CN101265462A

CN101265462A - 甘草细胞产业化的培养方法

Info

Publication number: CN101265462A
Application number: CNA2008100530144A
Authority: CN
Inventors: 高文远; 卞爱华; 王娟; 曹宇
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2008-05-07
Filing date: 2008-05-07
Publication date: 2008-09-17

Abstract

本发明公开了一种甘草细胞产业化的培养方法，属于甘草细胞培养技术。该方法包括以下过程：甘草种子以消毒灭菌后接种于MS培养基中培养诱导甘草无菌芽；然后将切下的甘草芽段转移到愈伤组织培养基中固体培养生成甘草愈伤组织；之后将愈伤组织转移到细胞培养基中进行悬浮培养及进行继代培养获得细胞产量稳定的甘草细胞液；最后将甘草细胞液转移到搅拌桨式反应器中进行甘草细胞规模化悬浮培养得到细胞产量按细胞干重计为15～40g/l的甘草细胞悬浮液。本发明具有过程简单，细胞生长迅速、产量稳定等特点。

Description

甘草细胞产业化的培养方法

技术领域

本发明涉及一种甘草细胞的悬浮培养方法，属于甘草细胞培养技术。

背景技术

甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)为豆科多年生草本植物，其根及根茎具有补脾益气、止咳祛痰、清热解毒、调和诸药等功效，是最常用的中药之一，历来就有“十方九草”之说。现代药理研究表明甘草具有广泛的药理活性，如解毒、抗氧化、抗炎等。甘草中主要的活性成分为黄酮类和三萜类。其主要的三萜类成分甘草酸具有抗炎、抗溃疡、抗病毒和免疫调节等多种药理活性，另有报道甘草酸具有抗SARS病毒的作用，并且能够增强SARS感染者的免疫力。

甘草不但具有很高的药用价值，而且是我国西部干旱，半干旱地区的重要植被资源之一，对于防风固沙、改善土壤结构具有重要的作用，此外研究表明甘草的地上部分是一种中等的牧草。市场对甘草需求量极大，国内年需求量为3万吨左右，年出口量约为5万吨，并呈增长态势。目前市场上，80％的甘草是野生的，采挖甘草造成了西北地区草场的大量退化，使得野生甘草资源濒临枯竭，并引发了严重的沙漠化现象。目前甘草已经成为国家的二级保护植物。甘草已经成为国家专控药材，野生甘草被禁止用于保健品当中。而人工栽培的甘草中有效成分如甘草酸的含量不够稳定，并且人工栽培生长周期长，需要占用大量土地资源，所以期待用植物组织培养的方法生产有用的次生代谢产物，在一定程度上缓解甘草资源问题。

细胞悬浮培养具有诸多优点，比如生长条件可控；节约土地，生产***规范化；对有效成分合成路线进行遗传操作，提高次生代谢产物含量等，目前已经有多种药用植物的细胞悬浮培养实现了工业化，如紫草、人参等。可见利用药用植物细胞悬浮培养生产次生代谢产物具有可行性。

目前甘草组织培养方面的报道主要集中在愈伤组织培养及分化和毛状根培养方面的研究中，而对甘草细胞培养的研究较少；同时，对甘草细胞悬浮培养的***性研究及产业化培养并未见报道。本发明优化了甘草细胞悬浮培养的条件，获得了生长迅速，产量稳定的甘草细胞，并用5L的反应器进行了放大培养，获得了成功，细胞生长迅速，甘草酸、甘草苷、甘草多糖等主要成分的含量稳定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甘草细胞产业化的培养方法，该方法能够实现甘草细胞的工业化生产。

