CN106358762A

CN106358762A - 一种沉水樟替代牛樟木繁育樟芝的培育方法

Info

Publication number: CN106358762A
Application number: CN201610808441.3A
Authority: CN
Inventors: 王宫; 马建煜; 陈耀金
Original assignee: FUJIAN INSTITUTE OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Current assignee: FUJIAN INSTITUTE OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Priority date: 2016-09-08
Filing date: 2016-09-08
Publication date: 2017-02-01

Abstract

本发明提供一种沉水樟替代牛樟木繁育樟芝的培育方法，其包括菌种培养基制作、菌种分离和扩繁、培养载体、接菌、菌丝生长、子实体生长步骤。本发明的樟芝培育方法的优点有：沉水樟替代牛樟，解决资源匮乏和多途径培育樟芝的方法；培育方法简单，可实现产业化、标准化生产，降低生产成本，且培育时间短。本发明选用多年生沉水樟木作为菌床培育子实体，同时对菌种进行改良，使其更适应这种菌床生长，从而可保证出菇率，提高经济效益。所得樟芝子实体与牛樟芝子实体 DNA 检测相同率达 99%，且色泽接近，指纹图谱极其相似。

Description

一种沉水樟替代牛樟木繁育樟芝的培育方法

技术领域

本发明涉及菌类培育领域，特别涉及一种沉水樟替代牛樟木繁育樟芝的培育方法。

背景技术

牛樟芝又名牛樟菇，是生长在牛樟树上的一种珍贵的药用真菌，牛樟芝中含有多糖体、萜类化合物、超氧歧化酶和核酸类等多种成分，具有解毒保肝、抗癌、强化免疫、抗过敏、降血脂等多种功效，受到人们的极大欢迎。目前牛樟芝的人工栽培方法包括牛樟树段木栽培法、固态栽培法和液体发酵法。所培育出来的牛樟芝不论从形态、气味、功效成分以及药效都存在明显的不同和差异，段木栽培法生产的牛樟芝子实体含量高、药效好，是其他方法培育的牛樟芝所无法媲美的，但是，牛樟木资源匮乏，在台湾属于保护品种，禁止砍伐。因此，导致牛樟芝产量低、价格昂贵，无法满足一般民众的需求，所以，寻求牛樟木替代品培育牛樟芝成为众多学者研究的课题。目前，有使用寮国樟、福杉作为载体繁育樟芝的案例，但沉水樟与牛樟，无论生长环境还是属性都非常接近，在台湾也有“牛樟”的叫法。沉水樟替代牛樟木繁育樟芝是利用樟芝原有宿主牛樟树或沉水樟为培养基栽培樟芝；希望获得与牛樟芝相同之成分，功效相同，避免野生牛樟树被盗伐，降低生产成本、增加产量，为更多的百姓服务，提高健康水平。

发明内容

为解决上述传统牛樟芝的人工栽培方法所存在的问题，需要提供一种沉水樟替代牛樟木繁育樟芝的培育方法。为此，发明人提供了如下技术方案：

一种沉水樟替代牛樟木繁育樟芝的培育方法，其包括菌种培养基制作、菌种分离和扩繁、培养载体、接菌、菌丝生长、子实体生长步骤。进一步，所述菌种培养基制作包括母种培养基制备，及原种或栽培种培养基的制备。本发明中，从母种开始培养菌种，保证菌种的质量及产率；同时，所得樟芝子实体与牛樟芝子实体 DNA 检测相同率达 99%，且色泽接近，指纹图谱极其相似。更进一步，所述母种培养基制备包括以下步骤：

1）称取以下重量份数的组分：基材 150-250 份；葡萄糖 10-30 份；琼脂 10-30 份；所述基材为下列中的一种：马铃薯、玉米糁、杂交米或麦粒；

本发明中母种培养基采用上述的组分，营养丰富、均衡，可提高母种的成活率。

2）将基材加水煮沸 20-30 min，过滤，去滤液，往滤饼中加入琼脂，加热并搅拌，使琼脂全部溶解，再往滤饼中加入葡萄糖，搅拌溶解后加水将溶液补足到 1000重量份；

