CN106342900A - 一种泾阳链霉菌可湿性粉剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种泾阳链霉菌可湿性粉剂的制备方法，利用高岭土做为载体，以沼泽红假单胞菌，玉米淀粉与豆粕粉做为营养剂发酵而成的高浓度泾阳链霉菌菌粉，按泾阳链霉菌发酵菌粉90‑95份；润湿剂：十二烷基苯磺酸钠1‑4份；分散剂：茶皂素 0.2‑1份；紫外保护剂：抗坏血酸0.5‑2份，β‑糊精0.2‑1份；干燥保护剂：麦芽糖1‑4份，甘露醇0.2‑1份的比例制成一种稳定的，菌含量超过100亿CFU/g的泾阳链霉菌可湿性粉剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种泾阳链霉菌可湿性粉剂的制备方法，属于农业微生物与生物农药技术领域。
背景技术
泾阳链霉菌(Streptomycesjingyangensis)是一种放线菌，俗称5406。泾阳链霉菌的代谢活动能促进有机物分解，使养分有效化，同时能释放抗菌物质，从而能有效地防止多种作物病虫害,并能产生刺激植物生长的激素，它还能促进土壤团聚体的形成，具有促进腐殖质的形成和产生多糖的能力。这种抗生菌已在多种农作物上广泛使用。链霉菌是最具生防价值的放线菌，链霉菌属中的许多种对植物病原菌有拮抗作用。目前已筛选出了10多种最具生防价值的链霉菌。泾阳链霉菌对黄萎病菌、枯萎病菌、立枯病菌、猝倒病菌等多种植物病害具有抗性，且可促进植物生长。泾阳链霉菌是一株优良的生物肥料与生物农药菌株，随着设施农业的发展，特别是滴灌***的出现，现有的菌粉不适合使用；尽管李亚宁等在专利号201110375945.8中公开了一种以硅藻土为基质的玫瑰黄链霉菌生物杀菌剂的可湿性粉剂，其组分及含为：玫瑰黄链霉菌菌株式会0116繁殖体≥108个；润湿分散剂4%。闫震等以玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63的种子液为试验材料，找到适宜的润湿分散剂为木质素磺酸钠，添加此助剂后样品的悬浮率最大可达50.27%。99.97%样品细度〈44μm，水分减量〈1.5%，润湿时间〈18s。最后检测了玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活菌的可湿性粉剂对大棚内甜瓜白粉病的田间防效。结果表明，其防治效果高达87%。
但泾阳链霉菌的可湿性粉剂的制备方法还未有报道，泾阳链霉菌的培养与研究在上世纪60-70年代研究较多，大部分是在肥土中进行发酵，但我们经过试验发现，在中国大部分土壤经过近三十多年的重施化肥，少施有机肥的现状下，肥土的获得已经没有以前方便而且稳定，我们在全国20多个省拿到的土地样进行发酵试验，结果发现利用现有的工艺发酵后，泾阳链霉菌的孢子含量最高的都没有过20亿CFU/g的，而且肥土发酵中会残存大量的害虫，无法杀灭，如果施入健康土壤中会引起害虫的传播，另外肥土不适宜做可湿性粉剂的载体。现有的链霉菌的可湿性粉剂中菌体含量过低。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种菌体含量高，生产工艺稳定的泾阳链霉菌可湿性粉剂及其制备方法，所述泾阳链霉菌可湿性粉剂由下列重量份组成：泾阳链霉菌发酵菌粉90-95份；润湿剂：十二烷基苯磺酸钠1-4份；分散剂：茶皂素 0.2-1份；紫外保护剂：抗坏血酸0.5-2份，β-糊精0.2-1份；干燥保护剂：麦芽糖1-4份，甘露醇0.2-1份；其具体制备方法，由以下几步骤组成：
一、泾阳链霉菌发酵菌粉的制备
取出菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养4-5天。在平板下挑取单个菌落接种至茄子瓶中高氏一号固体培养基上，涂满整个茄子瓶，在培养箱中30℃培养4-6天，等菌体表面有浅粉红色孢子即可，将1L无菌水将茄子瓶中的菌苔洗下，将洗下的泾阳链霉菌接种于装有350L 泾阳链霉菌液体培养基的 500L 种子发酵罐，初始 pH值为7.2，温度为 30℃，通风 1:1，开搅拌，转速为200r/min；培养36-48小时，待菌体变粘稠，有大量菌丝产生，即可作为泾阳链霉菌液体菌种；
