
具体实施方式
以下提供的具体实施例以及制备方法例将进一步举例说明本发明实施方案的特定方面。下列实施例的范围将不以任何方式限制本发明的范围。
方法和材料
结晶型[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O由它们的X射线粉末衍射图表征。因此，在具有使用Cu Kα辐射
Figure GPA0000221424930000161
以反射方式操作的GADDS(一般面积衍射检测器***)CS的Bruker D8Discover X射线粉末衍射仪上采集所述盐的X射线粉末衍射图。管电压和电流量分别设置为40kV和40mA采集扫描。在3.0°至40°的2θ范围内扫描样品60秒的时期。针对2θ表示的峰位置，使用刚玉标准品校准衍射仪。在通常是20℃-30℃的室温下实施所有分析。使用用于4.1.14T版WNT软件的GADDS，采集和积分数据。使用2003年发行的具有9.0.0.2版Eva的DiffracPlus软件，分析衍射图。XRPD样品的制备，通过是将样品至于单晶硅片上，用玻璃片或等效物压样品粉末以确保样品的表面平坦并有适当的高度。然后将样品支架放入Bruker XRPD仪器，并使用上文描述的仪器参数采集粉末X射线衍射图。由包括以下的多种因素产生与这类X射线粉末衍射分析结果相关的测量差异：(a)样品制备物(例如样品高度)中的误差，(b)仪器误差，(c)校准差异，(d)操作人员误差(包括在测定峰位置时出现的那些误差)，和(e)物质的性质(例如优选的定向误差)。校准误差和样品高度误差经常导致所有峰在相同方向中的位移。一般地说，这个校准因子将使测量的峰位置与预期的峰位置一致并且可以在预期的2θ值±0.2°的范围中。
所得到的[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]三钠水合物晶型用热重分析仪(TGA)进行热分析，所用TGA仪器型号为TA Q500(Thermo Analysis)。TGA分析方法参数如下：温度范围为室温至300摄氏度，扫描速率为10摄氏度每分钟，保护气体为氮气(流速25毫升/分钟)。
所得到的[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O晶型水分含量用卡尔费休库伦水分分析仪进行分析，所用水分分析仪器型号为C20(梅特勒)。操作方法：首先通过开始分析对话框中的开始进行预滴定，待持续测定的漂移值降低至规定值以下，进入样品测定模式。点击按键开始测试样品，从样品中快速取出约20-100mg样品，置于滴定杯中。按下确认键，分析自动开始。被测样品的总重包括皮重已经预先称量得到，再次测量加样后样品的质量包括皮重。总重量减去加样后的重量即为水分测定样品的实际加入量。滴定结束后显示结果对话框，将实际加入量输入，自动得到含水量的结果。
实施例1
称取200mg AHU-377游离酸(油状)，212mg缬沙坦和58.3 mg氢氧化钠置于20-mL玻璃瓶中，然后加入10mL醋酸异丙酯，密闭。将该混合物置于0℃的超声波水域中，功率100W，35KHz，反应4小时，得到含白色固体混悬液。将混悬液离心(8000转/分钟)10十分钟，弃去上清液，氮气吹扫干燥剩余固体4小时，氮气流量约5毫升/分钟，得到粉末状固体。其粉末X射线衍射图(XRPD)如图1所示。TGA分析图见图2。TGA图上的失重是由于晶体内水分失水造成的，可以用于精确的晶体中的水分含量测定。此外，用KF水分法测定晶体内水分含量做参照。所得结果，见下表：
Figure GPA0000221424930000181
根据水分测定结果可知，所得水合物为2.5水合物。
实施例2
称取151.2mg AHU-377游离酸(油状)，160mg缬沙坦置于50-mL茄形瓶中，加入15.3mL丙酮，再加入2.8mL 15.8mg/mL NaOH，旋转蒸发至干燥，再加入8mL丙酮，室温磁力搅拌24小时，得到含白色固体混悬液。将混悬液离心(8000转/分钟)10十分钟，弃去上清液，氮气吹扫干燥剩余固体4小时，氮气流量约5毫升/分钟，得到粉末状固体。其粉末X射线衍射图(XRPD)如图7所示。TGA分析图见图8。TGA图上的失重是由于晶体内水分失水造成的，可以用于精确的晶体中的水分含量测定。此外，用KF水分法测定晶体内水分含量做参照。所得结果，见下表：
Figure GPA0000221424930000182
根据水分测定结果可知，所得水合物为2.5水合物。
实施例3
称取151.2mg AHU-377游离酸(油状)，160mg缬沙坦置于50-mL茄形瓶中，加入15.3mL丙酮，再加入2.8mL 15.8mg/mL NaOH，旋转蒸发至干燥，再加入8mL乙腈，室温磁力搅拌24小时，得到含白色固体混悬液。将混悬液离心(8000转/分钟)十分钟，弃去上清液，氮气吹扫干燥剩余固体4小时，氮气流量约5毫升/分钟，得到粉末状固体。其粉末X射线衍射图(XRPD)如图11所示。TGA分析图见图12。TGA图上的失重是由于晶体内水分失水造成的，可以用于精确的晶体中的水分含量测定。此外，用KF水分法测定晶体内水分含量做参照。所得结果，见下表：
Figure GPA0000221424930000183
根据水分测定结果可知，所得水合物为2.5水合物。
实施例4