3）然后将溶液分装试管，每管装1/4-1/3试管高度，塞上棉塞，在 110-130℃灭菌 25-35 min，取出摆成斜面，冷却凝固待用。更进一步，所述步骤 1）中的组分还包括磷酸二氢钾2-5 重量份、硫酸镁1-4 重量份和维生素 B1 0.01-0.1 重量份；步骤 2）往滤饼中加入琼脂的同时，也将上述组分全部加入滤饼中一起搅拌溶解。本发明中，在母种培养基中加入上述组分，可大大缩短母种的培养时间，所述磷酸二氢钾组分还可以促使菌丝生长的更加强壮。

进一步，所述原种或栽培种培养基的制备方法包括以下步骤：

1）称取以下重量份数的组分：牛樟树木屑 65-85 份；麸皮 10-30 份；玉米面 3-10份；过磷酸钙 0.5-1.5 份；石灰 1-4 份；

2）将上述组分与水按质量比 1:1.3 混合搅匀后装瓶或装袋，封口后在110℃-130℃下灭菌 1.5～2 h，冷却待用。

本发明通过原种培养基或栽培种培养基将母种培养成原种或栽培种，从而实现母种的放大培育；同时，还可以对母种进行稀释，因为若采用纯母种栽培，母种用量大，成本高，菌丝发菌时间长。进一步，所述菌种分离和扩繁的操作包括以下步骤：获取牛樟芝，在接种箱中切粒装入母种培养基的试管中，在 0℃下培养三个月，得到牛樟芝母种；所述牛樟芝颗粒重 0.3-0.5g；采用这样大小的母种进行培养，再生能力强，成活率可达到 90%-100%，可大大提高母种成活率。

将牛樟芝母种接入装有原种培养基的培养瓶中，在 10-15℃下避光培养5-8 个月，得到牛樟芝原种；将一只试管获得母种平均接入 3～5 瓶装有原种培养基的培养瓶，每个培养瓶装的培养液量为 20ml；

将牛樟芝原种接入装有栽培种培养基的培养袋中，在 10-15℃下避光培养5-8 个月，得到牛樟芝栽培菌种；将一培养瓶获得的原种平均接入 20～30 袋装有栽培种培养基的培养袋，每个培养袋中装的固体栽培培养基为 500g。

本发明菌种分离和扩繁步骤中，作为培育母种的牛樟芝，可以是天然成长的牛樟芝，还可以是经过本发明培育方法培育的樟芝，三萜含量接近。

进一步，所述载体培养包括以下步骤：

1）选择大小适当的木头，将木头表面清除干净并以砂轮磨平，清水冲洗干净；

2）将加工好的木头放入水池浸泡，每天换水，浸泡5-10天；

3）将浸泡后的木头放入灭菌器，在温度为110-130℃、压力为0.1-0.2MPa的条件下，灭菌 1-3小时，灭菌结束后，取出，冷却。

4）接菌：将牛樟芝栽培菌种涂在冷却的木头上，用塑料袋装好，密封。

5）所述菌丝生长的条件为：将接菌后的木头用塑料袋装好避光放在层架上，控制环境温度为 20-28℃，湿度 65%-75%，培养 90~130 天。

6）子实体生长步骤具体操作为：脱袋出菇后，将木头放入培养房，暗房避光，保持室内空气流通，且空气湿度为 65%-75%，培养 20-24 个月，直至牛樟芝子实体停止生长，然后进行采收。

