CN106387488B - 一种膨化鲤鱼饲料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种膨化鲤鱼饲料，含有如下重量份的组分：鱼粉5‑10份、去皮豆粕20‑40份、菜粕10‑30份、面粉15‑20份、米糠10‑15份、豆油1‑4份、膨润土1‑3份、磷酸二氢钙1‑3份、氯化胆碱0.1‑0.5份、复合维生素0.1‑0.5份、复合微量元素0.1‑0.5份、粉状微生态制剂0.1‑0.5份和液体微生态制剂0.5‑2份。本发明的膨化鲤鱼饲料含有的微生态制剂能净化水体，降低水体的氨氮和亚硝酸盐含量，能补充鲤鱼内源消化酶的不足，提高饲料转化效率，增强鲤鱼抗病能力，提高成活率。本发明制备的添加粉状和液体微生态制剂的膨化鲤鱼饲料，与对照组饲料相比，增长率增加8％以上，饵料系数显著降低，促生长效果明显。

Description

一种膨化鲤鱼饲料及其制备方法
技术领域
本发明涉及属于饲料领域，具体涉及一种膨化鲤鱼饲料及其制备方法。
背景技术
微生态制剂是在微生态理论指导下，人工分离正常菌群，并通过特殊工艺制成的生物制剂，它具有补充、调整和维持动物肠道微生态平衡的功能。从而达到防治疾病、促进健康及提高生产性能的效果。它是一种绿色、环保、纯生物制剂，无毒、无副作用，无残留污染，不产生抗性，对水体不产生二次污染，因此近年来受到了广泛的关注。以前的研究报道多见于普通颗粒饲料的添加，而在膨化饲料中添加微生态制剂的报道还没有。主要是膨化制粒工艺需要经过膨化腔的高温高压过程，一般的微生态菌种存活率太低，起不到有效作用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种膨化鲤鱼饲料。
一种膨化鲤鱼饲料，含有如下重量份的组分：鱼粉5-10份、去皮豆粕20-40份、菜粕10-30份、面粉15-20份、米糠10-15份、豆油1-4份、膨润土1-3份、磷酸二氢钙1-3份、氯化胆碱0.1-0.5份、复合维生素0.1-0.5份、复合微量元素0.1-0.5份、粉状微生态制剂0.1-0.5份和液体微生态制剂0.5-2份。
在本发明优选的实施方案中，所述的膨化鲤鱼饲料含有如下重量份的组分：鱼粉9份、去皮豆粕30份、菜粕20份、面粉18份、米糠11份、豆油2份、膨润土2.1份、磷酸二氢钙2份、氯化胆碱0.3份、复合维生素0.3份、复合微量元素0.3份、粉状微生态制剂0.1-0.2份和液体微生态制剂1-1.5份。
其中，所述的粉状微生态制剂中的活菌数优选为80-120亿cfu/g。
其中，所述的粉状微生态制剂含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。本领域技术人员可知，粉状微生态制剂还可以含有本领域常规的保护剂、辅料、赋形剂等中的一种或多种。
其中，所述的枯草芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌CGMCC No.9356，所述地衣芽孢杆菌优选为地衣芽孢杆菌CGMCC No.7030，所述的短小芽孢杆菌优选为短小芽孢杆菌CGMCCNo.4756。
其中，所述的液体微生态制剂中的活菌数优选为10-20亿cfu/ml。
其中，所述的液体微生态制剂含有屎肠球菌(Enterococcus faecium)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)。本领域技术人员应当知晓，液体微生态制剂还可含有其它辅料，如培养基成分、发酵次生代谢物等。
其中，所述的屎肠球菌优选为屎肠球菌CGMCC No.9134，所述的约氏乳杆菌优选为约氏乳杆菌CGMCC No.4926。
本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为申请人从鸭肠道中分离得到。其营养细胞杆状，其芽孢为椭圆或长筒形，产生中生的椭圆形芽孢，孢囊膨大。革兰氏染色为阳性。在牛肉膏蛋白胨培养基上形成白色，不透明，不规则菌落，边缘毛发状，无褶皱。接触酶阳性，能利用丙酸盐。能产生多种活性酶，如蛋白酶、纤维素酶等，提高饲料利用率，增强动物消化酶的活性，促进养殖动物的生长。本发明的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)申请人已于2012年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.7030。
本发明的地衣芽孢杆菌CGMCC No.7030,能够通过发酵产生高活性的纤维素酶与蛋白酶，添加进动物饲料中可以增加饲料中蛋白质、纤维素和半纤维素等成分的分解，提高饲料营养成分利用率。