称取200mg AHU-377游离酸(油状)，212mg缬沙坦和58.3mg氢氧化钠置于20-mL玻璃瓶中，然后加入10mL乙酸乙酯，密闭。将该混合物置于0℃的超声波水域中，功率100W，35KHz，反应4小时，得到含白色固体混悬液。将混悬液离心(8000转/分钟)十分钟，弃去上清液，氮气吹扫干燥剩余固体4小时，氮气流量约5毫升/分钟，得到粉末状固体。其粉末X射线衍射图(XRPD)如图3所示。TGA分析图见图4。TGA图上的失重是由于晶体内水分失水造成的，可以用于精确的晶体中的水分含量测定。此外，用KF水分法测定晶体内水分含量做参照。所得结果，见下表：
Figure GPA0000221424930000191
根据水分测定结果可知，所得水合物为6.5水合物。
实施例5
称取200mg AHU-377游离酸(油状)，212mg缬沙坦和58.3mg氢氧化钠置于20-mL玻璃瓶中，然后加入10mL丙酮，密闭。将该混合物置于0℃的超声波水域中，功率100W，35KHz，反应4小时，得到含白色固体混悬液。将混悬液离心(8000转/分钟)，十分钟，弃去上清液，氮气吹扫干燥剩余固体4小时，氮气流量约5毫升/分钟，得到粉末状固体。其粉末X射线衍射图(XRPD)如图5所示。TGA分析图见图6。TGA图上的失重是由于晶体内水分失水造成的，可以用于精确的晶体中的水分含量测定。此外，用KF水分法测定晶体内水分含量做参照。所得结果，见下表：
Figure GPA0000221424930000192
根据水分测定结果可知，所得水合物为3.1水合物。
其对应单晶的具体培养方法：
1.称取约100mg实施例5得到的白色固体，至20-mL玻璃瓶中，加入5mL乙腈，超声将样品充分分散，再加入100uL H2O，60℃水浴加热，将样品溶解至清。
2.趁热将步骤1中得到的样品过滤至5个4-mL的玻璃瓶中，盖紧瓶盖。
3.将步骤2中得到的样品放置循环水槽进行程序降温实验(程序：60℃平衡1小时，用24小时降至20℃)得到上述单晶。
其超分子络合物的晶胞(cell)图15示，它包括两个不对称单元，其单晶衍射及解析如下：
单晶晶体呈无色片状，衍射分析所用晶体大小为0.42×0.36×0.18mm，属于单斜晶系，空间群为P21，晶胞参数：
Figure GPA0000221424930000193
Figure GPA0000221424930000194
α＝90°，β＝119.561(2)°，γ＝90°，晶胞体积
Figure GPA0000221424930000195
Figure GPA0000221424930000196
晶胞内分子数Z＝2，单位晶格的独立区域中有一个分子。
用Rigaku Saturn70 CCD面探测仪收集衍射强度数据，MoKα辐射，人工多层膜聚焦镜，准直管φ＝0.30mm，晶体与CCD距离为45mm，管压50kV，管流16mA，在φ分别为0，90，180°时采用ω扫描，最大2θ角为56°，扫描范围为0-180°，回摆角度为0.5°，间隔为0.5°，扫描速度为10s/°，每个画面扫描一次，总计摄取1080幅图像，总衍射点为130648个，独立衍射点为68235个(Rint＝0.0479)，可观察点(F2≥2σF2)为53754个，数据完整度为98.9％。
在微机上用直接法(sir-2011)解析晶体结构，从E图上获得全部非氢原子位置，使用最小二乘法修正结构参数和判别原子种类，使用几何计算法和差值Fourier法获得全部氢原子位置，最终可靠因子R1＝0.0651，wR2＝0.1447，S＝1.046，Flack因子为-0.01(10)。最终确定最小化学计量式为C288H367N36Na18O66.50.计算单个分子的分子量为5810.93，计算晶体密度为1.263Mg/m3，化学名称为：[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]6Na18·18.5H2O；化学简式为：[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·3.1H2O
晶态下分子排列属P21空间群，分子的绝对构型可以通过Flack因子和已知手性有机分子的绝对构型确定。
Figure GPA0000221424930000201
单晶解析结果表明：该化合物分子主要骨架是有机分子缬沙坦和AHU377，形成的Na盐，在不对称单元中有六个缬沙坦，六个AHU377和18个Na离子，这18个Na离子分别和六个缬沙坦，六个AHU377中羧基的氧，酰胺基的氧配位，形成一个配位的网络结构，网络空隙间由2.5个水，分子间存在氢键联系，晶态下配位的网络结构以氢键作用力和范德华力维系其在空间的稳定排列。
实施例5所得粉晶粉末XRPD测定值与单晶计算值比较如下表所示：
Figure GPA0000221424930000202
Figure GPA0000221424930000211
从上述数据对比来看，实施例5中所得产品粉末晶体衍射图与单晶计算值高度一致。粉末晶体衍射图中，有少量的峰缺失，这是粉末晶体的择优取向造成的。这一现象对于片状晶体来说尤为明显。但通过现有峰位置对比，显示粉末晶体的晶型与单晶计算晶型图的高度一致性。从而证明单晶结构与粉末晶体结构一致。
所得单晶TGA分析图见图16。TGA图上的失重是由于晶体内水分失水造成的，可以用于精确的晶体中的水分含量测定。此外，用KF水分法测定晶体内水分含量做参照。所得结果，见下表：
Figure GPA0000221424930000221