与现有技术相比，本发明樟芝培育方法具有以下优点：

1、培育方法简单，可实现产业化、标准化生产，从而方便扩大生产，降低生产成本。

2、本发明由于选用沉水樟作为菌床，使用改良后的菌种，提高其适应性，有利于子实体的生长，提高经济效益。

3、采用本发明的培育方法，所得樟芝子实体与牛樟芝子实体 DNA 检测相同率达99%，指纹图谱极其相似。

4、利用本发明的培育方法，无需采用牛樟木为菌床，可以节约牛樟木的使用，菌床材料容易取得，成本低，有效降低成本。

附图说明

图1沉水樟芝图谱。

图2椴木子实体图谱。

图3牛樟芝标准图谱。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。

实施例 1

一种沉水樟替代牛樟木繁育樟芝的培育方法，其包括以下步骤：

步骤 1：菌种培养基制作，其包括母种培养基制备，及原种或栽培种培养基的制备，具体为：

所述母种培养基制备包括以下步骤：

1）称取以下重量份数的组分：

基材杂交米 250 份；葡萄糖 10 份；琼脂 30 份；磷酸二氢钾 2 份；硫酸镁 4 份；维生素 B1 0.01 份；

2）将基材加水煮沸 20min，过滤，往滤饼中加入琼脂、磷酸二氢钾、硫酸镁和维生素B1，加热并搅拌，使固体全部溶解，再往溶液中加入葡萄糖，搅拌溶解后加水将溶液补足到1000 重量份；

3）然后将溶液分装试管，每管装1/3 试管高度，塞上棉塞，在 110℃灭菌 35 min，取出摆成斜面，冷却凝固待用。

所述原种或栽培种培养基的制备方法包括以下步骤：

1）称取以下重量份数的组分：

牛樟树木屑 65 份；麸皮 30 份；玉米面 3 份；过磷酸钙 1.5 份；石灰 1 份；

2）将上述组分与水按质量比 1:1.3 混合搅匀后装瓶或装袋，封口后在110℃℃下灭菌2 h ,冷却待用。

步骤 2 ：菌种分离和扩繁，具体包括以下步骤：

1）获取牛樟芝，在接种箱中切粒装入母种培养基的试管中，在 0℃下培养三个月，得到牛樟芝母种；所述牛樟芝颗粒重 0.3g；采用这样大小的母种进行培养，再生能力强，成活率可达到 90%-100%，可大大提高母种成活率。

2）将牛樟芝母种接入装有原种培养基的培养瓶中，在 12℃下避光培养 8 个月，得到牛樟芝原种；所述一只试管的母种平均接入 5 瓶装有原种培养基的培养瓶，每个培养瓶装的培养液量为 20ml；

3）将牛樟芝原种接入装有栽培种培养基的培养袋中，在 12℃下避光培养 5 个月，得到牛樟芝栽培菌种；所述一培养瓶原种平均接入 30 袋装有栽培种培养基的培养袋。

步骤 3：培养载体，具体包括以下步骤：

2）将加工好的木头放入水池浸泡，每天换水，浸泡5天；

3）将浸泡后的木头放入灭菌器，在温度为130℃、压力为0.1MPa的条件下，灭菌 3小时，灭菌结束后，取出，冷却。

步骤4接菌：将牛樟芝栽培菌种涂在冷却的木头上，用塑料袋装好，密封。

步骤5所述菌丝生长的条件为：将接菌后的木头用塑料袋装好避光放在层架上，控制环境温度为 28℃左右，湿度75%，培养 90 天。

步骤6子实体生长步骤具体操作为：脱袋出菇后，将木头放入培养房，暗房避光，保持室内空气流通，且空气湿度为 75%，培养 20个月，直至牛樟芝子实体停止生长，然后进行采收。