将泾阳链霉菌以10%的接种量接种至固体发酵培养基中，混匀摊至发酵托盘中，固体发酵培养基的厚度为3-5cm，28-32℃培养2-3天，待固体发酵培养基长出大量白色菌点，孢子含量超过105亿cfu/g，即可风干至水份含量低于4%即可；
其中，所述固体发酵培养基的配比为：高岭土：玉米淀粉：豆粕粉：沼泽红假单胞菌液=100：2：2：20；
其中，所述高氏一号培养基：淀粉 20g、NaCl 0.5g、KNO3 1g、KH2PO4·3H2O 0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、MgSO4·7H2O 0.5g、琼脂 18g、水 1000ml；
其中，所述泾阳链霉菌液体培养基：葡萄糖20 g/L，豆粕粉20 g/L，氯化钠5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，碳酸钙2 g/L，pH7.2；
各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
其中，沼泽红假单胞菌菌液的制备：取出沼泽红假单胞菌种保藏管，用沼泽红假单胞菌固体培养基划平板进行复苏，在光照培养箱中30℃培养72小时。光照强度：1000lex-6000lex。在平板下挑取单个菌落接种50毫升沼泽红假单胞菌液体培养基中，在光照培养箱中30℃厌氧培养120小时。种子采用20%的接种量，接种至装有4L的沼泽红假单胞菌液体培养基的5L大三角瓶，在光照培养箱中30℃厌氧培养72-96小时，检测其菌液浓度，菌含量超过30亿CFU/ml，即可作为沼泽红假单胞菌菌液。其中所述沼泽红假单胞菌固体培养基：磷酸二氢钾1g，氯化钙0.1g，碳酸钠3g，醋酸钠1g，氯化镁0.5g，氯化铵1g，氯化钠1g，琼脂20g，pH7.5，水1000mL。其中所述沼泽红假单胞菌液体培养基：磷酸二氢钾1g，氯化钙0.1g，碳酸氢钠2g，醋酸钠4g，氯化镁0.5g，氯化铵1g，氯化钠1g，微量元素10mL, pH7.5，水1000mL。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；其中，微量元素的配制：一水硫酸锰 4 g，硼酸 2 g，二水钼酸钠0.05g，五水硫酸铜 0.005g，六水氯化钴 0.05g,水1000mL。
二、将泾阳链霉菌发酵菌粉90-95份；润湿剂：十二烷基苯磺酸钠1-4份；分散剂：茶皂素 0.2-1份；紫外保护剂：抗坏血酸0.5-2份，β-糊精0.2-1份；干燥保护剂：麦芽糖1-4份，甘露醇0.2-1份；混匀并过通过气流粉碎机粉碎过400目筛，检测其泾阳链霉菌孢子含量不低于100亿cfu/g，悬浮率不低于85%，润湿时间不高于85s，水分含量低于5%，真空包装，即为泾阳链霉菌可湿性粉剂。
其中，泾阳链霉菌可湿性粉剂由下列重量分优先组成为：由泾阳链霉菌发酵菌粉90份；润湿剂：十二烷基苯磺酸钠3份；分散剂：茶皂素 0.7份；紫外保护剂：抗坏血酸1.5份，β-糊精0.6份；干燥保护剂：麦芽糖3份，甘露醇0.8份。