根据TGA和KF测量值可知，所得单晶为3.1水合物，与单晶解析的结果一致。
实施例6
精密称取284g AHU377，300g缬沙坦于50L玻璃反应釜中，加入29L乙腈，机械搅拌溶解化合物得到澄清溶液。精密称取NaOH 82.8g于240mL水溶解。将该NaOH水溶液缓慢加入到玻璃反应釜内，并用机械搅拌快速搅拌。当NaOH水溶液滴加完毕，约4小时，继续搅拌30min后，加入实施例5中得到的2.9水合物的单晶约50mg。继续搅拌直至晶体析出，搅拌过夜后，离心过滤得到白色晶体。所得白色固体在50摄氏度下真空干燥过夜后，置于55％相对湿度下，平衡72小时，得到产品。
其粉末X射线衍射图(XRPD)如图17所示。实施例6所得粉晶粉末XRPD测定值与单晶计算值比较如下表所示：
Figure GPA0000221424930000222
Figure GPA0000221424930000231
从上述实验数据对比来看，实施例6中所得产品粉末晶体衍射图与实施例5单晶计算值也高度一致，显示晶型的高度一致性。实施例6也与实施例5中粉末晶体测量值也一致。
TGA分析图见图18。TGA图上的失重是由于晶体内水分失水造成的，可以用于精确的晶体中的水分含量测定。此外，用KF水分法测定晶体内水分含量做参照。所得结果，见下表：
Figure GPA0000221424930000232
实施例7
称取151.2mg AHU-377游离酸(油状)，160mg缬沙坦置于50-mL茄形瓶中，加入15.3mL丙酮，再加入2.8mL 15.8mg/mL NaOH，旋转蒸发至干燥，再加入8mL乙酸乙酯，室温磁力搅拌24小时，得到含白色固体混悬液。将混悬液离心(8000转/分钟)十分钟，弃去上清液，氮气吹扫干燥剩余固体4小时，氮气流量约5毫升/分钟，得到粉末状固体。其粉末X射线衍射图(XRPD)如图9所示。TGA分析图见图10。TGA图上的失重是由于晶体内水分失水造成的，可以用于精确的晶体中的水分含量测定。此外，用KF水分法测定晶体内水分含量做参照。所得结果，见下表：
Figure GPA0000221424930000233
根据水分测定结果可知，所得水合物为3水合物。
实施例8
精密称取283.5mg AHU377，300mg缬沙坦于50-mL茄形瓶中，加入27mL丙酮，加入磁力搅拌子，溶解化合物得到澄清溶液。精密称取NaOH 82.8mg于2-mL HPLC小瓶中，加入240uL水溶解。将该NaOH溶液全部转移到丙酮溶液中，磁力搅拌。室温下继续磁力搅拌混悬液过夜。室温下，旋转蒸发去大约一半的丙酮溶剂，然后在加入15mL的醋酸异丙酯，继续旋转蒸发去一半体积，再加入15mL醋酸异丙酯，磁力搅拌过夜。氮气保护下抽滤，待滤液滤干后，加入约10mL醋酸异丙酯重新洗涤，氮气保护下抽滤，至干约2小时。
收集干燥滤饼，50℃真空干燥过夜。然后将干燥后的固体转移至60％±5％的湿度，室温下过夜，发生再水合过程，得到稳定的结晶型[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·2.9H2O。其粉末X射线衍射图(XRPD)如图13所示。TGA分析图见图14。TGA图上的失重是由于晶体内水分失水造成的，可以用于精确的晶体中的水分含量测定。此外，用KF水分法测定晶体内水分含量做参照。所得结果，见下表：
Figure GPA0000221424930000241
根据TGA和KF测量值可知，所得单晶为2.9水合物。
其对应单晶的具体培养方法：
实施例8中制备的510mg样品至20mL玻璃瓶中，加入17mL 98％丙酮/水，在65℃条件下将样品溶解，并平均趁热过滤至17个新的4mL玻璃瓶盖紧瓶盖，放置45℃条件下，恒温放置，得到上述单晶。其超分子络合物的晶胞(cell)图19示，它包括两个不对称单元，其单晶衍射及解析如下：
晶体呈无色片状，衍射分析所用晶体大小为0.36x 0.34x 0.10mm，属于单斜晶系，空间群为P21，晶胞参数：
Figure GPA0000221424930000242
Figure GPA0000221424930000243
α＝90°，β＝119.278(9)°，γ＝90°，晶胞体积
Figure GPA0000221424930000244
晶胞内分子数Z＝2，单位晶格的独立区域中有两个单元。
在Rigaku XtaLAB P200衍射仪上，-100℃时收集衍射强度数据，CuKα辐射，人工多层膜聚焦镜，准直管φ＝0.30mm，晶体与Pilatus200K探测器距离为35mm，管压40kV，管流30mA，ω扫描，最大2θ角为146.9°，扫描范围为0-180°，回摆角度为1°，间隔为1°，扫描速度为5-10s/°，每个画面扫描一次，总计摄取3579幅图像，总衍射点为251362个，独立衍射点为59848个(Rint＝0.0769)，可观察点(F2≥2σF2)为48100个，θ角到67.687°时数据完整度为99.3％。
在微机上用直接法(sir2011)解析晶体结构，从E图上获得全部非氢原子位置，使用最小二乘法(SHELXL-2014/7)修正结构参数和判别原子种类，使用几何计算法和差值Fourier法获得氢原子位置，最终可靠因子R1＝0.0700，wR2＝0.1691，S＝1.070，Flack因子为0.07(2)。最终确定最小化学计量式为C288H365N36Na18O65.50，计算单个分子的分子量为5792.93，计算晶体密度为1.240g/cm3。化学名称为：[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]6Na18·17.5H2O；化学简式为：[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·2.9H2O