本发明是通过以下技术方案加以实现的：一种甘草细胞产业化的培养方法，其特征在于包括以下过程：

1.将甘草的种子用质量浓度为70％～75％乙醇浸泡10～15秒后，经灭菌的去离子水冲洗2～4遍，再用质量浓度为2％次氯酸钠溶液浸泡15～20分钟，然后经灭菌的去离子水冲洗2～4遍，将其接种于Murashige&Skoog(MS)培养基中固体培养，在培养温度为23℃～28℃，光照强度为800～2000lux，光照时间为12h/d的培养条件下培养3～5d后种子生出芽，将芽切成小段，转接到愈伤组织培养基中进行培养。所述的愈伤组织培养基由为MS培养基与按每升MS培养基加入1mg～4mg的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、加入0mg～2mg激动素(KT)、加入30～60g蔗糖和加入8～10g琼脂组成，用浓度为1mol/L的NaOH或质量浓度为10％的HCl调节细胞培养基的pH为4.5～7.5，之后在温度为23℃～28℃下避光培养，培养20～25d后，甘草愈伤组织布满培养皿。

2.按每克愈伤组织与细胞培养基的毫升体积量的1∶10～20的比例，将愈伤组织碎片转入培养基中进行液体悬浮培养。所述的细胞培养基由MS培养基与按每升培养基加入1mg～4mg的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、加入0mg～2mg的激动素(KT)和加入的30～60g蔗糖组成，用浓度为1mol/L的NaOH或质量浓度为10％的HCl调节细胞培养基的pH为4.5～7.5。在温度为23℃～28℃，光照强度为800～2000lux，光照时间为12h/d，摇床转速为90～120r·min^-1的条件下悬浮培养4～7d后，对悬浮液进行过滤，滤除较大的细胞团及未完全愈伤化的组织，在得到的分散性较好的细胞悬浮液中，按照细胞悬浮液体积量与加入的细胞培养基的体积量的比为1∶2～5的比例加入细胞培养基，继代培养20～25d后，在继代细胞悬浮液中，按照继代细胞悬浮液体积量与加入的细胞培养基的体积量比为1∶2～5的比例加入细胞培养基得到继代两次的细胞悬浮液，以此继代方法进行5次继代培养，得到细胞产量按细胞干重计为3～10g/L的细胞悬浮液。

3.取步骤2得到的每升含按干重计3～10g细胞的细胞悬浮液1～1.5L转移到5L搅拌桨式反应器中，按照细胞悬浮液的体积量与细胞培养基的体积量的比例为1∶1～3向反应器中加入细胞培养基。在温度为23℃～28℃，光照强度为800～2000lux，光照时间为12h/d，搅拌速率为80～130r/min，通气量为1.5～4L/min的培养条件下进行培养20～30d后收获甘草细胞，细胞产量按细胞干重计为15～40g/L。

本发明的优点：本方法实现了甘草细胞的规模化生产，在愈伤组织培养中，应用2，4-D及KT作为植物生长调节剂，使甘草芽愈伤化迅速，在愈伤组织继代培养过程中愈伤组织生长较快、状态良好。在细胞培养过程中，利用2，4-D与KT的良好配比使得细胞生长迅速，在规模化生产中，本发明首次利用搅拌式反应器进行培养，达到较好的培养效果。整个培养过程方便易行，细胞生长迅速、产量稳定，为工业大规模生产提供了有效途径。

具体实施方式

实例一：

将甘草的种子(购自北京时珍中草药研究所)3g，用质量浓度为70％乙醇浸泡10～15秒后，经灭菌的去离子水冲洗2遍，再用质量浓度为2％次氯酸钠溶液浸泡15分钟，然后经灭菌的去离子水冲洗2遍，将其接种于20mL MS培养基中固体培养，培养条件为：温度23℃、光照强度为800lux、光照时间为12h/d，培养约3d种子生出芽，将芽切成3～4mm的小段。取25mL MS培养基向其中加入0.025mg的2，4-D，加入0.05mg的KT，加入0.75g蔗糖，加入0.25g琼脂，配成愈伤组织培养基，用质量浓度为10％的HCl调节pH为4.5。将小芽小段置于上述培养中进行培养。培养条件为：温度23℃、避光培养、培养20d后，在培养皿上布满甘草愈伤组织。

