CN106367378A - 可提高甘草黄酮含量的光果甘草愈伤组织细胞培养方法 - Google Patents

可提高甘草黄酮含量的光果甘草愈伤组织细胞培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及可提高甘草黄酮含量的光果甘草愈伤组织细胞培养方法，其特征在于采用以下步骤：1）挑选饱满的光果甘草种子，在含有30g/L蔗糖、7g/L琼脂的MS基础培养基上培养得到无菌苗，接入愈伤组织诱导培养基中培养，后转入继代培养基中继代培养；2）选取步骤1）中继代培养后所获得的淡黄色愈伤组织，转移至液体培养基中悬浮振荡培养；3）在步骤2）所述愈伤组织悬浮振荡培养过程中，进行诱导培养，从继代培养周期的第6~12天开始，将培养温度从25oC提高至35~45oC，继续培养1~3天后，恢复培养温度到25oC；在35~45oC培养时，加入冠毒素；恢复至25oC后，加入对羟基苯丙酮酸，悬浮振荡培养结束后得到甘草黄酮含量高的光果甘草愈伤组织细胞。有益效果：高甘草黄酮含量高。

Description

可提高甘草黄酮含量的光果甘草愈伤组织细胞培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种可提高甘草黄酮含量的光果甘草愈伤组织细胞培养方法。
技术背景
光果甘草主要分布于新疆北部、青海、甘肃等省区，主要化学成分为黄酮类化合物和三萜皂苷，其中，甘草黄酮类化合物具有多种生物活性，除了消炎、抗菌等作用外，在抗氧化、抗癌、防癌等方面也有显著的生物活性，在医药、食品保健、化妆品行业中有广泛的应用前景。
随着对光果甘草开发利用的不断深入，其需求量猛增。由于世界90%的甘草原料均由我国出口提供，因此，我国大部分地区野生甘草受到了毁灭性的采挖，有的地区甚至濒临枯竭。野生资源的匮乏与甘草需求量增长的矛盾日益突出，成为亟待解决的问题。为解决野生资源的匮乏与甘草需求量增长的矛盾，可从两方面着手：一是利用组织培养技术，对光果甘草进行无性快速繁殖，并采用细胞工程或基因工程的手段改良其品质，扩大优良品种种植面积；二是通过细胞大规模培养来生产甘草的有效成分——甘草黄酮。但是，光果甘草至少需要生长3年才能入药，也就是说，若采取第一种方案，在相当长的时期内，光果甘草仍不能满足市场需求。因此，通过细胞大规模培养来生产甘草黄酮迫在眉睫。
在上述背景下，近年来，许多学者都已经将研究目光转向于利用光果甘草干细胞培养，以获得高产量的甘草黄酮。此法不仅可大大加快植物细胞的生长，提高目标物质的含量，并且不受地理、季节和气候条件的限制，能节省野生植物和土地资源，具有生长周期短，经济效益显著等优点。但甘草愈伤组织诱导培养过程中易出现褐化，难以获得稳定细胞系，另外，对甘草愈伤组织增加次生代谢产物甘草黄酮的研究尚处起步阶段。
文献表明，愈伤组织悬浮扩大培养的过程中，适宜的培养条件会显著提升次生代谢产物的产量，如光照、温度、真菌处理等，这些条件的改变能诱导次生代谢产物合成途径中相关酶的生成与表达，从而促进目标产物的合成。其次，相关信号因子的加入也能诱导植物化学防御，激活植物防御相关基因的表达，从而促进次生代谢产物生成。何峰等人在甘草悬浮培养体系中添加10 mg/L水杨酸，甘草黄酮含量可达4.3mg/g，其它被验证有效的信号因子还包括茉莉酸甲酯和二氢茉莉酮酸甲酯。此外，通过添加前体物质也是一种提高次生代谢产物的有效方法，这是因为在合成途径中会存在限速酶，常常使终产物的产量受制于代谢途径中某些底物的数量，因此，在目标产物代谢途径基本清楚的条件下，添加其生物合成的前体物质以解除这种限制，则有可能提高终产物的产量。杨英等人在甘草细胞悬浮体系中加入苯丙氨酸、酪氨酸、肉桂酸和乙酸钠来研究前体对甘草细胞生产甘草黄酮的影响，结果显示，4种前体均能促进细胞内甘草黄酮的生物合成，在最优添加浓度与时间下，甘草黄酮含量均可达到6.5mg/g左右。虽然研究者们对提高甘草愈伤组织细胞中甘草黄酮含量作出了相关努力，但在已报道的相关成果中，甘草黄酮仅占愈伤组织细胞干重的0.4%~0.7%左右，仍无法满足市场需求。因此，寻找一种可提高光果甘草愈伤组织中甘草黄酮累积的细胞培养方法成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可提高甘草黄酮含量的光果甘草愈伤组织细胞培养方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种可提高甘草黄酮含量的光果甘草愈伤组织细胞培养方法，其特征在于采用以下步骤：
