CN106337028A - 一种净化剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种净化剂，包括如下组分：纳豆芽胞杆菌、脱氮副球菌、粪链球菌和营养缓冲体系，其中，纳豆芽孢杆菌的活菌浓度为大于200亿/克。本发明的有益效果是：(1)在水产养殖中：有效去除水中氨氮和亚硝酸盐，净化水质，清除藻类，增加透明度，改善水色；高效清污，完全分解残饵、粪便等；增强鱼、虾、蟹、蚌等水产动物的摄食能力，减少应激，水产养殖动物有明显促长作用，提高成活率。(2)在河道及景观水体中：有效去除水中氨氮和亚硝酸盐，净化水质，清除藻类，增加透明度，改善水色。

Description

一种净化剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物化学领域，涉及一种净化剂，具体为一种净化剂及其制备方法和应用。

背景技术

水污染是环境污染的重要方面，全国7大水系近一半河段污染严重，城市附近的河流大多受到不同程度的污染。在养鸡场、养猪场、养牛场迅速发展的同时，废弃物的处理没有得到足够的重视，致使禽畜粪便等大量向水体中直接排放，加剧了我国湖泊和近海海域的富营养化。当湖泊水体营养盐过多后，藻类滋生，根生或者浮游生物大量生长，将造成对湖泊水体正常功能的危害。例如：导致饮用水臭味和水色的变化；大量浮游植物或者浅水根生植物的生长繁殖，可能导致湖泊沼泽化，容积大幅度减少；植物的分解消耗大量溶解氧，释放大量溶解性有机物，导致水质急剧恶化；藻类在代谢死亡过程中能够释放各种藻毒素，具有比较强的毒理作用，危及整个湖泊生态***。特别值得重视的是，水体环境的富营养化与人们的日常生活密切相关，近十几年来，我国湖泊富营养的趋势发展很快，湖泊、鱼塘乃至水景，是较容易发生富营养化的地方，故对其富营养化的防治已成为当务之急，是水污染治理的重点。

在我国，由于清洁生产还未完全地应用到各工业领域，其科研技术也还未完全成熟，故我国还将在污水防治领域内停留很长时间。而水体的富营养化的治理主要有三种方式，即物理方法、化学方法和生物方法。但相比较来说，物理和化学的处理方法成本高，并且对富营养化的治理不彻底，只能在短期内效果明显，不适于长期使用。国内外对水体富营养化的研究和实践证明，目前生物方法因其成本低、处理彻底且无二次污染而得到行业内的认可。

通常，氮元素在水体中的存在形式主要有硝酸氮(NO^3-)、亚硝酸氮(NO^2-)、总氨氮(包括分子态NH₃和离子态NH⁴⁺)和氮气(N₂)。这几种形式可以相互转化，在亚硝酸菌和硝酸菌的作用下，氨氮被转化为亚硝酸盐和硝酸盐，这个过程被称为硝化反应；反之，在反硝化菌作用下，亚硝酸盐和硝酸盐又被还原为氨氮，称为反硝化反应。一般认为，硝酸氮对水生生物是无毒的，氨氮是有毒的，亚硝酸氮是有毒的，不稳定的中间产物，而氮气是稳定无毒的，它不能被水生生物直接利用，也不参与水体中的氮素转化过程。

由此可见，对水生生物有危害的总氨氮(包括分子态NH₃和离子态NH⁴⁺)，其中构成主要危害的是指分子态的氨氮(NH₃)。水体中NH₃过高不仅阻止生物体内的氨向体外排出，还能从水中向其体内渗透，使水生生物代谢减少或停滞，损害包括鳃在内的一些主要器官，抑制其生长发育，甚至造成死亡。因此，控制水体中的氨氮含量就成为了一项至关重要的工作。