按鲜重计将5g愈伤组织转入100mL细胞培养基中，该细胞培养基是由100mL的MS培养基，并加入0.1mg 2，4-D，0.2mg KT，加入3g蔗糖组成，再用质量浓度为10％的HCl调节该细胞培养基的pH为4.5。培养条件为：温度为23℃，摇床转速90r·min^-1，光照强度为800lux，光照时间为12h·d^-1。悬浮培养7d后，对悬浮液进行过滤，滤除较大的细胞团及未完全愈伤化的组织得到分散性较好的细胞悬浮液100mL，将细胞悬浮液均分等份，每份20mL，再向每份悬浮液也中加入40mL细胞培养基，在培养条件为：温度为23℃，摇床转速90r·min^-1，光照强度为800lux，光照时间为12h·d^-1的培养条件下进行第一次继代培养。继续培养20d后，将继代一次的悬浮液均分等份，每份20mL，加入40mL细胞培养基进行第二次继代培养。以此做法进行5次继代培养，得到细胞产量按细胞干重计为3g/L的细胞悬浮液。

将得到的细胞产量按细胞干重计为3g/L的细胞悬浮液1.5L转移到5L搅拌桨式反应器中，加入细胞培养基1.5L。该细胞培养基由1.5LMS基本培养基，和所加入的1.5mg 2，4-D，3mg KT，45g蔗糖组成，用质量浓度为10％的HCl调节该细胞培养基的pH为4.5。在培养温度为23℃，光照强度为800lux，光照时间为12h/d，搅拌速率为80r/min，通入空气，通气量为1.5L/min的培养条件下培养20d后收获细胞。

实例二：

将甘草的种子4g，用质量浓度为70％乙醇浸泡10～15秒后，经灭菌的去离子水冲洗2遍，再用质量浓度为2％次氯酸钠溶液浸泡16分钟，然后经灭菌的去离子水冲洗2遍，将其接种于20mL MS培养基中固体培养，培养条件为：温度25℃、光照强度为1000lux、光照时间为12h/d，培养约3d种子生出芽，将芽切成3～4mm的小段。取25mL MS培养基向其中加入0.05mg的2，4-D，加入0.0125mg的KT，加入0.75g蔗糖，加入0.25g琼脂，配成愈伤组织培养基，用浓度为1mol/L的NaOH调节pH为5.8。将小芽小段置于上述培养中进行培养。培养条件为：温度25℃、避光培养、培养20d后，在培养皿上布满甘草愈伤组织。

按鲜重计将10g愈伤组织转入100mL细胞培养基中，该细胞培养基是由100mL的MS培养基，并加入0.2mg 2，4-D，0.05mg KT，加入3g蔗糖组成，再浓度为1mol/L的NaOH调节该细胞培养基的pH为5.8。培养条件为：温度为25℃，摇床转速120r·min^-1，光照强度为1000lux，光照时间为12h·d^-1。悬浮培养7d后，对悬浮液进行过滤，滤除较大的细胞团及未完全愈伤化的组织得到分散性较好的细胞悬浮液100mL，将细胞悬浮液均分等份，每份20mL，再向每份悬浮液也中加入60mL细胞培养基，在培养条件为：温度为25℃，摇床转速120r·min^-1，光照强度为1000lux，光照时间为12h·d^-1的培养条件下进行第一次继代培养。继续培养20d后，将继代一次的悬浮液均分等份，每份20mL，加入60mL细胞培养基进行第二次继代培养。以此做法进行5次继代培养，得到细胞产量按细胞干重计为10g/L的细胞悬浮液。

将得到的细胞产量按细胞干重计为10g/L的细胞悬浮液1L转移到5L搅拌桨式反应器中，加入细胞培养基3L。该细胞培养基由3L MS基本培养基，和所加入的6mg 2，4-D，1.5mg KT，90g蔗糖组成，用浓度为1mol/L的NaOH调节该细胞培养基的pH为5.8。在培养温度为25℃，光照强度为1000lux，光照时间为12h/d搅拌速率为90r/min，通入空气，通气量为2L/min的培养条件下培养25d后收获细胞。