Figure GPA0000221424930000251
单晶解析结果表明：AHU377-缬沙坦-钠单晶的不对称单元中包含6个缬沙坦、6个AHU377、18个钠离子和17.5个水分子。该晶体结构可以看成是由缬沙坦和AHU377配位形成的钠盐复合物。这些配位氧原子来自缬沙坦和AHU377分子中12个羧基的氧、18个羰基以及15个水分子中的氧。这些氧原子与18个钠离子配位形成一个配位的网络结构，网络空隙间有2.5个水分子，分子间存在氢键联系，晶态下配位的网络结构以氢键作用力和范德华力维系其在空间的稳定排列。形成一个钠盐复合物的无限的三维网络结构。晶体各个组成部分之间的摩尔比为AHU377∶缬沙坦∶钠离子∶水分子＝1∶1∶3∶2.9。
单晶中存在无序，18个钠中有一个钠无序，出现在两个位置，这两个位置钠的占有率分别为50％。同时，和无序钠配位的一个缬沙坦配体(除了该配体中联苯四氮唑部分)无序，占有率分别为50％。另外两个缬沙坦配体上脂肪族侧链无序，以及一个AHU377配体上联苯的一个苯环无序，2.5个结晶水当中的0.5个结晶水无序，位于三个位置。
实施例8所得粉晶粉末XRPD测定值与单晶计算值比较如下表所示：
Figure GPA0000221424930000252
Figure GPA0000221424930000261
从上述实验数据对比来看，实施例8中所得产品粉末晶体衍射图与其对应单晶计算值高度一致。粉末晶体衍射图中，有少量的峰缺失，这是粉末晶体的择优取向造成的。这一现象对于片状晶体来说尤为明显。但通过现有峰位置对比，显示粉末晶体的晶型与单晶计算晶型图的高度一致性。从而证明单晶结构与粉末晶体结构一致。
所得单晶TGA分析图见图20。TGA图上的失重是由于晶体内水分失水造成的，可以用于精确的晶体中的水分含量测定。此外，用KF水分法测定晶体内水分含量做参照。所得结果，见下表：
Figure GPA0000221424930000262
根据TGA和KF测量值可知，所得单晶为2.9水合物，与单晶解析结果一致。
实施例9
精密称取284g AHU377，300g缬沙坦于50L玻璃反应釜中，加入27L异丙醇，机械搅拌溶解化合物得到澄清溶液。精密称取NaOH 82.8g于240mL水溶解。将该NaOH水溶液缓慢加入到玻璃反应釜内，并用机械搅拌快速搅拌。当NaOH水溶液滴加完毕，约6小时，继续搅拌30min后，加入实施例8中得到的2.9水合物的单晶约50mg。继续搅拌直至晶体析出，搅拌过夜后，离心过滤得到白色晶体。
其粉末X射线衍射图(XRPD)如图21所示。实施例9所得粉晶粉末XRPD测定值与单晶计算值比较如下表所示：
Figure GPA0000221424930000271
从上述实验数据对比来看，实施例9中所得产品粉末晶体衍射图与实施8单晶计算值高度一致，显示晶型的高度一致性。实施例9也与实施例8中粉末晶体测量值也一致。
TGA分析图见图22。TGA图上的失重是由于晶体内水分失水造成的，可以用于精确的晶体中的水分含量测定。此外，用KF水分法测定晶体内水分含量做参照。所得结果，见下表：
Figure GPA0000221424930000281
根据TGA和KF测量值可知，所得单晶为2.9水合物。
实施例10
比较不同水合物的吸湿性。将[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O各种结晶放置在HPLC小瓶中，敞口放置在57％的湿度下(溴化钠饱和溶液)，观察吸湿情况及样品液化时间。
Figure GPA0000221424930000282
实施例11
[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O(药物A)与缬沙坦(药物B)组合治疗在肾动脉狭窄诱导的大鼠高血压模型的药效实验
1实验材料：
药物A：[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·3.1H2O按照实施例6制备获得。
药物B：缬沙坦为市售原料药。
2实验设备
动物体重秤：JJ500，G&G，Jiangsu，China
低温电热毯：Jwilch，China
手术显微镜：Luckbird XTS-4A
鼠尾血压测量仪：BP-2010 AUL.CN10120479
大鼠灌胃器：16#80mm直径，圆头
3实验方法
3.1单侧肾动脉缩窄诱导大鼠肾性高血压模型建立
雄性Sprague Dawley(SD)大鼠50只，体重180-200克，由北京维通利华公司(VitalRiver Laboratories，Beijing，China)提供。动物饲养于动物中心SPF级屏障***内，遵循国际标准温、湿、光控制***。本实验动物操作方案经由该平台动物中心IACUC委员会审批确认。