实施例 2

一种可提高三萜含量的牛樟芝培育方法，其包括以下步骤：

步骤 1 ：菌种培养基制作，其包括母种培养基制备，及原种或栽培种培养基的制备，具体为所述母种培养基制备包括以下步骤：

1）称取以下重量份数的组分：

基材玉米糁 150 份；葡萄糖 30 份；琼脂 10 份；磷酸二氢钾 5 份；硫酸镁 1 份；维生素 B1 0.1 份；

2）将基料加水煮沸 30 min，过滤，往滤饼中加入琼脂、磷酸二氢钾、硫酸镁和维生素B1，加热并搅拌，使固体全部溶解，再往溶液中加入葡萄糖，搅拌溶解后加水将溶液补足到1000 重量份；

3）然后将溶液分装试管，每管装 1/4试管高度，塞上棉塞，在 130℃灭菌 25 min，取出摆成斜面，冷却凝固待用。

所述原种或栽培种培养基的制备方法包括以下步骤：

1）称取以下重量份数的组分：

牛樟树木屑 85 份；麸皮 10 份；玉米面 10 份；过磷酸钙 0.5 份；石灰 4 份；

2）将上述组分与水按质量比 1:1.3 混合搅匀后装瓶或装袋，封口后在130℃下灭菌1.5 h ,冷却待用。

步骤 2 ：菌种分离和扩繁，具体包括以下步骤：

1）获取牛樟芝，在接种箱中切粒装入母种培养基的试管中，在 0℃下培养三个月，得到牛樟芝母种；所述牛樟芝颗粒重 0.5g；采用这样大小的母种进行培养，再生能力强，成活率可达到 90%-100%，可大大提高母种成活率。

2）将牛樟芝母种接入装有原种培养基的培养瓶中，在 10℃下避光培养 8 个月，得到牛樟芝原种；所述一只试管的母种平均接入 3 瓶装有原种培养基的培养瓶，每个培养瓶装的培养液量为 20ml；

3）将牛樟芝原种接入装有栽培种培养基的培养袋中，在 10℃下避光培养 5 个月，得到牛樟芝栽培菌种；所述一培养瓶原种平均接入 20 袋装有栽培种培养基的培养袋。

步骤 3 ：培养载体，具体包括以下步骤：

2）将加工好的木头放入水池浸泡，每天换水，浸泡五天以上；

步骤 4接菌：将牛樟芝栽培菌种涂在冷却的木头上，用塑料袋装好，密封。

步骤 5所述菌丝生长的条件为：将接菌后的木头用塑料袋装好避光放在层架上，控制环境温度为 28℃，湿度 75%，培养 90 天。

步骤 6子实体生长步骤具体操作为：脱袋出菇后，将木头放入培养房，暗房避光，保持室内空气流通，且空气湿度为 75%，培养 20个月，直至牛樟芝子实体停止生长，然后进行采收。

实施例3

一种沉水樟替代牛樟木繁育樟芝的培育方法，其包括菌种培养基制作、菌种分离和扩繁、载体培养、接菌、菌丝生长、子实体生长步骤。

所述菌种培养基制作包括母种培养基制备及原种或栽培种培养基的制备。

所述母种培养基制备包括以下步骤：

1）称取以下重量份数的组分：基材200 份；葡萄糖20份；琼脂 20份；

所述基材为麦粒；

2）将基材加水煮沸 25 min，过滤，去掉滤液，往滤饼中加入琼脂，加热并搅拌，使琼脂全部溶解，再往滤饼中加入葡萄糖，搅拌溶解后加水将溶液补足到 1000重量份；

3）然后将溶液分装试管，每管装1/3 试管高度，塞上棉塞，在120℃灭菌20min，取出摆成斜面，冷却凝固待用。

所述步骤 1）中的组分还包括磷酸二氢钾 4重量份、硫酸镁3 重量份和维生素B10.05 重量份；步骤 2）往滤饼中加入琼脂的同时，也将上述组分全部加入滤饼中一起搅拌溶解。

