CN106318872B - 人参促生细菌ji39-2及其应用 - Google Patents

人参促生细菌ji39-2及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株嗜烟碱节杆菌JI39‑2，具有固氮、解钾、产生长素和产铁载体特性，并对人参生长具有促进作用的细菌菌株JI39‑2。经鉴定为嗜烟碱节杆菌（Arthrobacter nicotinovorans）。具有固氮潜能，解磷含量可达到164.2µg/mL，解钾可达到16.1µg/mL，它产IAA能力强，可达到3.1µg/mL。能促进人参种子发芽生长，芽长增加64.61%。对人参根生长具有明显促进作用，鲜重增加56.43%；该菌的发现为日后人参促生菌肥的开发及其利用奠定了良好的基础。

Description

人参促生细菌JI39-2及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，确切地说是人参促生细菌JI39-2及其应用。
背景技术
上世纪70年代以来，我国开始推广化学肥料。目前，由于长期使用化肥，导致农业生产出现一系列问题，土壤持续生产能力、肥料利用率下降，土壤质量、农产品质量安全问题日益严重。2015年3月，农业部制定的《到2020年化肥使用量零增长行动方案》明确指出，要调整化肥使用结构，提高肥料利用率，发展新型肥料。在新型肥料中，微生物肥料已成为新型肥料中最大、应用面积最广的品种，其功能多样，既能活化土壤，提升肥效，又能保障农产品质量安全，在提高化肥利用率、降低化肥用量、保护环境等方面取得了较好的效果，研制开发前景广阔。微生物肥料在快速发展的同时，新的功能菌种发掘、科学合理的工艺、产品质量的提高、生产成本的降低、应用效果的稳定等，是微生物肥料产业面临的课题，其技术创新需要持续提高。发展微生物菌肥的前提是获得具有高效生物活性功能的有益微生物，例如具有促进植物生长的微生物，简称植物促生菌。植物促生菌促进植物生长的机理不尽相同，作用途径包括分泌有机酸溶解磷并使之有效化、自生固氮、通过嗜铁素增加植物铁营养和产生植物激素等。
人参是我国名贵中药材，被称为“百草之王”。 2012年，人参（人工种植）被国家***批准为新资源食品，消费量和市场需求量极具增加。目前人参以人工种植为主，其对土壤和环境条件要求较高，在我国主要集中在吉林省长白山地区，是吉林省主要出口创汇的农产品。在有限的土地资源条件下，保持人参产量和品质是满足市场需求的基础，保护种植区生态环境是人参产业可持续发展的必要条件。因此，分离筛选获得具有促进植物生长的微生物并研制成菌肥加以应用对于发展人参产业具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是为了减少化肥使用，而提供一种对人参生长具有促进功能的人参拮抗菌株，人参促生细菌JI39-2。
嗜烟碱节杆菌JI39-2，保藏编号为CCTCC NO: M 2015667。
人参种子发芽促生剂，它是嗜烟碱节杆菌JI39-2的细菌悬浮液；
所述的细菌悬浮液的浓度为109 cfu/mL。
嗜烟碱节杆菌JI39-2在促进人参生根生长方面的应用。
本发明提供了一株具有固氮、解钾、产生长素和产铁载体特性，并对人参生长具有促进作用的细菌菌株JI39-2。经鉴定为嗜烟碱节杆菌（Arthrobacter nicotinovorans）。它具有固氮潜能，解磷含量可达到164.2 µg/mL，解钾可达到16.1 µg/mL，它产IAA能力强，可达到3.1µg/mL。能促进人参种子发芽生长，芽长增加 64.61%。对人参根生长具有明显促进作用，鲜重增加56.43%；该菌的发现为日后人参促生菌肥的开发及其利用奠定了良好的基础。
附图说明
图1 JI39-2菌株在NA培养基上的菌落形态；
图2 JI39-2菌株电镜下观察的菌体形态；
图3 JI39-2 菌株的分子鉴定聚类图谱；
图4 JI39-2菌株促生功能分析（1：解钾特性，2：解磷特性，3：固氮潜能， 4：产生IAA）；
图5 JI39-2菌株对人参种子发芽的促生作用；
图6 JI39-2菌株对人参种子发芽的促生效果；
图7 JI39-2菌株对人参根鲜重的促生效果（左图为JI39-2菌株处理右图为清水处理）；
图8 JI39-2菌株对人参根鲜重的促生作用。
具体实施方式
实施例1菌株TY15-2的筛选与鉴定
从来自于吉林省通化地区健康人参植株体内，采用平板稀释法筛选获得了人参内生细菌 JI39-2。
将JI39-2菌株划线在NA培养基上，28℃培养24h后，观察菌株JI39-2在NA培养基上呈淡黄色不透明圆形小菌落，边缘整齐，如图1所示。
取在LB液体培养基中培养24h的JI39-2菌液，离心用无菌水反复冲洗后，悬浮于适量无菌水中进行负染色制备样品，在透射电镜下观察发现菌体呈杆状，具有周生鞭毛，如图2所示。
参照《常见细菌***鉴定手册》和《伯杰***鉴定手册》中推荐的部分培养基（表1）和方法测定JI39-2菌株的生理生化特性发现，菌株JI39-2为革兰氏染色阴性菌；接触酶、氧化酶、V-P反应为阳性；能利用柠檬酸、丙二酸，使硝酸盐还原；但不能使淀粉和油脂水解，可使明胶液化；石蕊牛奶试验产酸，对NaCl 的耐受性为7%；可以利用葡萄糖、甘露醇、半乳糖和果糖。