在KCI动物手术SOP指导原则下实施本实验所涉及到的一切手术。动物经戊巴比妥钠腹腔麻醉(50mg/kg)，确认动物进入麻醉状态后，左侧腹部备皮，严格手术消毒，左侧腹部肾区逐层切开一2.0cm长手术切口，进入腹腔。暴露左侧肾脏。小心分离左肾动脉，使其与肾静脉彻底分离。采用3-0手术缝合丝线实行左肾动脉缩窄术(实现左肾动脉60％狭窄)。术后确认没有腹腔内出血，用3-0手术缝合丝线缝合腹壁肌层组织，然后用2-0手术缝合丝线缝合皮肤。清洗皮肤创面后将动物置于37度电热毯保温至动物苏醒，确认能够自由采食和饮水后将动物返回饲养笼正常饲养。术后第一周内每天观察动物，确认无术后伤口感染以及裂开。自术后第一周起每周测试动物体重变化以及清醒状态下鼠尾动脉压和心率以监测动物血压和心率的变化。
3.2实验动物入组标准
动物连续4-5周测试鼠尾动脉压观察动物血压升高的趋势。选择收缩压超过160mmHg的动物入组进行药效学试验
3.3实验方案
药物A([3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·3.1H2O)、药物B(缬沙坦)分别进行单次口服给药实验，早9-10am开始给药，次日10：00AM试验结束。24小时内分别观察给药后2-4HR、6-8HR和24HR动物的血压的变化。组-1为给药组，组-2为空白对照组(只给药物载体)
Figure GPA0000221424930000291
3.4给药期间检测
给药后密切观测所有动物口服给药后的生理变化，主要为包括呕吐和腹泻。
4实验结果
4.1单侧肾动脉狭窄诱导高血压的模型建立
4.1.1动物体重变化
模型手术后连续4-5周每周测量一次动物体重。动物体重呈现逐渐增长趋势，至术后五周动物平均体重达到400克左右(见图23)。
4.1.2动物血压变化
造模后每周监测一次清醒状态下鼠尾动脉压。造模第一周起动物开始出现血压升高。连续4-5周的鼠尾动脉压监测显示动物血压自造模后3周起趋于维持在稳定升高的状态(图24-26)。
4.2.1给药期间动物基本生理观察
所有动物在给药期间并未出现异常生理变化，包括胃肠道反应诸如呕吐、腹泻、采食异常等，精神症状反应诸如精神萎靡、运动异常等。
4.2.2给药期间动物血压变化
药物A和B给药2-4小时后动物血压呈现轻度下降，包括收缩压、舒张压以及平均动脉压，6-8小时达到最佳降压效果；24小时呈现轻度回升(见图27-29)。药物A的降压效果优于药物B的降压效果。
实施例12
[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O与缬沙坦(药物D)组合治疗在肾动脉狭窄诱导的大鼠高血压模型的药效实验
1实验材料
药物C：[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·2.9H2O按照实施例9制备获得。
药物D：缬沙坦为市售原料药。
2实验设备
动物体重秤：JJ500，G&G，Jiangsu，China
低温电热毯：Jwilch，China
手术显微镜：Luckbird XTS-4A
鼠尾血压测量仪：BP-2010 AUL.CN10120479
大鼠灌胃器：16#80mm直径，圆头
3实验方法
3.1单侧肾动脉缩窄诱导大鼠肾性高血压模型建立
雄性Sprague Dawley(SD)大鼠50只，体重180-200克，由北京维通利华公司(VitalRiver Laboratories，Beijing，China)提供。动物饲养于动物中心SPF级屏障***内，遵循国际标准温、湿、光控制***。本实验动物操作方案经由该平台动物中心IACUC委员会审批确认。
在KCI动物手术SOP指导原则下实施本实验所涉及到的一切手术。动物经戊巴比妥钠腹腔麻醉(50mg/kg)，确认动物进入麻醉状态后，左侧腹部备皮，严格手术消毒，左侧腹部肾区逐层切开一2.0cm长手术切口，进入腹腔。暴露左侧肾脏。小心分离左肾动脉，使其与肾静脉彻底分离。采用3-0手术缝合丝线实行左肾动脉缩窄术(实现左肾动脉60％狭窄)。术后确认没有腹腔内出血，用3-0手术缝合丝线缝合腹壁肌层组织，然后用2-0手术缝合丝线缝合皮肤。清洗皮肤创面后将动物置于37度电热毯保温至动物苏醒，确认能够自由采食和饮水后将动物返回饲养笼正常饲养。术后第一周内每天观察动物，确认无术后伤口感染以及裂开。自术后第一周起每周测试动物体重变化以及清醒状态下鼠尾动脉压和心率以监测动物血压和心率的变化。
3.2实验动物入组标准
动物连续4-5周测试鼠尾动脉压观察动物血压升高的趋势。选择收缩压超过160mmHg的动物入组进行药效学试验
3.3实验方案
选取动物64只，SBP＞160mmHg；实验分为4组，假手术组(组-1)、高血压模型组(组-2)、对照组(药物D)(组-3)、给药组药物C(组-4)。口服给药每天一次，药物体积10mL/kg，持续给药一周，每三天进行一次称重，并检测动物给药之后6-8hr和24hr的血压变化。
Figure GPA0000221424930000311
4给药期间检测
动物每天早9-10am开始给药。给药之后密切观察动物给药之后的生理变化，主要为临床表征，如有异常现象要及时记录和分析；分别于给药后6-8hr(15：30-17：30P.M)和24hr(次日09：30-11：30)检测大鼠尾动脉血压和心率，实验持续一周。
5试验终了
试验最后一次数据采集终了后，按照KCI动物安乐死SOP对所有实验动物实行安乐死，并采集血浆(肝素抗凝剂)和组织：血样2份，每份1mL，肾脏(右肾)2份，肾上腺2份，心脏(心室两份、心房2份)，所有组织均液氮速冻，保存于-80度冰箱。
6实验结果
6.1单侧肾动脉狭窄诱导高血压的模型建立成功，与实施例11的4.1结果相同。
6.2给药期间动物基本生理观察