本发明所用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)H8-1，其显著区别于现有的枯草芽孢杆菌，为申请人从福建虾高位池池水中分离得到，其生物学特征如下：菌落表面光滑，半透明，呈污白色，菌落圆形，边缘成锯齿状；菌落形态为杆状，大小为0.8～1.2×1.5～4.0um，芽孢形态为椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
本发明中的枯草芽孢杆菌H8-1对浓度为2.5mg/L的氨氮、亚硝态氮降解率分别为81.72％、99.70％，能有效降解水体的氨氮和/或亚硝态氮水平。与现有的枯草芽孢杆菌区别于可以在0‰、3‰、15‰盐浓度条件下均生长良好，可以耐受10-15℃低温生长良好。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)H8-1已于2014年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.9356。
本发明中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)H8-1为养殖水体改良微生态制剂提供了种源，以无污染和无残留的方式降低水中有害物质如氨氮和亚硝态氮，提高养殖品质，提高养殖经济效益，具有推广价值。本发明中的枯草芽孢杆菌H8-1对浓度为2.5mg/L的氨氮、亚硝态氮降解率分别为81.72％、99.70％。
本发明屎肠球菌分离自猪肠道，并经过紫外诱变筛选获得。
屎肠球菌(Enterococcus faecium)CGMCC No.9134的特征为：
(1)屎肠球菌(Enterococcus faecium)CGMCC No.9134菌液80℃处理5min，存活率为0.18％，相对出发菌株提高22倍。
(2)屎肠球菌(Enterococcus faecium)CGMCC No.9134菌液用0.3％的猪胆盐处理3h，存活率为20.80％，相对出发菌株提高3.04倍。
(3)屎肠球菌(Enterococcus faecium)CGMCC No.9134菌液用0.6％的猪胆盐处理3h，存活率为21.6％，相对出发菌株提高27.69倍。
将本发明的屎肠球菌新菌株于2014年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，登记号：CGMCC No.9134。本发明的屎肠球菌新菌株经过10次以上的传代培养不退化，具有遗传稳定性，且抗逆性远远比出发菌株提高很多。
本发明的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)，是通过体外耐酸和耐胆盐筛选得到的一株均有潜在益生功能的约氏乳杆菌，命名为约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)YS-12，并于2011年6月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心进行了保藏，保藏号为CGMCC No.4926。
本发明的膨化鲤鱼饲料含有的微生态制剂能净化水体，降低水体的氨氮和亚硝酸盐含量，能补充鲤鱼内源消化酶的不足，提高饲料转化效率，增强鲤鱼抗病能力，提高成活率。本发明制备的添加粉状和液体微生态制剂的膨化鲤鱼饲料，与对照组饲料相比，增长率增加8％以上，饵料系数显著降低，促生长效果明显。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CGMCC No.4756菌粉制备
短小芽孢杆菌CGMCC No.4756(公开于CN201110140925.2)种子液的制备：将保藏菌种接种至装有100ml MNB培养基的锥形瓶中，30℃恒温摇床中培养16h，摇床转速为225rpm；将制备好的枯草芽孢杆菌种子液按照1％的接种量接种至装有100mL MNB培养基的锥形瓶中，30℃恒温摇床中培养16h，摇床转速为225rpm；
所述的MNB培养基配方如下：葡萄糖，5.0g/L；蛋白胨，5.0g/L；牛肉膏，3.0g/L；酵母浸粉，1.0g/L；七水硫酸镁，0.5g/L；硫酸锰，0.005g/L；pH 7.0±0.2；
通过发酵液的离心、浓缩、加入冻干保护剂、真空冷冻干燥及菌粉活菌数检验等生产程序，最终制备出粉状活菌制剂。
实施例2地衣芽孢杆菌CGMCC No.7030发酵液酶活的测定
将供试菌接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，30℃培养24h后挑取菌种，悬于0.85％生理盐水中，血球计数板计数调节浓度约5.0×107个/mL在装有20mL产酶培养基的100mL三角瓶内接入菌悬液2mL，自然补给氧30℃，170r/min条件下发酵培养24h,液体发酵液在5000r/min条件下离心分离15min,取上清液，即为粗酶液。
纤维素酶产酶培养基配方为：蛋白胨0.9％，酵母膏1.0％，CMC-Na0.5％,pH 8.0.