1）光果甘草愈伤组织的诱导与继代培养：挑选饱满的光果甘草种子，在含有30g/L蔗糖、7g/L琼脂的MS基础培养基（MS基础培养基购于Sigma，M 5524）上培养得到无菌苗；取无菌苗胚轴为外植体，接入愈伤组织诱导培养基中黑暗培养10天，诱导出愈伤组织，之后在光照强度为1500 lx的条件下继续培养14天，每日光照12h；然后将愈伤组织转入继代培养基中，每28天继代一次，继代培养2次，以获得稳定的光果甘草愈伤组织，继代培养温度25oC，继代培养基pH 5.8；所述愈伤组织诱导培养基为含有1~2mg/L萘乙酸、0.1~0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、20~30g/L蔗糖、5~8g/L琼脂的MS基础培养基；所述继代培养基由愈伤组织诱导培养基中添加甲硫氨酸（CAS号59-51-8，购于Sigma）而成，甲硫氨酸在继代培养基中的浓度为0.1~1.0 mmol/L；
2）愈伤组织悬浮振荡培养：选取步骤1）中生长旺盛、质地松散的淡黄色愈伤组织，转移至液体培养基中悬浮振荡培养，接种量40~100g/L，g/L=愈伤组织鲜重/液体培养基体积，摇床转速60~150 rpm，光照强度1500~2000 lx，光照时间8~16 h/day，液体培养基pH 5.6~6.8；每21天继代培养1次，继代培养2~5次；所述液体培养基是添加有6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、蔗糖的MS基础培养基，所述6-苄氨基嘌呤的浓度为1.0~2.0mg/L，萘乙酸的浓度为0.5~1.0mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.5~1.0mg/L、蔗糖的浓度为20~30g/L；
3）甘草黄酮的诱导积累：在步骤2）所述愈伤组织悬浮振荡培养过程中，还对其进行诱导培养，以刺激次生代谢产物甘草黄酮的积累，所述诱导条件为：于步骤2）所述继代培养周期的第6~12天开始，将培养温度从25oC提高至35~45oC，维持该温度继续培养1~3天后，恢复培养温度到25oC，直至该培养周期结束；在35~45oC培养时，往液体培养基中加入经过滤灭菌后的冠毒素（Coronatine），冠毒素终浓度为0.8~2.2mg/L；恢复至25oC后，往液体培养基中加入经过滤灭菌后的对羟基苯丙酮酸（CAS号156-39-8，购于Aldrich），对羟基苯丙酮酸终浓度为60~150mg/L；悬浮振荡培养结束后得到甘草黄酮含量高的光果甘草愈伤组织细胞。
在本发明所述培养条件下，甘草黄酮的含量增至28~48mg/g，占愈伤组织细胞干重的2.8%~4.8%，与目前已报道的细胞培养方式相比，目标产物甘草黄酮的产量提升4~16倍。
本发明在光果甘草愈伤组织的诱导与继代培养过程中，加入抗褐化物质甲硫氨酸，可增加愈伤组织出愈率，在相同培养周期内，细胞生物量（每单位体积培养基的细胞干重，g/L）增加56%~83%，提高了甘草黄酮产量。
本发明通过在愈伤组织悬浮振荡培养过程中，阶段性地将培养温度从25oC升至高于35oC，营造高温胁迫环境，以启动光果甘草化学防御机制；同时加入信号因子冠毒素，参与植物防御相关的信号传输过程，促进甘草黄酮生物合成过程中关键酶的生成，实现次生代谢产物的快速合成。
本发明在结束高温胁迫后，于培养液中加入前体物质对羟基苯丙酮酸，可提高甘草黄酮生物合成过程的反应速率，从而大大提高提高次生代谢产物的产量。
综上所述，本发明具有能提高光果甘草愈伤组织细胞中甘草黄酮含量的有益效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
实施例1：
一种可提高甘草黄酮含量的光果甘草愈伤组织细胞培养方法，采用以下步骤：