本发明的泾阳链霉菌发酵粉的制备以菌落形成单位数为指标，对发酵培养基成分进行单因素筛选。首先选用硅藻土，膨润土，沸石粉，高岭土，白炭黑，磷矿粉，轻质碳酸钙为供试基质，结果表明，该菌在以上基质上均可生长，但在高岭土中的生长状况较优，因此确定高岭土为适宜的固体基质。通过优化碳氮源（玉米淀粉，葡萄糖，可溶性淀粉，面粉，木薯粉，蛋白胨，酵母膏，豆粕粉，棉粕粉，玉米浆干粉，硝酸钠，氯化铵，硫酸铵），以及复合维生素，复合微量元素，沼泽红假单胞菌液等，发现在载体为高岭土，碳源为玉米淀粉，氮源为豆粕粉，特别是创造性的在培养基中加入沼泽红假单胞菌液，沼泽红假单胞菌发酵液中含有多种生理活性物质，如叶绿素Ａ、Ｂ，类胡萝卜素，多种维生素(尤其是Ｂ族维生素)，多种生长激素(如IAA、GA3、ABA、乙烯、细胞***素)、核酸、水杨酸、多种氨基酸以及单细胞蛋白质等，还可为泾阳链霉菌生长提供了某些未知营养因子，而使得其泾阳链霉菌孢子含量大大提高，提高差不多2倍以上，可超过120亿CFU/克，大大提高了的链霉菌孢子的含量，
本发明人通过对助剂（润湿剂和分散剂）（聚乙烯醇，聚乙二醇，CMC-Na,吐温-60，十二烷基苯磺酸钠，T型木质素，十二烷基硫酸钠，茶皂素，Morwet EFW，Morwet D425，My100，D110，***权胶，2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐，辛基酚聚氧乙烯醚，二异辛基琥珀酸酯磺酸钠，甲基纤维素，木质素磺酸钠）、紫外线保护剂（抗坏血酸，糊精，十二烷基苯磺酸钠，刚果红，羧甲基纤维素，卵磷脂），干燥保护剂（脱脂奶粉，蔗糖，谷氨酸钠，麦芽糖，甘露醇，甲基纤维素等）进行筛选，其每种助剂对泾阳链霉菌的孢子存活，悬浮性，湿润性进行试验，最后通过多轮单因素与正交试验确定泾阳链霉菌可湿性粉剂的配方。检测其泾阳链霉菌孢子含量不低于100亿cfu/g，悬浮率不低于85%，润湿时间不高于85s，水分含量低于5%，通过验证，本发明的泾阳链霉菌可湿性粉剂在20-25℃下保存一年，其孢子存活率还可达到85%。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
创造性的将沼泽红假单胞菌液引入泾阳链霉菌培养基中，使其孢子含量大大提高，比原来的配方提高了2倍以上，达到了120亿CFU/克以上。
提供了一种制备泾阳链霉菌可湿性粉剂，泾阳链霉菌孢子含量不低于100亿cfu/g，细度粉碎过400目筛，悬浮率不低于85%，润湿时间不高于85s，水分含量低于5%的制备方法，制备方法稳定，使用量少，效果好。
具体实施方式
实施例1
一种泾阳链霉菌可湿性粉剂，其特征在于，所述泾阳链霉菌可湿性粉剂由下列重量份组成：泾阳链霉菌发酵菌粉90份；润湿剂：十二烷基苯磺酸钠3份；分散剂：茶皂素 0.7份；紫外保护剂：抗坏血酸1.5份，β-糊精0.6份；干燥保护剂：麦芽糖3份，甘露醇0.8份；其具体制备方法，由以下几步骤组成：
一、泾阳链霉菌发酵菌粉的制备
取出菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养4-5天，在平板下挑取单个菌落接种至茄子瓶中高氏一号固体培养基上，涂满整个茄子瓶，在培养箱中30℃培养4-6天，等菌体表面有浅粉红色孢子即可，将1L无菌水将茄子瓶中的菌苔洗下，将洗下的泾阳链霉菌接种于装有350L 泾阳链霉菌液体培养基的 500L 种子发酵罐，初始 pH值为7.2，温度为 30℃，通风 1:1，开搅拌，转速为200r/min；培养36-48小时，待菌体变粘稠，有大量菌丝产生，即可作为泾阳链霉菌液体菌种；
将泾阳链霉菌液体菌种以10%的接种量接种至固体发酵培养基中，混匀摊至发酵托盘中，固体发酵培养基的厚度为3-5cm，28-32℃培养3天，待固体发酵培养基长出大量白色菌点，检测孢子含量为112亿cfu/g，即可风干至水份含量低于4%即可；
其中，所述固体发酵培养基的配比为：高岭土：玉米淀粉：豆粕粉：沼泽红假单胞菌液=100：2：2：20；
其中，所述高氏一号培养基：淀粉 20g、NaCl 0.5g、KNO3 1g、KH2PO4·3H2O 0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、MgSO4·7H2O 0.5g、琼脂 18g、水 1000ml；