蛋白酶产酶培养基配方为：蛋白胨1.0％,酵母膏0.5％,葡萄糖1.0％,可溶性淀粉0.5％,KH2PO40.2％,MgSO4·7H2O 0.05％,CaCl2·2H2O 0.02％,pH 7.2。
(1)纤维素酶活力测定
纤维素酶活力测定：按照国标NY/T 912-2004绘制标准曲线，采用DNS法测定发酵液中的纤维素酶活性。以1mL含1％(w/v)CMC-Na的pH 8.0磷酸缓冲液为底物，加入0.2mL粗酶液，50℃保温30min，然后加入2.5mL DNS试剂，沸水浴5min，冷却至室温后定容至5.0mL，利用分光光度计测定波长540nm处的吸光度；以煮沸灭活粗酶液加入上述底物反应液作为空白对照，以底物溶液作为阴性对照；将1mL酶液每分钟产生1g葡萄糖量定义为1个酶活力单位，U/mL。
经测定，地衣芽孢杆菌CGMCC 7030的发酵粗酶液的纤维素酶活为：230.5U/mL。
(2)蛋白酶活力测定
蛋白酶活力的测定：采用国标SB/T 10317-1999蛋白酶活力测定法中的福林法绘制标准曲线。样品测定：取15×100mm试管3支，编号1,2,3，每管内加入粗酶液1mL，置于40℃水浴中预热2min，再各加入经同样预热的2％酪蛋白溶液(pH 7.2)1mL,精确保温l0min，时间到后，立即再各加入0.4mol三氯乙酸2m L，以终止反应,继续置于水浴中保温20min,使残余蛋白质沉淀后离心或过滤，然后另取15×150mm试管3支，编号l，2，3，每管内加入滤液1mL，再加0.4mol碳酸钠5mL，已稀释的福林试剂1mL摇匀，40℃保温发色20min后在540nm下测定OD值。空白试验也取试管3支，编号(1)，(2)，(3)，测定方法同上，唯在加2％酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入2％酪蛋白。
蛋白酶活力单位定义为：1mL酶液在40℃，pH 7的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位，以(U/ml)表示。
福林试剂(Folin试剂)的配制方法:于200mL磨口回流装置内，加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL，85％磷酸50mL,浓盐酸100mL，文火回流10h。取去冷凝器，加入硫酸锂(Li2SO4)50g，蒸馏水50mL,混匀，加人几滴液体溴，再煮沸15min，以驱逐残溴除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需要再加几滴澳液，再煮沸除去之。冷却后，定容至1000mL,用细菌滤器(2.2μm)过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。
经测定，每毫升地衣芽孢杆菌CGMCC 7030发酵粗酶液的蛋白酶活力为1500U/mL。
产酶试验表明，本发明的地衣芽孢杆菌CGMCC No.7030,能够通过发酵产生高活性的纤维素酶与蛋白酶，添加进动物饲料中可以增加饲料中蛋白质、纤维素和半纤维素等成分的分解，提高饲料营养成分利用率，同时降低动物粪便中营养物质的含量，减轻对环境的污染，具有很高的饲用价值。
实施例3地衣芽孢杆菌CGMCC No.7030冻干粉的制备
地衣芽孢杆菌菌粉的制备方法，包括如下的步骤
(1)平板培养复壮：将地衣芽孢杆菌菌种接种于平板培养基上，于30℃培养18h，使地衣芽孢杆菌复壮，并形成单菌落，挑取单菌落于接种平板培养基上，30℃培养24h；
所述平板培养基配方为：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，琼脂2％，pH7.0±0.2。