1）光果甘草愈伤组织的诱导与继代培养：挑选饱满的光果甘草种子，在含有30g/L蔗糖、7g/L琼脂的MS基础培养基培养得到无菌苗；取无菌苗胚轴为外植体，接入含有1.0mg/L萘乙酸、0.4mg/L 6-苄氨基嘌呤、22g/L蔗糖、6g/L琼脂的MS基础培养基中，黑暗培养10天，诱导出愈伤组织，之后在光照强度为1500 lx的条件下继续培养14天，每日光照12h；然后将愈伤组织转入含有1.0mg/L萘乙酸、0.4mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mmol/L甲硫氨酸、22g/L蔗糖、6g/L琼脂的MS基础培养基中，继代培养温度25oC，继代培养基pH 5.8，每28天继代一次，继代培养2次，获得稳定的光果甘草愈伤组织，所述MS基础培养基购于Sigma，牌号M 5524；
2）愈伤组织悬浮振荡培养与甘草黄酮的诱导积累：选取步骤1）中生长旺盛、质地松散的淡黄色愈伤组织，转移至含有2.0mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.5mg/L萘乙酸、0.8mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、蔗糖22g/L的液体培养基中悬浮振荡培养，接种量40g/L，摇床转速120 rpm，光照强度1500 lx，光照时间10h/day，液体培养基pH 5.6；每21天继代培养1次，并于继代培养周期的第10天开始，将培养温度从25oC提高至35oC，同时加入冠毒素，使冠毒素在液体培养基中的终浓度为2.2mg/L，维持35oC培养1天后，恢复培养温度到25oC，加入对羟基苯丙酮酸，对羟基苯丙酮酸在液体培养基中的终浓度为60mg/L；继代培养2次后得到甘草黄酮含量高的光果甘草愈伤组织细胞。
培养结束后，测定甘草黄酮含量，结果表明甘草黄酮含量占细胞干重的3.12%。
实施例2：
一种可提高甘草黄酮含量的光果甘草愈伤组织细胞培养方法，采用以下步骤：
1）光果甘草愈伤组织的诱导与继代培养：挑选饱满的光果甘草种子，在含有30g/L蔗糖，7g/L琼脂的MS基础培养基上培养得到无菌苗；取无菌苗胚轴为外植体，接入含有1.2mg/L萘乙酸、0.3mg/L 6-苄氨基嘌呤、20g/L蔗糖、8g/L琼脂的MS基础培养基中，黑暗培养10天，诱导出愈伤组织，之后在光照强度为1500 lx的条件下继续培养14天，每日光照12h；然后将愈伤组织转入含有1.2mg/L萘乙酸、0.3mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.3mmol/L甲硫氨酸、20g/L蔗糖、8g/L琼脂的MS基础培养基中，继代培养温度25oC，继代培养基pH 5.8，每28天继代一次，继代培养2次，获得稳定的光果甘草愈伤组织；
2）愈伤组织悬浮振荡培养与甘草黄酮的诱导积累：选取步骤1）中生长旺盛、质地松散的淡黄色愈伤组织，转移至含有1.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.7mg/L萘乙酸、0.9mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、蔗糖20g/L的液体培养基中悬浮振荡培养，接种量60g/L，摇床转速100 rpm，光照强度1700 lx，光照时间14h/day，液体培养基pH 6.0；每21天继代培养1次，并于继代培养周期的第6天开始，将培养温度从25oC提高至42oC，同时加入冠毒素，使冠毒素在液体培养基中的终浓度为1.8mg/L，维持42oC培养2天后，恢复培养温度到25oC，加入对羟基苯丙酮酸，对羟基苯丙酮酸在液体培养基中的终浓度为100mg/L；继代培养4次后得到甘草黄酮含量高的光果甘草愈伤组织细胞。
培养结束后，测定甘草黄酮含量，结果表明甘草黄酮含量占细胞干重的4.66%。
实施例3：
一种可提高甘草黄酮含量的光果甘草愈伤组织细胞培养方法，采用以下步骤：