获得菌株16S rDNA序列与GenBank数据库中序列进行BLAST分析比对，获得登录号为KU587789，与A. nicotinovorans strain T258 （KC764990）相似度达到99.68%，与A. nicotinovorans strain KNUC601相似度达到99.57%；构建的***进化树，如图3所示，JI39-2菌株与A. nicotinovorans亲缘关系较近，聚于同一分支中。通过形态特征、培养特征、生理生化特征和分子生物学鉴定结果，JI39-2菌株为嗜烟碱节杆菌（Arthrobacter nicotinovorans）。
嗜烟碱节杆菌JI39-2，已于2015年11月9日，保存于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心，邮政编码：430072，编号为CCTCC NO: M 2015667。
实施例2 菌株JI39-2促生特性的测定
1. 解磷能力的测定
在NA培养基上接种菌株JI39-2，培养12h后打菌碟，接种于PVK固体培养基中培养3d观察解磷圈大小，结果显示，菌株JI39-2具有清晰可见的解磷圈，如图4所示；然后采用钼锑钪比色法进行解磷定量测定，方法为将菌株JI39-2接种于50mL LB液体培养基中，160 r/min培养12h。取1 mL接种于装有50 mL PVK液体培养基的三角瓶中，3 d后取培养液8000 r/min离心5min后取上清，钼锑钪比色法测量其可溶性磷含量可达到164.2 µg/mL。
2. 解钾能力的测定
初测采用硅酸盐固体培养基，将菌株JI39-2接种于硅酸盐固体培养基上，30℃培养3d后观察解钾圈大小，菌株JI39-2具有明显的的解钾圈，如图4所示；然后采用火焰光度法，将菌株JI39-2接种到液体LB培养基上，30℃、160 rpm培养12h后测定吸光值。取2ml菌液接入50ml液体硅酸盐培养基中，30℃、160 rpm培养72h后，用火焰光度计定量测量其解钾含量可达到16.1 µg/mL。
3. 其它促生能力的测定
① 固氮能力的测定
将菌株JI39-2划线接种于Ashby固体培养基上，30℃培养观察菌株长势，结果发现菌株JI39-2在无氮条件下长势良好，具有固氮潜能，如图4所示。
② 产IAA能力的测定
将菌株JI39-2接种到液体LB培养基中，30℃、160rpm培养12h。将菌液在工作台操作下稀释到吸光值0.8左右。取0.2ml接种到含100mg/L色氨酸培养基中，培养48h后12000rpm离心5min，取上清液2ml加入显色液4ml，暗处放置0. 5h 后在540nm下测定吸光值。菌株JI39-2产IAA能力可达到3.1µg/mL，如图4所示。
实施例3：菌株JI39-2促人参生长效果
1. 种子发芽促生试验
菌株JI39-2接种LB培养液中培养后，12000 rpm离心5 min收集菌体。用无菌水洗涤2次后重悬浮于无菌水中，将其稀释成浓度为109 cfu/mL的细菌悬浮液。将后熟露白的人参种子浸泡在菌悬液中3h，取出晾干后放于装有无菌湿润沙子的培养皿中，每皿15粒种子，为1次重复，共6次重复，于暗处18~20℃放置催芽12~15d，以无菌水处理的种子为对照。结果显示（表2，图5，图6），JI39-2菌株处理的人参种子芽长平均值为20.51 mm，大于清水对照处理（12.46 mm），芽长增加64.61%，表明JI39-2菌株对人参种子发芽生长具有显著地促进作用。
2. 对人参根生长的促生效果
田间试验地点选在吉林省通化市柳河县向阳镇人参种植基地进行。2015年4月28日，将大小均匀的2年生人参栽子种植于肥力一致的人参床中，种植深度为5cm。6月6日，人参出苗完全展叶后，采用灌根法将无菌水洗涤悬浮后浓度为108 cfu/mL的JI39-2菌悬液施用于根部。每重复处理60株（4行）人参，共4次重复，每行人参（15株）浇灌500mL菌悬液，以清水为对照，每隔15d浇灌一次，共浇灌3次。2015年10月25日人参地上部茎叶脱落后，每个处理挑选小区中间两行（30株）人参为一个单位，测定根鲜重和干重，与清水对照进行比较。
试验结果表明，JI39-2菌株对人参根生长具有明显的促进作用，经JI39-2菌株处理的人参根鲜重增产356.67g，清水处理增产228g，促生菌株JI39-2对人参根部生长平均增产56.43%，统计结果详见表2，图7，图8。

Claims (4)

1.嗜烟碱节杆菌 (Arthrobacter nicotinovorans) JI39-2，保藏编号为CCTCC NO: M2015667。
2.人参种子发芽促生剂，它是权利要求1所述的嗜烟碱节杆菌JI39-2的细菌悬浮液。
3.根据权利要求2所述的人参种子发芽促生剂，其特征在于：所述的细菌悬浮液的浓度为109 cfu/mL。
4.根据权利要求1所述的嗜烟碱节杆菌JI39-2在促进人参生根生长方面的应用。
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