所述原种或栽培种培养基的制备方法包括以下步骤：

1）称取以下重量份数的组分：牛樟树木屑75份；麸皮20份；玉米面6份；过磷酸钙1份；石灰2份；

2）将上述组分与水按质量比1:1.3混合搅匀后装瓶或装袋，封口后在120℃下灭菌2 h，冷却待用。

所述菌种分离和扩繁的操作包括以下步骤：

（1）获取牛樟芝，在接种箱中切成颗粒装入母种培养基的试管中，在0℃下培养三个月，得到牛樟芝母种，所述牛樟芝颗粒重 0.4g；将牛樟芝母种接入装有原种培养基的培养瓶中，在12℃下避光培养7个月，得到牛樟芝原种，将一只试管获得母种平均接入 4 瓶装有原种培养基的培养瓶；

（2）将牛樟芝原种接入装有栽培种培养基的培养袋中，在12℃下避光培养7 个月，得到牛樟芝栽培菌种；将一培养瓶获得的原种平均接入25 袋装有栽培种培养基的培养袋，每个培养袋中装的固体栽培培养基为 500g。

所述载体培养包括以下步骤：

1）选择木头，将木头表面清除干净并以砂轮磨平，清水冲洗干净；

2）将加工好的木头放入水池浸泡，每天换水，浸泡8天；

3）将浸泡后的木头放入灭菌器，在温度为120℃、压力为0.2MPa的条件下，灭菌2小时，灭菌结束后，取出，冷却。

所述接菌为将牛樟芝栽培菌种涂在冷却的木头上，用塑料袋装好，密封。

所述菌丝生长的步骤为：将接菌后的木头用塑料袋装好避光放在层架上，控制环境温度为 25℃，湿度 70%，培养 110天。

所述子实体生长为：脱袋出菇后，将木头放入培养房，暗房避光，保持室内空气流通，且空气湿度为70%，培养22个月，直至牛樟芝子实体停止生长，然后进行采收。

经 DNA 检测，本发明实施例 1-3培育的牛樟芝子实体与野生牛樟芝子实体 DNA相同率达 99%。

台湾牛樟芝标准菌（BCRC35396）之ITS序列:

CTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGTATTTGAAAGGGGTTGTAGCTGACCTCCTCTTGAAAAGGGGGGAGGTATGTGCACACCTCTGTTCATTCATATTCTCTCACACCTGTGCATGCTTTGTAGGTTGGTTTTGAATGGTTGTCTTCTCTGATGGAGACAGCTGTTTTGACCTTCCTATGTTTTTTAAATTGACTCCGTATCAGTTACAGAATGTATGTTGCGTGTAACGCATATTGTATAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACACGGCGAAATGTGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCTGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGGAATTATCAACCCTTTTGACTTTTTGTTGAATGGGCTTGGATTTGGAGGGTTAAATTGCTGGCTCTTCTTTTTGATTCAGCTCCTCTTGAATGCATTAGCTTGAACCCTTGTGGATTGACCTTATCGGTGTGATAGTCATCTATGCCGTGGTTGTCTGAGGTGGGATCGGCTTCTAATGGTGCAAGTCCCTTCAGGGGGATGATTTTCTAATGACCTTCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAG

牛樟芝标准菌（AC620）之ITS序列:

TCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAGTCCTACCTGATTTGAGGTCAGAAGGTCATTAGAAAATCATCCCCCTGAAGGGACTTGCACCATTAGAAGCCGATCCCACCTCAGACAACCACGGCATAGATGACTATCACACCGATAAGGTCAATCCACAAGGGTTCAAGCTAATGCATTCAAGAGGAGCTGAATCAAAAAAAAAGAGCCAGCAATTTAACCCTCCAAATCCAAGCCCATTCAACAAAAAGTCAAAAGGGTTGATAATTCCATGACACTCAAACAGGCATGCTCCTCAGAATACCAAGGAGCGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCACATTTCGCCGTGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGCTGAAAGTTATACAATATGCGTTACACGCAACATACATTCTGTAACTGATACGGAGTCAATTTAAAAAACATAGGAAGGTCAAAACAGCTGTCTCCATCAGAGAAGACAACCATTCAAAACCAACCTACAAAGCATGCACAGGTGTGAGAGAATATGAATGAACAGAGGTGTGCACATACCTCCCCCCTTTTCAAGAGGAGGTCAGCTACAACCCCTTTCAAATACAATAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA

检测单位：国家菌草工程技术研究中心

结论：本实验相似度99%，与台湾图谱一致。

经指纹图谱鉴定，沉水樟芝与牛樟芝极其相似。

本发明的培育方法简单，可实现产业化、标准化生产，从而方便扩大生产，降低生产成本。

本发明的培育方法无需采用牛樟树为菌床，可以节约牛樟木的使用，改用沉水樟作为菌床材料，资源相对广泛，比较容易取得，成本不高，可有效降低成本，容易推广和普及。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省中医药研究院

<120> 一种沉水樟替代牛樟木繁育樟芝的培育方法

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 676

<212> DNA

<213> 台湾牛樟芝标准菌（BCRC35396）之ITS序列

<400> 1

cttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat tattgtattt gaaaggggtt gtagctgacc 60

tcctcttgaa aaggggggag gtatgtgcac acctctgttc attcatattc tctcacacct 120

gtgcatgctt tgtaggttgg ttttgaatgg ttgtcttctc tgatggagac agctgttttg 180

accttcctat gttttttaaa ttgactccgt atcagttaca gaatgtatgt tgcgtgtaac 240

gcatattgta taactttcag caacggatct cttggctctc gcatcgatga agaacacggc 300

gaaatgtgat aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac 360

cttgcgctcc ttggtattct gaggagcatg cctgtttgag tgtcatggaa ttatcaaccc 420

ttttgacttt ttgttgaatg ggcttggatt tggagggtta aattgctggc tcttcttttt 480

gattcagctc ctcttgaatg cattagcttg aacccttgtg gattgacctt atcggtgtga 540

tagtcatcta tgccgtggtt gtctgaggtg ggatcggctt ctaatggtgc aagtcccttc 600

agggggatga ttttctaatg accttctgac ctcaaatcag gtaggactac ccgctgaact 660

taagcatatc aataag 676

<210> 2

<211> 682

<212> DNA

<213> 牛樟芝标准菌（AC620）之ITS序列

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc ttaagttcag cgggtagtcc tacctgattt gaggtcagaa 60