(2)一级种子液的制备：将步骤(1)培养的地衣芽孢杆菌菌种转接至装有10mL培养基的试管中，30℃摇床培养16h，转速为170rpm,使处于对数后期，得一级种子液；
(3)二级种子液的制备：将步骤(2)制备的一级种子液按1％接种量接种于装有75ml培养基的容量为250ml的锥形瓶中，30℃恒温摇床培养16h，转速为170rpm,得二级种子液；
种子培养基配方为：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，pH 7.0±0.2。
(4)地衣芽孢杆菌发酵液的制备：将步骤(3)中的种子液按接种量为1％接种到100L的发酵罐中，装样量20％，温度30℃，转速250rpm好氧培养至芽孢生成率80％以上，活菌数为1010CFU/ml以上,则放罐终止发酵，得地衣芽孢杆菌发酵液；
所述的发酵培养基为：麸皮2％，玉米粉1％、豆粕2％,硫酸铵2％，硫酸镁0.03％；柠檬酸铵0.5％，pH为7.0-7.4。
(5)地衣芽孢杆菌冻干菌粉的制备：将步骤(4)制备的发酵液离心后，在菌泥中加入10％的冻干保护剂(冻干保护剂配方为：脱脂奶粉10％，乳糖10％，甘油0.5％，维生素C0.2％，蒸馏水79.3％)，混匀后冷冻干燥，得到水分含量＜5％的地衣芽孢杆菌菌粉，每克冻干菌粉中活菌数约为400亿。
实施例4枯草芽孢杆菌的筛选与鉴定
取来自于天津武清、福建、江苏鱼塘和虾塘的水样和泥样124个，取1mL水样或泥样1g于18ml试管的9mL LB液体培养基中，85℃水浴处理10min。
将高温处理后的试管放在温度为30℃，180rpm的好氧条件下恒温振荡培养16h后得到富集培养液。
采用倍比稀释法将富集培养液进行梯度稀释，涂布于LB固体培养基上，放置于30℃恒温箱中进行培养20h，挑取平板上所生长的不同单菌落进行划线，并纯化两次，获得活的单菌落，共获得275株菌。
将纯化两次后的单菌落，用牙签点种在新鲜的溶血板上，放置于30℃恒温箱中观察24h、48h、72h，是否出现溶血圈，根据使血细胞琼脂溶血的能力分类：1)α溶血：草绿色溶血，菌落周围培养基出现1～2mm的草绿色环，为高铁血红蛋白所致；2)β溶血：完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的溶血环，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致；3)γ溶血：不溶血。将有溶血圈菌株淘汰。
将无溶血性菌株在选择性固体培养基上划线，生长良好的菌株用LB液体培养，在30℃恒温扩大培养16h。
固体选择性培养基为两种：以NH4 +-N为唯一氮源的氨氮选择性培养基和以NO2 --N为唯一氮源的亚硝态氮培养基；
氨氮选择性固体培养基为每L由(NH4)2SO4 0.5g，琥珀酸钠2.17g，维氏盐溶液50mL，琼脂20g和余量的水组成，pH 7.0-7.2，115℃高压灭菌20min，所述维氏盐溶液为每L由K2HPO4 5.0g，MgSO4·7H2O 2.5g，NaCl 2.5g，FeSO4·7H2O 0.05g，MnSO4·4H2O 0.05g和余量的水组成；
亚硝态氮选择性固体培养基为每L由NaNO20.5g，琥珀酸钠2.17g，维氏盐溶液50mL，琼脂20g和余量的水组成，pH 7.0-7.2，115℃高压灭菌20min，所述维氏盐溶液为每L由K2HPO4 5.0g，MgSO4·7H2O 2.5g，NaCl 2.5g，FeSO4·7H2O 0.05g，MnSO4·4H2O 0.05g和余量的水组成。
最终获得无溶血圈且在氨氮和亚硝态氮选择性固体培养基上生长良好的63株芽孢杆菌。
在超净台中，将63株待测菌株菌液接入相应的筛选培养基中，接种终浓度为5×105CFU/mL，重复数为3；放入摇床中进行培养30℃，180r/min，培养48h；均匀取样到1.5mL离心管中，12000rpm离心3min，取上清200μL加入96孔板；