所有动物在连续一周的给药期间并未出现异常生理变化，包括胃肠道反应诸如呕吐、腹泻、采食异常等，精神症状反应诸如精神萎靡、运动异常等。
6.3给药期间动物心率变化
假手术组(组-1)连续一周的动物心率观察显示平均心率在330次/分到350次/分之间波动。高血压动物给药前平均心率在380次/分左右。模型组(组-2)和药物D组，动物心率在连续给药一周期间未表现出明显的加速或减慢。药物C组(组4)动物连续一周给药的动物心率显示平稳缓慢减缓，至给药3天后与假手术组动物心率一致。之后连续一周的给药动物心率呈现持续平稳的减缓(见图30)。
6.4给药期间动物血压变化
试验的假手术组(组-1)动物血压在连续一周的试验中维持在正常范围，包括收缩压，舒张压和平均动脉压。相对模型组(组-2)而言，药物D(组-3)的动物血压在连续一周的给药过程中呈现波动性缓慢下降表现为每次给药后6-8小时降压效果最为明显，24小时后轻度回升。药物C组(组-4)，动物血压在连续一周的给药试验中呈现一致性、波动性缓慢下降，表现为每次给药后6-8小时降压效果最为明显，24小时后轻度回升，包括收缩压，舒张压和平均动脉压(见图31-33)。
[3-((1S，3R)-1-联苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’-甲基-2’-(戊酰基{2”-(四唑-5-基)联苯-4’-基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O(药物C)具有减缓动物心率的功能，起效快，首次给药即减缓心率至假手术组动物的水平。连续一周的给药使得高血压动物的心率平稳在假手术组动物的平均心率水平。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制本发明，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (29)

1.结晶型[3-((1S，3R)-1- 联苯-4- 基甲基-3- 乙氧基羰基-1- 丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’- 甲基-2’-( 戊酰基{2”-( 四唑-5- 基) 联苯-4’- 基甲基} 氨基) 丁酸]Na3·XH2O，当X为3.1时，其粉末X射线衍射图包括位于:4.1±0.2 º，4.9±0.2 º，5.2±0.2 º，8.9±0.2 º， 9.6±0.2 º，12.5±0.2 º，14.5±0.2 º，15.2±0.2 º，16.0±0.2 º，16.9±0.2º，18.1±0.2 º，19.4±0.2 º，25.8±0.2 º，27.1±0.2 º和27.9±0.2 º的衍射角（2θ）处的峰；
当X为2.9时，其粉末X射线衍射图包括位于4.1±0.2 º，4.9±0.2 º，5.2±0.2 º，6.3±0.2 º，9.6±0.2 º，12.5±0.2 º，13.6±0.2 º，14.2±0.2 º，14.8±0.2 º，15.2±0.2º，16.9±0.2 º，17.6±0.2 º，18.1±0.2 º，18.7±0.2 º，19.4±0.2 º，23.3±0.2 º，24.6±0.2 º，27.1±0.2 º和29.2±0.2 º的衍射角（2θ）处的峰。
2.结晶型[3-((1S，3R)-1- 联苯-4- 基甲基-3- 乙氧基羰基-1- 丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’- 甲基-2’-( 戊酰基{2”-( 四唑-5- 基) 联苯-4’- 基甲基} 氨基) 丁酸]Na3·XH2O，其特征在于，其粉末X 射线衍射图与图9、图17、图21中显示的衍射角(2θ)处的峰基本上相同。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的结晶型[3-((1S，3R)-1- 联苯-4- 基甲基-3- 乙氧基羰基-1- 丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’- 甲基-2’-( 戊酰基{2”-( 四唑-5- 基) 联苯-4’- 基甲基} 氨基) 丁酸]Na3·X H2O，其特征在于，所述结晶型[3-((1S，3R)-1- 联苯-4-基甲基-3- 乙氧基羰基-1- 丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’- 甲基-2’-( 戊酰基{2”-( 四唑-5- 基) 联苯-4’- 基甲基} 氨基) 丁酸]Na3·X H2O是超分子结构的结构简式，其包含不对称单位，每个不对称单位均含有6个ARB、6个NEPi、18个钠原子及17.5、18.0或18.5个水分子，其中所述的ARB 为(S)-N- 戊酰基-N-{[2’-(1H- 四唑-5- 基)联苯-4- 基] 甲基}- 缬氨酸，所述的NEPi 为(2R，4S)-5- 联苯-4- 基-4-(3- 羧基- 丙酰基氨基)-2- 甲基- 戊酸乙基酯。
4.根据权利要求3所述的结晶型[3-((1S，3R)-1- 联苯-4- 基甲基-3- 乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’- 甲基-2’-( 戊酰基{2”-( 四唑-5- 基) 联苯-4’- 基甲基}氨基) 丁酸]Na3·X H2O，其特征在于，所述每个不对称单元含有17.5个水分子，其结构如下：