芽孢杆菌，(Bacillus)，细菌的一科，能形成芽孢(内生孢子)的杆菌或球菌。它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，其在水体净化中的作用主要为：杀菌、提高水体DO、降解氨氮等有机物，芽孢杆菌通过降解池塘中的有机质，转化为可为浮游微藻直接吸收利用的无机营养盐或小分子物质，促进了微藻的生长与繁殖。随着微藻生物量的大幅增长，大大提升了水体光合作用的生态产氧能力，加之芽孢杆菌对池塘有机质的高效降解和藻类对还原性无机物的吸收，减少了因此而造成的水体相对缺氧，使施菌池塘的水体DO远高于未施菌的池塘。但在水体中单独使用芽孢杆菌类微生物，虽然能使流入水体的富营养化物质为这些有益微生物所接收，它们通过自身的作用消化掉这些“污染物”，使污染得到控制，但其净化能力还不够理想，故研究一种处理富营养化物质能力非常好的水体净化剂对现有水体净化领域来说是非常重要的；更佳地，若水体净化剂在对水体进行净化的同时，还具有提高水体中鱼蟹虾贝类的抗病能力，则市场前景将更加广阔。

发明内容

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种净化剂及其制备方法和应用，该净化剂能有效去除水中的氨氮和亚硝酸盐，净化水质，防止水体富营养化，同时提高水体中鱼蟹虾贝类的抗病能力。

本发明提供的技术方案为：

一种净化剂，包括如下组分：纳豆芽胞杆菌、脱氮副球菌、粪链球菌和营养缓冲体系，其中，纳豆芽孢杆菌的活菌浓度为大于200亿/克。

优选地，上述净化剂中的纳豆芽胞杆菌占其质量百分比为35-55％。

作为一种优选方案，所述净化剂由如下百分比组成：纳豆芽胞杆菌35-55％，脱氮副球菌10-20％，粪链球菌10-20％，营养缓冲体系2-10％，葡萄糖10-30％，其中，纳豆芽孢杆菌的活菌浓度为大于200亿/克。

更佳地，所述净化剂由如下百分比组成：纳豆芽胞杆菌45％，脱氮副球菌15％，粪链球菌15％，营养缓冲体系5％，葡萄糖20％，其中，纳豆芽孢杆菌的活菌浓度为大于200亿/克。

更优选地，纳豆芽孢杆菌的活菌浓度为200-400亿/克。

更优选地，脱氮副球菌的活菌浓度为20-200亿/克。

更优选地，粪链球菌的活菌浓度为20-200亿/克。

作为一种优选实施方案，所述纳豆芽胞杆菌的活菌浓度为300亿/克，脱氮副球菌的活菌浓度为100亿/克，粪链球菌的活菌浓度为100亿/克。

优选地，营养缓冲体系各组分占净化剂的质量百分比为：磷酸二氢钾溶液0.1-1％、磷酸氢二钾溶液0.1-1％、硫酸镁溶液0.1-1％、氯化钠溶液0.5-2.5％及细菌抗菌肽1-3％。

更优选地，营养缓冲体系中磷酸二氢钾溶液浓度为3×10^-3mol/L、磷酸氢二钾溶液浓度为3×10^-3mol/L、硫酸镁溶液浓度为4×10^-3mol/L、氯化钠溶液浓度为6×10^-3mol/L及细菌抗菌肽浓度为0.1％。

值得一提的是，细菌抗菌肽是一种利用生物拮抗作用抵御某些病原菌或其它种类细菌的多肽，具有平衡水体生物体系的作用。

本发明的另一目的是提供上述净化剂的制备方法，包括如下步骤：

步骤a)制备纳豆芽胞杆菌：将纳豆芽胞杆菌菌株接种到LB培养基中，活化后进行发酵，获取菌粉；

步骤b)制备脱氮副球菌：将脱氮副球菌菌株接种到LB培养基中，活化后进行发酵，获取菌粉；

步骤c)制备粪链球菌：将粪链球菌原种接种到LB培养基中，发酵，获取菌粉；

步骤d)配置营养缓冲体系：分别配置磷酸二氢钾溶液、磷酸氢二钾溶液、硫酸镁溶液和氯化钠溶液，并添加细菌抗菌肽，干燥；

步骤e)将步骤a)、步骤b)、步骤c)和步骤d)所得菌粉与营养缓冲体系混合均匀后备用。

需要注意的是，上述LB培养基为液体培养基，由胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g和950m水组成，可根据《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著)指导制备而得。