测定亚硝态氮时，在96孔板中加入待测样上清液200μL后，每孔先后加入格里斯试剂A、B各20μL，于550nm比色测定；测定铵态氮时，每孔加入纳氏试剂20μL，于450nm比色测定；
筛选培养基为两种：氨氮筛选培养基和亚硝态氮筛选培养基；
氨氮筛选培养基为每50mL由(NH4)2SO4母液50μl，市售粉碎虾料0.05g和余量的水组成，铵态氮浓度为：2.5mg/l；
亚硝态氮筛选培养基为每50mL由NaNO2母液50μl，市售粉碎虾料0.05g和余量的水组成，亚硝态氮浓度为：2.5mg/l。
硫酸铵母液为称取9g(NH4)2SO4加入1L模拟虾池水，此时铵态氮浓度约为：2.5g/l；
亚硝酸钠母液为称取3.75g NaNO2加入1L模拟虾池水，此时亚硝态氮浓度约为：2.5g/l。
选取氨氮降解率高于30％的10株菌(编号为A1-A10)或亚硝酸氮降解率高于70％的10株菌(编号为Y1-Y10)，以不接种任何菌株为阴性对照(CK)，进行重复测定。
测定方法：在超净台中，将待测菌株菌液接入相应筛选培养基中，接种终浓度为5×105CFU/mL，重复数为3；放入摇床中进行培养30℃，180r/min，培养24h、48h；均匀取样到1.5mL离心管中，12000r/min离心3min，取上清200μL加入96孔板。
测定亚硝态氮时，在96孔板中加入待测样上清液200μL后，每孔先后加入格里斯试剂A、B各20μL，于550nm比色测定；测定氨氮时每孔加入纳氏试剂20μL，于450nm比色测定。
定性测定：测定亚硝态氮时，溶液变为粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色等表示有亚硝酸盐还原，反应为阳性，即颜色越浅说明降解效果越佳；测定铵态氮时，溶液变为橙色、黄色等为阳性反应，浅为佳。
定量测定：制定亚硝态氮浓度(Y1)与测定OD值(X1)之间参考标准曲线及氨氮浓度(Y2)与测定OD值(X2)之间参考标准曲线。
筛选培养基包括氨氮筛选培养基和亚硝态氮筛选培养基；
氨氮筛选培养基：(NH4)2SO4母液50μl，虾料0.05g，蒸馏水50mL，氨氮浓度约为：2.5mg/L，121℃灭菌。硫酸铵母液：称取9g(NH4)2SO4加入1L蒸馏水，此时铵态氮浓度约为：2.5g/l。
亚硝氮筛选培养基：NaNO2母液50μl，虾料0.05g，蒸馏水50mL，亚硝氮浓度约为：2.5mg/l，121℃灭菌。亚硝酸钠母液：称取3.75g NaNO2加入1L蒸馏水，此时亚硝态氮浓度约为：2.5g/l。
格里斯氏试剂(Griess)A：对氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸(10％左右)150mL，棕色瓶避光，4℃保存。格里斯氏试剂B：α萘胺0.1g，蒸馏水20mL,稀醋酸(10％左右)150mL，棕色瓶避光4℃保存。
纳氏试剂：现购即可，4℃保存。
结果如表1和表2所示，H8-1的平均氨氮降解率为81.72％，平均亚硝降解率为99.70％，降氮能力最高。
表1 10株优选菌株氨氮降解率比较测定(A10号为H8-1)
菌株号 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 ck
24h氨氮 34.096 30.000 19.789 45.702 37.728 39.985 59.574 21.277 75.487 79.572 0.011
48h氨氮 45.897 35.786 38.931 56.971 40.302 44.818 31.405 40.626 61.079 83.873 0.441
表2 10株优选菌株亚硝态氮降解率比较测定(Y10号为H8-1)
菌株号 Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8 Y9 Y10 ck