Figure 450833DEST_PATH_IMAGE001
。
5.根据权利要求4所述的结晶型[3-((1S，3R)-1- 联苯-4- 基甲基-3- 乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’- 甲基-2’-( 戊酰基{2”-( 四唑-5- 基) 联苯-4’- 基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O，其特征在于，所述每个不对称单元中包含15个配位水分子，2.5个网络空间水分子。
6.根据权利要求4所述的结晶型[3-((1S，3R)-1- 联苯-4- 基甲基-3- 乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’- 甲基-2’-( 戊酰基{2”-( 四唑-5- 基) 联苯-4’- 基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O，其特征在于，所述超分子结构的单晶呈无色片状，单斜晶系，空间群为P21，晶胞参数：a= 20.567(8)Å, b= 42.166(13)Å, c= 20.503(7)Å, α= 90°, β=119.278(9)°, γ= 909°。
7.根据权利要求4所述的结晶型[3-((1S，3R)-1- 联苯-4- 基甲基-3- 乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’- 甲基-2’-( 戊酰基{2”-( 四唑-5- 基) 联苯-4’- 基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O，其特征在于，所述超分子结构的单晶大小为0.36 x 0.34 x 0.10mm，晶胞体积V= 15509(9)Å3，晶胞内单元数Z=2，单位晶格的独立区域中有两个单元。
8.根据权利要求5所述的结晶型[3-((1S，3R)-1- 联苯-4- 基甲基-3- 乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’- 甲基-2’-( 戊酰基{2”-( 四唑-5- 基) 联苯-4’- 基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O，其特征在于，所述每个不对称单元含有18.5个水分子，其结构如下：
Figure 305656DEST_PATH_IMAGE002
。
9.根据权利要求8所述的结晶型[3-((1S，3R)-1- 联苯-4- 基甲基-3- 乙氧基羰基-1-丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’- 甲基-2’-( 戊酰基{2”-( 四唑-5- 基) 联苯-4’- 基甲基}氨基)丁酸]Na3·X H2O，其特征在于，所述每个不对称单元中包含16个配位水分子，2.5个网络空间水分子。
10.根据权利要求8所述的结晶型[3-((1S，3R)-1- 联苯-4- 基甲基-3- 乙氧基羰基-1- 丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’- 甲基-2’-( 戊酰基{2”-( 四唑-5- 基) 联苯-4’- 基甲基} 氨基) 丁酸]Na3·X H2O，当X=3.1时，其特征在于，所述超分子结构的单晶呈无色片状，单斜晶系，空间群为P21，晶胞参数：a= 20.6864(10)Å, b= 41.7011(14)Å, c= 20.8069(10)Å, α= 90°, β= 119.561(2)°, γ= 90°。
11.根据权利要求8所述的结晶型[3-((1S，3R)-1- 联苯-4- 基甲基-3- 乙氧基羰基-1- 丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’- 甲基-2’-( 戊酰基{2”-( 四唑-5- 基) 联苯-4’- 基甲基} 氨基)丁酸]Na3·X H2O，当X=3.1时，其特征在于，所述超分子结构的单晶大小为0.42×0.36×0.18mm，晶胞体积V= 15612.6(12)Å3，晶胞内单元数Z=2，单位晶格的独立区域中有2个单元。
12.一种权利要求1-11中任一项所述的结晶型[3-((1S，3R)-1- 联苯-4- 基甲基-3-乙氧基羰基-1- 丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’- 甲基-2’-( 戊酰基{2”-( 四唑-5- 基) 联苯-4’- 基甲基} 氨基) 丁酸] Na3·X H2O的制备方法，包括如下步骤：
1) 将(S)-N- 戊酰基-N-{[2′-(1H- 四唑-5- 基)- 联苯-4- 基]- 甲基}- 缬氨酸和(2R，4S)-5- 联苯-4- 基-4-(3- 羧基- 丙酰基氨基)-2- 甲基- 戊酸乙酯溶于适当的有机溶剂；
2) 与碱性钠化合物相混合，加入方式可以直接加入或者将碱性钠化合物溶于适当的溶剂中加入；
3) 自然产生沉淀、加入晶种诱导析晶或通过创造过饱和条件来产生固体沉淀物；
4) 固液分离；
5) 控制干燥环境的湿度在45%～70%烘干步骤4）分离得到的固体；