其中，所述泾阳链霉菌液体培养基：葡萄糖20 g/L，豆粕粉20 g/L，氯化钠5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，碳酸钙2 g/L，pH7.2；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
其中，沼泽红假单胞菌菌液的制备：取出沼泽红假单胞菌种保藏管，用沼泽红假单胞菌固体培养基划平板进行复苏，在光照培养箱中30℃培养72小时，光照强度：1000lex-6000lex，在平板下挑取单个菌落接种50毫升沼泽红假单胞菌液体培养基中，在光照培养箱中30℃厌氧培养120小时，种子采用20%的接种量，接种至装有4L的沼泽红假单胞菌液体培养基的5L大三角瓶，在光照培养箱中30℃厌氧培养72-96小时，检测其菌液浓度，菌含量超过30亿CFU/ml，即可作为沼泽红假单胞菌菌液；
其中，所述沼泽红假单胞菌固体培养基：磷酸二氢钾1g，氯化钙0.1g，碳酸钠3g，醋酸钠1g，氯化镁0.5g，氯化铵1g，氯化钠1g，琼脂20g，pH7.5，水1000mL；
其中，所述沼泽红假单胞菌液体培养基：磷酸二氢钾1g，氯化钙0.1g，碳酸氢钠2g，醋酸钠4g，氯化镁0.5g，氯化铵1g，氯化钠1g，微量元素10mL, pH7.5，水1000mL；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
其中，微量元素的配制：一水硫酸锰 4 g，硼酸 2 g，二水钼酸钠0.05g，五水硫酸铜0.005g，六水氯化钴 0.05g，水1000mL；
二、将泾阳链霉菌发酵菌粉90份；润湿剂：十二烷基苯磺酸钠3份；分散剂：茶皂素 0.7份；紫外保护剂：抗坏血酸1.5份，β-糊精0.6份；干燥保护剂：麦芽糖3份，甘露醇0.8份；混匀并过通过气流粉碎机粉碎过400目筛，检测其泾阳链霉菌孢子含量为104亿cfu/g，悬浮率为89%，润湿时间为60s，水分含量为4%，真空包装，即为泾阳链霉菌可湿性粉剂。
实施例2
本发明泾阳链霉菌可湿性粉剂在香蕉枯萎病的防治的应用效果
1试验时间：2014年5月-2016年6月
2．试验地点：广东省徐闻县某农场
3．试验方案：试验组：每月滴灌一次，用量为本发明的泾阳链链霉菌可湿性粉剂1公斤/亩，使用面积为22亩；对照组：使用市售某芽孢杆菌可湿性粉剂（香蕉专用）10公斤/亩，使用面积为108亩，对照组使用芽孢杆菌可湿性粉剂使用至2015年3月，从2015年4月开始也使用本发明的泾阳链霉菌可湿性粉剂；其他管理相同。
4．试验结果：
我们统计了试验组与对照组发病情况，结果如下表1，从表1中明显可以看出，试验组使用本发明的泾阳链霉菌可湿性粉剂的发病率随着时间的推移，发病率越来越低，至2016年6月发病率已经控制到1%以下；而对照组在施用的芽孢杆菌可湿性粉剂（香蕉专用）其发病率没有得到明显的控制，还有越来越严重的趋势，导致种植主在2015年4月私自改变试验方案将所有的土地都用上本发明的泾阳链霉菌可湿性粉剂，才得以明显的控制住病情。
表1泾阳链霉菌可湿性粉剂对香蕉枯萎病的防治效果
| 发病率/时间 | 2014年5月 | 2014年12月 | 2015年3月 | 2015年6月 | 2015年12月 | 2016年6月 |
| 试验组 | 15.8% | 12.6% | 10.3% | 7.4% | 3.3% | 0.9% |
| 对照组 | 12.4 | 14.4% | 16.6% | 15.2% | 10.1% | 5.6% |
Claims (2)
1.一种泾阳链霉菌可湿性粉剂，其特征在于，所述泾阳链霉菌可湿性粉剂由下列重量份组成：泾阳链霉菌发酵菌粉90-95份；润湿剂：十二烷基苯磺酸钠1-4份；分散剂：茶皂素0.2-1份；紫外保护剂：抗坏血酸0.5-2份，β-糊精0.2-1份；干燥保护剂：麦芽糖1-4份，甘露醇0.2-1份；其具体制备方法，由以下几步骤组成：
一、泾阳链霉菌发酵菌粉的制备