24h亚硝 83.121 74.374 90.671 92.332 75.629 74.506 90.467 95.714 92.196 99.603 0.002
48h亚硝 83.018 74.508 90.128 93.671 75.457 70.165 92.467 96.541 94.467 99.806 2.443
将筛选到的枯草芽孢杆菌H8-1于2014年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.9356。
实施例5不同盐浓度条件下H8-1生长情况比较
使用盐度分别为0‰、3‰、15‰的水配制LB固体培养基，用灭菌后的牙签点种H8-1在不同盐度的平板上，放置于30℃培养箱中培养16h，观察平板上菌落生长情况。培养后发现，点种在三种盐度不同的平板上的菌落生长均良好，生长完成后的菌落大小较一致，说明H8-1耐盐性能强。
LB培养基：胰蛋白胨：10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L；琼脂粉15g/L。用盐度计配制盐度分别为0‰、3‰、15‰的水，进行培养基的配制。
实施例6不同盐浓度条件下H8-1降氮性能测定
结果见表3，如表所示，在0‰、3‰、15‰盐度下，H8-1的降氮性能有所差别，但受盐度的影响很小。
表3 在不同盐度下测定H8-1的降氮性能
Figure BDA0000892255280000111
氨氮筛选培养基：(NH4)2SO4母液50μl，虾料0.05mg，分别使用不同盐度的水(0‰盐度的水：蒸馏水；3‰和15‰盐度的水:添加海盐到蒸馏水中，用盐度计测定，达到盐度分别为3‰和15‰)50mL，氨氮浓度约为：2.5mg/L，121℃灭菌。硫酸铵母液：称取9g(NH4)2SO4加入1L蒸馏水，此时铵态氮浓度约为：2.5g/l。
亚硝氮筛选培养基：NaNO2母液50μl，虾料0.05mg，不同盐度的水50mL，亚硝氮浓度约为：2.5mg/l，121℃灭菌。亚硝酸钠母液：称取3.75g NaNO2加入1L蒸馏水，此时亚硝态氮浓度约为：2.5g/l。
实施例7在低温条件下H8-1生长情况
用灭菌后的牙签点种H8-1单菌落在LB固体平板上，分别放置在温度为10℃、15℃、30℃培养箱中24h，观察平板上菌落生长情况。培养后发现，在10℃和15℃培养箱中生长的平板上菌落大小相似，均为生长在30℃培养箱中平板上菌落大小的1/2，这说明H8-1在温度较低的养殖环境中也能够正常生长而发挥降氮功能。
LB固体培养基：胰蛋白胨：10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L；琼脂粉15g/L。
实施例8枯草芽孢杆菌CGMCC No.9356菌粉的制备：
枯草芽孢杆菌种子液的制备：将保藏菌种接种至装有100ml MNB培养基的锥形瓶中，30℃恒温摇床中培养16h，摇床转速为225rpm；将制备好的枯草芽孢杆菌种子液按照1-3％的接种量接种至装有100mL MNB培养基的锥形瓶中，30℃恒温摇床中培养16h，摇床转速为225rpm；
所述的MNB培养基配方如下：葡萄糖，5.0g/L；蛋白胨，5.0g/L；牛肉膏，3.0g/L；酵母浸粉，1.0g/L；七水硫酸镁，0.5g/L；硫酸锰，0.005g/L；pH 7.0±0.2；
通过发酵液的离心、浓缩、加入冻干保护剂、真空冷冻干燥及菌粉活菌数检验等生产程序，最终制备出粉状活菌制剂。
实施例9粉状微生态制剂制备
将制备的枯草芽孢杆菌CGMCC No.9356的菌粉、地衣芽孢杆菌CGMCC No.7030的菌粉，短小芽孢杆菌CGMCC No.4756的菌粉按重量比1:1:1混合后，即得本发明的分装芽孢杆菌，粉状微生态制剂中的活菌数约为110亿cfu/g。