1）光果甘草愈伤组织的诱导与继代培养：挑选饱满的光果甘草种子，在含有30g/L蔗糖，7g/L琼脂的MS基础培养基上培养得到无菌苗；取无菌苗胚轴为外植体，接入含有1.4mg/L萘乙酸、0.1mg/L 6-苄氨基嘌呤、26g/L蔗糖、5g/L琼脂的MS基础培养基中，黑暗培养10天，诱导出愈伤组织，之后在光照强度为1500 lx的条件下继续培养14天，每日光照12h；然后将愈伤组织转入含有1.4mg/L萘乙酸、0.1mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.6mmol/L甲硫氨酸、26g/L蔗糖、5g/L琼脂的MS基础培养基中，继代培养温度25oC，继代培养基pH 5.8，每28天继代一次，继代培养2次，获得稳定的光果甘草愈伤组织；
2）愈伤组织悬浮振荡培养与甘草黄酮的诱导积累：选取步骤1）中生长旺盛、质地松散的淡黄色愈伤组织，转移至含有1.4mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.6mg/L萘乙酸、0.7mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、蔗糖26g/L的液体培养基中悬浮振荡培养，接种量80g/L，摇床转速60 rpm，光照强度1800 lx，光照时间8h/day，液体培养基pH 5.8；每21天继代培养1次，并于继代培养周期的第12天开始，将培养温度从25oC提高至38oC，同时加入冠毒素，使冠毒素在液体培养基中的终浓度为1.2mg/L，维持38oC培养3天后，恢复培养温度到25oC，加入对羟基苯丙酮酸，对羟基苯丙酮酸在液体培养基中的终浓度为80mg/L；继代培养5次后得到甘草黄酮含量高的光果甘草愈伤组织细胞。
培养结束后，测定甘草黄酮含量，结果表明甘草黄酮含量占细胞干重的3.83%。
实施例4：
一种可提高甘草黄酮含量的光果甘草愈伤组织细胞培养方法，采用以下步骤：
1）光果甘草愈伤组织的诱导与继代培养：挑选饱满的光果甘草种子，在含有30g/L蔗糖，7g/L琼脂的MS基础培养基上培养得到无菌苗；取无菌苗胚轴为外植体，接入含有1.8mg/L萘乙酸、0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、24g/L蔗糖、7g/L琼脂的MS基础培养基中，黑暗培养10天，诱导出愈伤组织，之后在光照强度为1500 lx的条件下继续培养14天，每日光照12h；然后将愈伤组织转入含有1.8mg/L萘乙酸、0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.9mmol/L甲硫氨酸、24g/L蔗糖、7g/L琼脂的MS基础培养基中，继代培养温度25oC，继代培养基pH 5.8，每28天继代一次，继代培养2次，获得稳定的光果甘草愈伤组织。
2）愈伤组织悬浮振荡培养与甘草黄酮的诱导积累：选取步骤1）中生长旺盛、质地松散的淡黄色愈伤组织，转移至含有1.8mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.9mg/L萘乙酸、1.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、蔗糖24g/L的液体培养基中悬浮振荡培养，接种量100g/L，摇床转速150rpm，光照强度1600 lx，光照时间16h/day，液体培养基pH 6.4；每21天继代培养1次，并于继代培养周期的第8天开始，将培养温度从25oC提高至45oC，同时加入冠毒素，使冠毒素在液体培养基中的终浓度为1.5mg/L，维持45oC培养2天后，恢复培养温度到25oC，加入对羟基苯丙酮酸，对羟基苯丙酮酸在液体培养基中的终浓度为130mg/L；继代培养3次后得到甘草黄酮含量高的光果甘草愈伤组织细胞。
培养结束后，测定甘草黄酮含量，结果表明甘草黄酮含量占细胞干重的4.05%
实施例5：
一种可提高甘草黄酮含量的光果甘草愈伤组织细胞培养方法，采用以下步骤：
1）光果甘草愈伤组织的诱导与继代培养：挑选饱满的光果甘草种子，在含有30g/L蔗糖，7g/L琼脂的MS基础培养基上培养得到无菌苗；取无菌苗胚轴为外植体，接入含有2.0mg/L萘乙酸、0.2mg/L 6-苄氨基嘌呤、30g/L蔗糖、8g/L琼脂的MS基础培养基中。黑暗培养10天，诱导出愈伤组织，之后在光照强度为1500 lx的条件下继续培养14天，每日光照12h；然后将愈伤组织转入含有2.0mg/L萘乙酸、0.2mg/L 6-苄氨基嘌呤、1.0mmol/L甲硫氨酸、30g/L蔗糖、8g/L琼脂的MS基础培养基中，继代培养温度25oC，继代培养基pH 5.8，每28天继代一次，继代培养2次，获得稳定的光果甘草愈伤组织。