ggtcattaga aaatcatccc cctgaaggga cttgcaccat tagaagccga tcccacctca 120

gacaaccacg gcatagatga ctatcacacc gataaggtca atccacaagg gttcaagcta 180

atgcattcaa gaggagctga atcaaaaaaa aagagccagc aatttaaccc tccaaatcca 240

agcccattca acaaaaagtc aaaagggttg ataattccat gacactcaaa caggcatgct 300

cctcagaata ccaaggagcg caaggtgcgt tcaaagattc gatgattcac tgaattctgc 360

aattcacatt acttatcaca tttcgccgtg ttcttcatcg atgcgagagc caagagatcc 420

gttgctgaaa gttatacaat atgcgttaca cgcaacatac attctgtaac tgatacggag 480

tcaatttaaa aaacatagga aggtcaaaac agctgtctcc atcagagaag acaaccattc 540

aaaaccaacc tacaaagcat gcacaggtgt gagagaatat gaatgaacag aggtgtgcac 600

atacctcccc ccttttcaag aggaggtcag ctacaacccc tttcaaatac aataatgatc 660

cttccgcagg ttcacctacg ga 682

Claims

1.一种沉水樟替代牛樟木繁育樟芝的培育方法，其特征在于：其包括菌种培养基制作、菌种分离和扩繁、载体培养、接菌、菌丝生长、子实体生长步骤。

2.根据权利要求 1 所述的一种沉水樟替代牛樟木繁育樟芝的培育方法，其特征在于：所述菌种培养基制作包括母种培养基制备及原种或栽培种培养基的制备。

3.根据权利要求 2 所述的一种沉水樟替代牛樟木繁育樟芝的培育方法，其特征在于：所述母种培养基制备包括以下步骤：

1）称取以下重量份数的组分：基材150-250 份；葡萄糖 10-30 份；琼脂 10-30份；

所述基材为下列中的一种：马铃薯、玉米糁、杂交米或麦粒；

2）将基材加水煮沸 20-30 min，过滤，去掉滤液，往滤饼中加入琼脂，加热并搅拌，使琼脂全部溶解，再往滤饼中加入葡萄糖，搅拌溶解后加水将溶液补足到 1000重量份；

3）然后将溶液分装试管，每管装 1/4-1/3 试管高度，塞上棉塞，在110-130℃灭菌25-35 min，取出摆成斜面，冷却凝固待用。

4.根据权利要求 3 所述的一种沉水樟替代牛樟木繁育樟芝的培育方法，其特征在于：所述步骤 1）中的组分还包括磷酸二氢钾 2-5 重量份、硫酸镁1-4 重量份和维生素B10.01-0.1 重量份；步骤 2）往滤饼中加入琼脂的同时，也将上述组分全部加入滤饼中一起搅拌溶解。

5.根据权利要求 2 所述的一种沉水樟替代牛樟木繁育樟芝的培育方法，其特征在于：所述原种或栽培种培养基的制备方法包括以下步骤：

1）称取以下重量份数的组分：牛樟树木屑65-85份；麸皮10-30份；玉米面3-10份；过磷酸钙0.5-1.5份；石灰1-4份；

2）将上述组分与水按质量比1:1.3混合搅匀后装瓶或装袋，封口后在110℃-130℃下灭菌 1.5～2 h，冷却待用。

6.根据权利要求 1所述的一种沉水樟替代牛樟木繁育樟芝的培育方法，其特征在于：所述菌种分离和扩繁的操作包括以下步骤：

（1）获取牛樟芝，在接种箱中切成颗粒装入母种培养基的试管中，在0℃下培养三个月，得到牛樟芝母种，所述牛樟芝颗粒重 0.3-0.5g；将牛樟芝母种接入装有原种培养基的培养瓶中，在10-15℃下避光培养5-8个月，得到牛樟芝原种，将一只试管获得母种平均接入 3～5 瓶装有原种培养基的培养瓶；

（2）将牛樟芝原种接入装有栽培种培养基的培养袋中，在10-15℃下避光培养5-8 个月，得到牛樟芝栽培菌种；将一培养瓶获得的原种平均接入20～30 袋装有栽培种培养基的培养袋，每个培养袋中装的固体栽培培养基为 500g。

7.根据权利要求 1 所述的一种沉水樟替代牛樟木繁育樟芝的培育方法，其特征在于：所述载体培养包括以下步骤：

2）将加工好的木头放入水池浸泡，每天换水，浸泡5-10天；

8.根据权利要求 1所述的一种沉水樟替代牛樟木繁育樟芝的培育方法，其特征在于：所述接菌为将牛樟芝栽培菌种涂在冷却的木头上，用塑料袋装好，密封。

9.根据权利要求1所述的一种沉水樟替代牛樟木繁育樟芝的培育方法，其特征在于：所述菌丝生长的步骤为：将接菌后的木头用塑料袋装好避光放在层架上，控制环境温度为20-28℃，湿度 65%-75%，培养 90~130 天。

10.根据权利要求 1所述的一种沉水樟替代牛樟木繁育樟芝的培育方法，其特征在于：所述子实体生长为：脱袋出菇后，将木头放入培养房，暗房避光，保持室内空气流通，且空气湿度为 65%-75%，培养 20-24个月，直至牛樟芝子实体停止生长，然后进行采收。