实施例10约氏乳杆菌CGMCC No.4926发酵液的制备
1)将冷冻保存的约氏乳杆菌CGMCC No.4926在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于10mL深层MRS液体试管，37℃培养10小时后，以1％接种量转接于250mL MRS液体培养基，培养10小时后作为种子液；
2)以5％的接种量将步骤1)所得的种子液接种于5L的发酵罐中培养；
3)发酵过程中维持发酵液pH值为6.0，当pH超过设定值时，补加料液；当pH低于设定值时，自动流加碱性中和剂氨水；在温度37℃、转速100rpm条件下发酵14小时，发酵过程通入N2，维持溶氧小于1％；
4)当补加料液pH不再降低或发酵液在600nm波长下的吸光值(即OD600)不再增加时，终止发酵，即得约氏乳杆菌活菌数达1011cfu/ml以上的发酵液。
实施例11屎肠球菌CGMCC No.9134菌液制备
1)培养基灭菌：
培养基配方：10g/L果糖、50g/L牛肉膏、10g/L酵母膏、15g/L硫酸镁、15g/L NaCl、15％CaCO3。
配制培养基，注水(自来水即可)，灭菌温度为115℃，时间为20min，调节pH值至6.8；
2)稳定理化指标：
发酵罐转速50rpm，通风1:0.1vvm，罐压维持在0.05MPa，液体理化指标稳定后，标定溶解氧。
3)接种发酵：
按照1％的比例接种，培养条件：温度20℃，转速50rpm，罐压为0.01兆帕，通风量为1:0.1vvm。该状态下，培养10h下罐，下罐时活菌数为1×109cfu/ml以上。
实施例12液体微生态制剂制备
将屎肠球菌CGMCC No.9134的发酵液与约氏乳杆菌CGMCC No.4926按体积比1:1的比例进行混合，即得本发明的液体微生态制剂，其中，活菌数约为20亿cfu/ml。
实施例13鲤鱼膨化饲料制备
鱼粉10份、去皮豆粕40份、菜粕10份、面粉20份、米糠15份、豆油4份、膨润土1份、磷酸二氢钙3份、氯化胆碱0.1份、复合维生素0.5份、复合微量元素0.5份、粉状微生态制剂0.5份和液体微生态制剂0.5份。
按重量份称取鱼粉、去皮豆粕、棉粕、菜粕和米糠，先进行初次粉碎，然后与其他原料和粉状微生态制剂混合均匀后投入到超细微粉碎机中，粉碎成90％过80目的粉状饲料，再进行膨化制粒；
膨化制粒后通过后喷涂将液体微生态制剂添加到颗粒表面，烘干。
实施例14鲤鱼膨化饲料制备
鱼粉5份、去皮豆粕20份、菜粕30份、面粉15份、米糠10份、豆油1份、膨润土3份、磷酸二氢钙1份、氯化胆碱0.5份、复合维生素0.1份、复合微量元素0.1份、粉状微生态制剂0.1份和液体微生态制剂2份。
按重量份称取鱼粉、去皮豆粕、棉粕、菜粕和米糠，先进行初次粉碎，然后与其他原料和粉状微生态制剂混合均匀后投入到超细微粉碎机中，粉碎成90％过80目的粉状饲料，再进行膨化制粒；
膨化制粒后通过后喷涂将液体微生态制剂添加到颗粒表面，烘干。
实施例15鲤鱼膨化饲料制备
鱼粉9份、去皮豆粕30份、菜粕20份、面粉18份、米糠11份、豆油2份、膨润土2.1份、磷酸二氢钙2份、氯化胆碱0.3份、复合维生素0.3份、复合微量元素0.3份、粉状微生态制剂0.2份和液体微生态制剂1.5份。
按重量份称取鱼粉、去皮豆粕、棉粕、菜粕和米糠，先进行初次粉碎，然后与其他原料和粉状微生态制剂混合均匀后投入到超细微粉碎机中，粉碎成90％过80目的粉状饲料，再进行膨化制粒；
膨化制粒后通过后喷涂将液体微生态制剂添加到颗粒表面，烘干。
试验例1