优选地，上述发酵为二级发酵。

优选地，步骤a)中的活化时间为18h。

优选地，步骤a)中发酵是按照5％接种量进行发酵。

更优选地，步骤a)发酵培养基配方为可溶性淀粉37％、豆粉30％、鱼粉20％、糖蜜10％，氯化钠3％。

更优选地，步骤a)中的发酵是在28℃发酵36h。

优选地，步骤a)中发酵后，用柠檬酸将液体发酵物的pH值调至4-4.5。

优选地，步骤b)中的活化时间为24h。

优选地，步骤b)中发酵是按照5％接种量进行发酵。

更优选地，步骤b)发酵培养基配方为可溶性淀粉45％、黄原胶10％、糖蜜30％、豆粉12％、氯化钠3％。

更优选地，步骤b)中的发酵是在28℃下发酵48h。

优选地，步骤b)中发酵后，用柠檬酸将液体发酵物的pH值调至5-5.5。

优选地，步骤a)和步骤b)中获取菌粉的具体操作为：菌种发酵结束后，向液体发酵物中加入过量生石灰粉，干燥。

更优选地，生石灰粉的用量一般为液体发酵物体积的150％。

更优选地，干燥为现有技术中的任意干燥方法，如脱水、加热或风干等方法，为保证高效和低成本，可采用喷雾干燥的方法。

更优选地，干燥温度为50℃。

优选地，步骤c)中发酵是按照5％接种量进行发酵。

更优选地，步骤c)发酵培养基配方为麸皮38％、秸秆20％、豆饼粉30％、尿酸0.3％、氯化钠2％、草酸10％。

更优选地，步骤c)在37℃下发酵56h。

优选地，步骤c)中获取菌粉的具体操作为：菌种发酵结束后，将固体发酵物于37℃烘干，粉碎，即得到菌粉。

本发明的另一目的在于提供上述净化剂在水产养殖、河道、景观水体的水体底质改良或水体净化中的应用。

本发明的有益效果是：

(1)在水产养殖中：有效去除水中氨氮和亚硝酸盐，净化水质，清除藻类，增加透明度，改善水色；高效清污，完全分解残饵、粪便等；增强鱼、虾、蟹、蚌等水产动物的摄食能力，减少应激，水产养殖动物有明显促长作用，提高成活率。

(2)在河道及景观水体中：有效去除水中氨氮和亚硝酸盐，净化水质，清除藻类，增加透明度，改善水色。

此外，本发明提供的水体净化剂配方组分较少，生产流程简单，相对于成分仅为芽孢杆菌的水体净化剂来说，水体净化效果好得多；且相对于市场上含有芽孢杆菌复合配方的水体净化剂来说，既有良好的水体净化效果，又使所用原料菌株的种类简单，生产工序少，成本低廉，环境友好，故应用前景十分广阔，具有很大的推广意义。

具体实施方式

下面结合实施方式对本发明作进一步详细、完整地说明。

所需仪器及试剂：

(1)仪器：

超净工作台，高压蒸汽灭菌锅，恒温摇床，发酵罐，冷冻干燥仪，生化培养箱，干燥箱，粉碎机。

(2)试剂：

LB液体培养基，制备原料为胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g和950m水，根据《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著)指导制备而得。