实例三：

将甘草的种子5g，用质量浓度为75％乙醇浸泡10～15秒后，经灭菌的去离子水冲洗2遍，再用质量浓度为2％次氯酸钠溶液浸泡20分钟，然后经灭菌的去离子水冲洗2遍，将其接种于20mL MS培养基中固体培养，培养条件为：温度26℃、光照强度为1500lux、光照时间为12h/d，培养约3d种子生出芽，将芽切成3～4mm的小段。取25mL MS培养基向其中加入0.1mg的2，4-D，加入0.0025mg的KT，加入0.75g蔗糖，加入0.25g琼脂，配成愈伤组织培养基，用浓度为1mol/L的NaOH调节pH为6.5。将小芽小段置于上述培养中进行培养。培养条件为：温度25℃、避光培养、培养20d后，在培养皿上布满甘草愈伤组织。

按鲜重计将6g愈伤组织转入60mL细胞培养基中，该细胞培养基是由60mL的MS培养基，并加入0.24mg 2，4-D，0.006mg KT，加入1.8g蔗糖组成，再浓度为1mol/L的NaOH调节该细胞培养基的pH为6.5。培养条件为：温度为26℃，摇床转速100r·min^-1，光照强度为1500lux，光照时间为12h·d^-1。悬浮培养7d后，对悬浮液进行过滤，滤除较大的细胞团及未完全愈伤化的组织得到分散性较好的细胞悬浮液60mL，将细胞悬浮液均分等份，每份20mL，再向每份悬浮液也中加入60mL细胞培养基，在培养条件为：温度为26℃，摇床转速100r·min^-1，光照强度为1500lux，光照时间为12h·d^-1的培养条件下进行第一次继代培养。继续培养20d后，将继代一次的悬浮液均分等份，每份20mL，加入60mL细胞培养基进行第二次继代培养。以此做法进行5次继代培养，得到细胞产量按细胞干重计为7g/L的细胞悬浮液。

将得到的细胞产量按细胞干重计为7g/L的细胞悬浮液1L转移到5L搅拌桨式反应器中，加入细胞培养基2L。该细胞培养基由2L MS基本培养基，和所加入的8mg 2，4-D，0.2mg KT，60g蔗糖组成，用浓度为1mol/L的NaOH调节该细胞培养基的pH为5.8。在培养温度为25℃，光照强度为1500lux，光照时间为12h/d，搅拌速率为100r/min，通入空气，通气量为2.5L/min的培养条件下培养30d后收获细胞。

实例四：

将甘草的种子4g，用质量浓度为75％乙醇浸泡10～15秒后，经灭菌的去离子水冲洗2遍，再用质量浓度为2％次氯酸钠溶液浸泡15分钟，然后经灭菌的去离子水冲洗2遍，将其接种于20mL MS培养基中固体培养，培养条件为：温度28℃、光照强度为2000lux、光照时间为12h/d，培养约3d种子生出芽，将芽切成3～4mm的小段。取25mL MS培养基向其中加入0.075mg的2，4-D，加入0mg的KT，加入0.75g蔗糖，加入0.25g琼脂，配成愈伤组织培养基，用浓度为1mol/L的NaOH调节pH为7.5。将小芽小段置于上述培养中进行培养。培养条件为：温度28℃、避光培养、培养20d后，在培养皿上布满甘草愈伤组织。