取出菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养4-5天，在平板下挑取单个菌落接种至茄子瓶中高氏一号固体培养基上，涂满整个茄子瓶，在培养箱中30℃培养4-6天，等菌体表面有浅粉红色孢子即可，将1L无菌水将茄子瓶中的菌苔洗下，将洗下的泾阳链霉菌接种于装有350L 泾阳链霉菌液体培养基的 500L 种子发酵罐，初始 pH值为7.2，温度为 30℃，通风 1:1，开搅拌，转速为200r/min；培养36-48小时，待菌体变粘稠，有大量菌丝产生，即可作为泾阳链霉菌液体菌种；
将泾阳链霉菌液体菌种以10%的接种量接种至固体发酵培养基中，混匀摊至发酵托盘中，固体发酵培养基的厚度为3-5cm，28-32℃培养2-3天，待固体发酵培养基长出大量白色菌点，孢子含量超过105亿cfu/g，即可风干至水份含量低于4%即可；
其中，所述固体发酵培养基的配比为：高岭土：玉米淀粉：豆粕粉：沼泽红假单胞菌液=100：2：2：20；
其中，所述高氏一号培养基：淀粉 20g、NaCl 0.5g、KNO3 1g、KH2PO4·3H2O 0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、MgSO4·7H2O 0.5g、琼脂 18g、水 1000ml；
其中，所述泾阳链霉菌液体培养基：葡萄糖20 g/L，豆粕粉20 g/L，氯化钠5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，碳酸钙2 g/L，pH7.2；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
其中，沼泽红假单胞菌菌液的制备：取出沼泽红假单胞菌种保藏管，用沼泽红假单胞菌固体培养基划平板进行复苏，在光照培养箱中30℃培养72小时，光照强度：1000lex-6000lex，在平板下挑取单个菌落接种50毫升沼泽红假单胞菌液体培养基中，在光照培养箱中30℃厌氧培养120小时，种子采用20%的接种量，接种至装有4L的沼泽红假单胞菌液体培养基的5L大三角瓶，在光照培养箱中30℃厌氧培养72-96小时，检测其菌液浓度，菌含量超过30亿CFU/ml，即可作为沼泽红假单胞菌菌液；
其中，所述沼泽红假单胞菌固体培养基：磷酸二氢钾1g，氯化钙0.1g，碳酸钠3g，醋酸钠1g，氯化镁0.5g，氯化铵1g，氯化钠1g，琼脂20g，pH7.5，水1000mL；
其中，所述沼泽红假单胞菌液体培养基：磷酸二氢钾1g，氯化钙0.1g，碳酸氢钠2g，醋酸钠4g，氯化镁0.5g，氯化铵1g，氯化钠1g，微量元素10mL, pH7.5，水1000mL；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
其中，微量元素的配制：一水硫酸锰 4 g，硼酸 2 g，二水钼酸钠0.05g，五水硫酸铜0.005g，六水氯化钴 0.05g，水1000mL；
二、将泾阳链霉菌发酵菌粉90-95份；润湿剂：十二烷基苯磺酸钠1-4份；分散剂：茶皂素0.2-1份；紫外保护剂：抗坏血酸0.5-2份，β-糊精0.2-1份；干燥保护剂：麦芽糖1-4份，甘露醇0.2-1份；混匀并过通过气流粉碎机粉碎过400目筛，检测其泾阳链霉菌孢子含量不低于100亿cfu/g，悬浮率不低于85%，润湿时间不高于85s，水分含量低于5%，真空包装，即为泾阳链霉菌可湿性粉剂。
2.根据权利要求1所述的一种泾阳链霉菌可湿性粉剂，其特征，在于所述泾阳链霉菌可湿性粉剂由下列重量分组成：由泾阳链霉菌发酵菌粉90份；润湿剂：十二烷基苯磺酸钠3份；分散剂：茶皂素 0.7份；紫外保护剂：抗坏血酸1.5份，β-糊精0.6份；干燥保护剂：麦芽糖3份，甘露醇0.8份。
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