2）愈伤组织悬浮振荡培养与甘草黄酮的诱导积累：选取步骤1）中生长旺盛、质地松散的淡黄色愈伤组织，转移至含有1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤、1.0mg/L萘乙酸、0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、蔗糖30g/L的液体培养基中悬浮振荡培养，接种量50g/L，摇床转速80rpm，光照强度2000 lx，光照时间12h/day，液体培养基pH 6.8；每21天继代培养1次，并于继代培养周期的第9天开始，将培养温度从25oC提高至40oC，同时加入一定量冠毒素，使冠毒素在液体培养基中的终浓度为0.8mg/L，维持40oC培养1天后，恢复培养温度到25oC，加入对羟基苯丙酮酸，对羟基苯丙酮酸在液体培养基中的终浓度为150mg/L；继代培养2次后得到甘草黄酮含量高的光果甘草愈伤组织细胞。
培养结束后，测定甘草黄酮含量，结果表明甘草黄酮含量占细胞干重的3.42%。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所做的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (1)

1.可提高甘草黄酮含量的光果甘草愈伤组织细胞培养方法，其特征在于采用以下步骤：
1）光果甘草愈伤组织的诱导与继代培养：挑选饱满的光果甘草种子，在含有30g/L蔗糖、7g/L琼脂的MS基础培养基上培养得到无菌苗；取无菌苗胚轴为外植体，接入愈伤组织诱导培养基中黑暗培养10天，诱导出愈伤组织，之后在光照强度为1500 lx的条件下继续培养14天，每日光照12h；然后将愈伤组织转入继代培养基中，每28天继代一次，继代培养2次，以获得稳定的光果甘草愈伤组织，继代培养温度25oC，继代培养基pH 5.8；所述愈伤组织诱导培养基为含有1~2mg/L萘乙酸、0.1~0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、20~30g/L蔗糖、5~8g/L琼脂的MS基础培养基；所述继代培养基由愈伤组织诱导培养基中添加甲硫氨酸而成，甲硫氨酸在继代培养基中的浓度为0.1~1.0 mmol/L；
2）愈伤组织悬浮振荡培养：选取步骤1）中生长旺盛、质地松散的淡黄色愈伤组织，转移至液体培养基中悬浮振荡培养，接种量40~100g/L，g/L=愈伤组织鲜重/液体培养基体积，摇床转速60~150 rpm，光照强度1500~2000 lx，光照时间8~16 h/day，液体培养基pH 5.6~6.8；每21天继代培养1次，继代培养2~5次；所述液体培养基是添加有6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、蔗糖的MS基础培养基，所述6-苄氨基嘌呤的浓度为1.0~2.0mg/L，萘乙酸的浓度为0.5~1.0mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.5~1.0mg/L、蔗糖的浓度为20~30g/L；
3）甘草黄酮的诱导积累：在步骤2）所述愈伤组织悬浮振荡培养过程中，还对其进行诱导培养，以刺激次生代谢产物甘草黄酮的积累，所述诱导条件为：于步骤2）所述继代培养周期的第6~12天开始，将培养温度从25oC提高至35~45oC，维持该温度继续培养1~3天后，恢复培养温度到25oC，直至该培养周期结束；在35~45oC培养时，往液体培养基中加入经过滤灭菌后的冠毒素，冠毒素终浓度为0.8~2.2mg/L；恢复至25oC后，往液体培养基中加入经过滤灭菌后的对羟基苯丙酮酸，对羟基苯丙酮酸终浓度为60~150mg/L；悬浮振荡培养结束后得到甘草黄酮含量高的光果甘草愈伤组织细胞。
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