纳豆芽胞杆菌菌株，由上海海洋大学国家水生动物病原库自行分离鉴定，编号JS-20121101。

纳豆芽胞杆菌菌株发酵培养基，配方为可溶性淀粉37％、豆粉30％、鱼粉20％、糖蜜10％，氯化钠3％，根据《微生物学教程》(周德庆第三版)指导制备而得。

脱氮副球菌菌株，由上海海洋大学国家水生动物病原库自行分离鉴定，编号JS-20120526。

脱氮副球菌菌株发酵培养基，配方为可溶性淀粉45％、黄原胶10％、糖蜜30％、豆粉12％、氯化钠3％，根据《微生物学教程》(周德庆第三版)指导制备而得。

粪链球菌菌株，由上海海洋大学国家水生动物病原库自行分离鉴定，编号JS-20130114。

粪链球菌菌株发酵培养基，配方为麸皮38％、秸秆20％、豆饼粉30％、尿酸0.3％、氯化钠2％、草酸10％，根据《微生物学教程》(周德庆第三版)指导制备而得。

葡萄糖，化学纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。

磷酸二氢钾，化学纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。

磷酸氢二钾，化学纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。

硫酸镁，化学纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。

氯化钠，化学纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。

抗菌肽，纯度高于80％，由大肠杆菌扩大化培养制备。

1、制备本发明提供的净化剂：

分别按照表a中各组分的质量百分比及活菌浓度采用以下方法制备本发明提供的净化剂：

表a 各实施例组分配比数据表

各实施例所用净水剂制备步骤如下：

(1)制备纳豆芽胞杆菌菌粉：无菌条件下，将纳豆芽胞杆菌菌株接种到LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床中活化18h，随后将活化后的纳豆芽孢杆菌菌株放入发酵罐中，在28℃下按照5％接种量进行发酵36h，以柠檬酸调节pH至4，于700℃喷雾干燥，粉碎，即得菌粉。

(2)制备脱氮副球菌菌粉：无菌条件下，将脱氮副球菌菌株接种到LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床中活化24h，随后将活化后的纳豆芽孢杆菌菌株放入发酵罐中，在28℃下按照5％接种量进行发酵48h，以柠檬酸调节pH至4，在发酵液中加入过量(发酵液体积的150％)生石灰粉，于50℃喷雾干燥，粉碎，即得菌粉。

(3)制备粪链球菌菌粉：无菌条件下，将粪链球菌原种接种到LB液体培养基中，在37℃下按照5％接种量进行发酵56h，将固体发酵产物于37℃烘干，粉碎，即得菌粉。

(4)制备营养缓冲体系：分别配置浓度为3×10^-3mol/L的磷酸二氢钾溶液、3×10^-3mol/L的磷酸氢二钾溶液、4×10^-3mol/L的硫酸镁溶液和6×10^-3mol/L的氯化钠溶液，并添加浓度为0.1％的细菌抗菌肽，按照表a所列配比混合均匀，干燥，即得营养缓冲体系。

(5)将上述纳豆芽胞杆菌菌粉、脱氮副球菌菌粉、粪链球菌菌粉、营养缓冲体系和葡萄糖分别按照表a的百分含量混合均匀后组合成本发明提供的净化剂，常温保存即可。

2、净化效果实验

2.1、实施例1所得净化剂的水体净化效果实验

实验时间：2015年5月～6月

实验地点：广东佛山某养殖塘

养殖品种：鸭嘴鱼、鳗鱼等

池塘大小：60亩

气温：每日气温在25℃以上

将根据上述制备方法获得的1kg净化剂用20kg的清水溶解，并充分搅拌和充气活化30min；然后用50L池塘水混合后全池泼洒，每10天用1次。

2天后，池水透明度、水色肉眼可见明显改善，池塘氨氮明显降低，分别在加入净化剂24h和48h后，在池塘内随机选取两个采样点并检测三组氨氮含量，取平均值，检测数据见表1：

表1 使用本发明提供的净化剂净化水体的氨氮浓度数据表

2.2、实施例2所得净化剂的水体净化效果实验

本实施例与实施例1的差别在于水体净化剂的各组分配比不同，具体配比见表a，检测数据见表2：

表2 使用本发明提供的净化剂净化水体的氨氮浓度数据表

2.3、实施例3所得净化剂的水体净化效果实验

实验时间：2015年4月

实验地点：上海某景观河道

河道大小：60亩

气温：每日气温在25℃以上

将根据上述制备方法获得的1kg净化剂用20kg的清水溶解，具体配比情况可见表a，并充分搅拌和充气活化30min；然后用50L河道水混合后全河道泼洒，每10天用1次。

3天后，池水透明度、水色肉眼可见明显改善，池塘氨氮明显降低，在池塘内随机选取一个采样点，以该采样点检测的各理化数据为对照，在加入净化剂24h、48h和72h后，分别在同一采样点检测四组理化数据，详见表3：

表3 使用本发明提供的净化剂净化水体的各理化数据表

2.4、实施例4所得净化剂的水体净化效果实验

本实施例与实施例3的差别在于水体净化剂的各组分配比不同，具体配比见表a，检测数据见表4：

表4 使用本发明提供的净化剂净化水体的各理化数据表

2.5、净化效果对比实验

2.5.1、养殖水体净化效果对比实验

养殖水体净化效果对比实验与实施例1的差别在于，分别使用纳豆芽孢杆菌菌粉和/或脱氮副球菌菌粉和/或粪链球菌菌粉的水体净化处理评价本发明提供的净化剂的净化效果，检测数据见表5：