所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、乙腈、丙酮、甲乙酮、四氢呋喃、二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、醋酸异丙酯、乙酸乙酯或其混合物。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，步骤5）的干燥环境的湿度控制在50%～65%。
14.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，步骤5）的干燥环境的湿度控制在55%～65%。
15.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，步骤2）与碱性钠化合物相混合的方式可以在步骤1）体系中直接加入碱性钠化合物或者将碱性钠化合物溶于适当的溶剂中然后再加入步骤1）体系中。
16.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中所述碱性钠化合物选自氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠、甲醇钠、甲酸钠、丙酸钠、丙烯酸钠、苯甲酸钠或其混合物。
17.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中所述碱性钠化合物选自氢氧化钠、碳酸氢钠或其混合物。
18.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，步骤3）中所述的创造过饱和条件的方法选自降温析晶、降温-超声耦合析晶、蒸发溶剂析晶、加入反溶剂逼晶或反溶剂替换方法。
19.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，步骤5）中所述的烘干方法选自真空干燥、蒸发、氮气干燥。
20.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，在步骤5）中控制湿度得到相应水合物后进一步充分暴露在特定湿度下进行水合得到目标水合度的水合物。
21.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，步骤5）中得到的固体中水含量为4.6～11.6%。
22.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，步骤5）中得到的固体中水含量为4.6～6.6%。
23.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含治疗有效剂量的根据权利要求1-11中任一项所述的结晶型[3-((1S，3R)-1- 联苯-4- 基甲基-3- 乙氧基羰基-1- 丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’- 甲基-2’-( 戊酰基{2”-( 四唑-5- 基) 联苯-4’- 基甲基} 氨基)丁酸]Na3·X H2O以及药学上可接受的载体或赋形剂。
24.根据权利要求23所述的药物组合物，其特征在于，所述的X选自2.9、3.1。
25.根据权利要求23所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含治疗有效剂量的权利要求3-11任一项所述的结晶型[3-((1S，3R)-1- 联苯-4- 基甲基-3- 乙氧基羰基-1- 丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’- 甲基-2’-( 戊酰基{2”-( 四唑-5- 基) 联苯-4’- 基甲基} 氨基) 丁酸] Na3·X H2O以及药学上可接受的载体或赋形剂。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的药物组合物在制备治疗或预防与中性内肽酶有关的疾病、心血管、抗高血压的药物中的应用。
27.根据权利要求26所述的应用，其特征在于，抗高血压选自抗恶性高血压、原发性高血压、肾血管性高血压、糖尿病性高血压、单纯收缩期高血压或其它继发性高血压。
28.根据权利要求23-25中任一项所述的药物组合物在制备治疗或预防急慢性心衰、左心室机能障碍、肥厚性心肌病、糖尿病性心肌病、室上性和室性心律不齐、心房纤维颤动、心房扑动药物中的应用。
29.根据权利要求1-11中任一项所述的结晶型[3-((1S，3R)-1- 联苯-4- 基甲基-3-乙氧基羰基-1- 丁基氨甲酰基)丙酸-(S)-3’- 甲基-2’-( 戊酰基{2”-( 四唑-5- 基) 联苯-4’- 基甲基} 氨基) 丁酸] Na3·X H2O或权利要求23-25中任一项所述的药物组合物在制备治疗或预防心肌梗塞及其后遗症、动脉粥样硬化、心绞痛、糖尿病性或非糖尿病性肾机能不全、继发性醛固酮增多症、原发性或继发性肺高血压、糖尿病性肾病、肾小球肾炎、硬皮病、肾小球硬化、原发性肾病的蛋白尿、肾血管高血压、糖尿病性视网膜病、偏头痛、外周血管病、雷诺氏病、腔的增生、认知机能障碍、青光眼或中风药物中的应用。
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