本试验于2015年7月5日至9月5日在大北农集团唐山玉田水产试验基地进行，共4组试验，1个对照组和3个试验组。试验组1-3分别为实施例13-15制备的膨化鲤鱼饲料，对照组其他成分同实施例15，区别在于不添加微生态制剂。每个试验组设4个重复，共16个养殖桶(800L/桶)，每桶放30尾鲤鱼(50.13±0.15克)。养殖期间日投饲率为体重的3％，上下午各投喂一次，每两周称重调整一次投喂量。每天下午换水1/3，以保证养殖水体符合渔业养殖水质标准要求，试验结束后每桶随机取5尾鱼测定体长、体重等生长指标。
试验结束后各组鲤鱼的成活率均为100％，其生长数据测定结果见表4：
表4 各试验组生长指标
组别 鱼体初重(g) 鱼体末重(g) 增重率％ 饵料系数 肥满度％
对照组 50.28±0.07 77.67±2.28 54.48±3.60a 2.15±0.18a 2.56±0.05a
试验组1 50.10±0.25 81.48±3.15 62.63±4.25b 2.03±0.21b 2.48±0.11a
试验组2 50.08±0.15 82.38±3.07 64.49±4.19b 1.98±0.25b 2.53±0.13a
试验组3 50.06±0.12 83.17±2.12 66.14±3.59b 1.86±0.21b 2.64±0.12b
注：同一列中具不同上标字母表示差异显著(P<0.05)。
从增重率来看，本发明的3个试验组的增重率均显著高于对照组，其中试验组1高于对照组8.15％，试验组2高于对照组10.01％，试验组3高于对照组11.66％；饵料系数方面，3个试验组也显著低于对照组；从肥满度来看，试验组3显著高于对照组。由以上分析结果可知，膨化饲料中添加微生态制剂后，可以显著提高鲤鱼的生长速度，降低饵料系数。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种膨化鲤鱼饲料，其特征在于，含有如下重量份的组分：鱼粉5-10份、去皮豆粕20-40份、菜粕10-30份、面粉15-20份、米糠10-15份、豆油1-4份、膨润土1-3份、磷酸二氢钙1-3份、氯化胆碱0.1-0.5份、复合维生素0.1-0.5份、复合微量元素0.1-0.5份、粉状微生态制剂0.1-0.5份和液体微生态制剂0.5-2份，所述的粉状微生态制剂含有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CGMCC No.9356、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CGMCCNo.7030和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）CGMCC No.4756，所述的液体微生态制剂含有屎肠球菌(Enterococcus faecium) CGMCC No.9134、约氏乳杆菌（Lactobacillusjohnsonii）CGMCC No.4926。
2.如权利要求1所述的膨化鲤鱼饲料，其特征在于，含有如下重量份的组分：鱼粉9份、去皮豆粕30份、菜粕20份、面粉18份、米糠11份、豆油2份、膨润土2.1份、磷酸二氢钙2份、氯化胆碱0.3份、复合维生素0.3份、复合微量元素0.3份、粉状微生态制剂0.1-0.2份和液体微生态制剂1-1.5份。
3.如权利要求1或2所述的膨化鲤鱼饲料，其特征在于，所述的粉状微生态制剂中的活菌数为80-120亿cfu/g。
4.如权利要求1或2所述的膨化鲤鱼饲料，其特征在于，所述的液体微生态制剂中的活菌数为10-20亿cfu/ml。
5.权利要求1-4任一项所述的膨化鲤鱼饲料的制备方法，其包括如下步骤：
1）按重量份称取鱼粉、去皮豆粕、棉粕、菜粕和米糠，先进行初次粉碎，然后与其他原料和粉状微生态制剂混合均匀后投入到超细微粉碎机中，粉碎成90%过80目的粉状饲料，再进行膨化制粒；
2）膨化制粒后通过后喷涂将液体微生态制剂添加到颗粒表面，烘干。
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