按鲜重计将6g愈伤组织转入80mL细胞培养基中，该细胞培养基是由60mL的MS培养基，并加入0.24mg 2，4-D，0mg KT，加入2.4g蔗糖组成，再浓度为1mol/L的NaOH调节该细胞培养基的pH为7.5。培养条件为：温度为28℃，摇床转速110r·min^-1，光照强度为2000lux，光照时间为12h·d^-1。悬浮培养7d后，对悬浮液进行过滤，滤除较大的细胞团及未完全愈伤化的组织得到分散性较好的细胞悬浮液80mL，将细胞悬浮液均分等份，每份20mL，再向每份悬浮液也中加入80mL细胞培养基，在培养条件为：温度为28℃，摇床转速110r·min^-1，光照强度为2000lux，光照时间为12h·d^-1的培养条件下进行第一次继代培养。继续培养20d后，将继代一次的悬浮液均分等份，每份20mL，加入80mL细胞培养基进行第二次继代培养。以此做法进行5次继代培养，得到细胞产量按细胞干重计为9g/L的细胞悬浮液。

将得到的细胞产量按细胞干重计为9g/L的细胞悬浮液1L转移到5L搅拌桨式反应器中，加入细胞培养基2L。该细胞培养基由2L MS基本培养基，和所加入的6mg 2，4-D，0mg KT，60g蔗糖组成，用浓度为1mol/L的NaOH调节该细胞培养基的pH为7.5。在培养温度为28℃，光照强度为2000lux，光照时间为12h/d，搅拌速率为130r/min，通入空气，通气量为4L/min的培养条件下培养30d后收获细胞。

Claims

1.一种甘草细胞产业化的培养方法，其特征在于包括以下过程：

1).将甘草的种子用质量浓度为70％～75％乙醇浸泡10～15秒后，经灭菌的去离子水冲洗2～4遍，再用质量浓度为2％次氯酸钠溶液浸泡15～20分钟，然后经灭菌的去离子水冲洗2～4遍，将其接种于Murashige&Skoog培养基中固体培养，在培养温度为23℃～28℃光照强度为800～2000lux，光照时间为12h/d的培养条件下培养3～5d后种子生出芽，将芽切成小段，转接到愈伤组织培养基中进行培养，所述的愈伤组织培养基由为MS培养基与按每升MS培养基加入1～4mg的2，4-二氯苯氧乙酸、加入0～2mg激动素、加入30～60g蔗糖和加入8～10g琼脂组成，用浓度为1mol/L的NaOH或质量浓度为10％的HCl调节细胞培养基的pH为4.5～7.5，之后在温度为23℃～28℃下避光培养，培养20～25d后，甘草愈伤组织布满培养皿；

2).按每克愈伤组织与细胞培养基的毫升体积量1∶10～20的比例，将愈伤组织碎片转入培养基中进行液体悬浮培养，所述的细胞培养基由MS培养基与按每升培养基加入1～4mg的2，4-二氯苯氧乙酸、加入0～2mg的激动素和加入的30～60g蔗糖组成，用浓度为1mol/L的NaOH或质量浓度为10％的HCl调节细胞培养基的pH为4.5～7.5，在温度为23℃～28℃，光照强度为800～2000lux，光照时间为12h/d，摇床转速为90～120r·min^-1的条件下悬浮培养4～7d后，对悬浮液进行过滤，滤除较大的细胞团及未完全愈伤化的组织，在得到的分散性较好的细胞悬浮液中，按照细胞悬浮液体积量与加入的细胞培养基的体积量的比为1∶2～5的比例加入细胞培养基，继代培养20～25d后，在继代细胞悬浮液中，按照继代细胞悬浮液体积量与加入的细胞培养基的体积量比为1∶2～5的比例加入细胞培养基得到继代两次的细胞悬浮液，以此继代方法进行5次继代，得到细胞产量按细胞干重计为3～10g/L的细胞悬浮液；

3).取步骤2)得到的每升含按干重计3～10g细胞的细胞悬浮液1～1.5L转移到5L搅拌桨式反应器中，按照细胞悬浮液的体积量与细胞培养基的体积量的比例为1∶1～3向反应器中加入细胞培养基，在温度为23℃～28℃，光照强度为800～2000lux，光照时间为12h/d，搅拌速率为80～130r/min，通入空气，通气量为1.5～4L/min的培养条件下进行培养20～30d后收获甘草细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞产量按细胞干重计为15～40g/L。