表5 使用纳豆芽孢杆菌菌粉和/或脱氮副球菌菌粉和/或粪链球菌菌粉的水体净化前后的氨氮浓度数据表

2.5.2、景观河道净化效果对比实验

景观河道净化效果对比实验与实施例3的差别在于，分别使用纳豆芽孢杆菌菌粉和/或脱氮副球菌菌粉和/或粪链球菌菌粉的水体净化处理评价本发明提供的净化剂的净化效果，检测数据见表6：

表6 使用纳豆芽孢杆菌菌粉和/或脱氮副球菌菌粉和/或粪链球菌菌粉的水体净化前后的氨氮及亚硝酸盐数据表

通过表1～6可知，本发明提供的净化剂比采用纳豆芽孢杆菌菌粉和/或脱氮副球菌菌粉和/或粪链球菌菌粉的水体净化处理效果好的多，具备明显的协同作用，明显优于现有技术，且操作简单，环境友好，适用于工业生产，因此具有显著的进步。

同时本发明上述实施例仅为说明本发明技术方案之用，仅为本发明技术方案的列举，并不用于限制本发明的技术方案及其保护范围。采用等同技术手段、等同设备等对本发明权利要求书及说明书所公开的技术方案的改进应当认为是没有超出本发明权利要求书及说明书所公开的范围。

Claims (10)

1.一种净化剂，其特征在于，包括如下组分：纳豆芽胞杆菌、脱氮副球菌、粪链球菌和营养缓冲体系，其中，纳豆芽孢杆菌的活菌浓度为大于200亿/克。

2.根据权利要求1所述的净化剂，其特征在于：所述净化剂中的纳豆芽胞杆菌占其质量百分比为35-55％。

3.根据权利要求1所述的净化剂，其特征在于，所述净化剂由如下百分比组成：纳豆芽胞杆菌35-55％，脱氮副球菌10-20％，粪链球菌10-20％，营养缓冲体系2-10％，葡萄糖10-30％，其中，纳豆芽孢杆菌的活菌浓度为大于200亿/克。

4.根据权利要求1所述的净化剂，其特征在于，所述净化剂由如下百分比组成：纳豆芽胞杆菌45％，脱氮副球菌15％，粪链球菌15％，营养缓冲体系5％，葡萄糖20％，其中，纳豆芽孢杆菌的活菌浓度为大于200亿/克。

5.根据权利要求1～4任一所述的净化剂，其特征在于：纳豆芽孢杆菌的活菌浓度为200-400亿/克。

6.根据权利要求1～4任一所述的净化剂，其特征在于：脱氮副球菌的活菌浓度为20-200亿/克。

7.根据权利要求1～4任一所述的净化剂，其特征在于：粪链球菌的活菌浓度为20-200亿/克。

8.根据权利要求3或4所述的净化剂，其特征在于：5％营养缓冲体系包括磷酸二氢钾溶液0.1-1％、磷酸氢二钾溶液0.1-1％、硫酸镁溶液0.1-1％、氯化钠溶液0.5-2.5％及细菌抗菌肽1-3％。

9.一种制备权利要求1～8所述的净化剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤a)制备纳豆芽胞杆菌：将纳豆芽胞杆菌菌株接种到LB培养基中，活化后进行发酵，获取菌粉；

步骤b)制备脱氮副球菌：将脱氮副球菌菌株接种到LB培养基中，活化后进行发酵，获取菌粉；

步骤c)制备粪链球菌：将粪链球菌原种接种到LB培养基中，发酵，获取菌粉；

步骤d)配置营养缓冲体系：分别配置磷酸二氢钾溶液、磷酸氢二钾溶液、硫酸镁溶液和氯化钠溶液，并添加细菌抗菌肽，干燥；

步骤e)将步骤a)、步骤b)、步骤c)和步骤d)所得菌粉与营养缓冲体系混合均匀后备用。

10.根据权利要求1所述的净化剂在水产养殖、河道、景观水体的水体底质改良或水体净化中的应用。