CN106317153A - 一种***半抗原制备方法及其应用 - Google Patents
一种***半抗原制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种***半抗原和相应的人工抗原,同时本发明也公开了所述***半抗原和相应的人工抗原的制备方法及其应用。本发明提供的***半抗原是式1所示产物,用式1所示产物与载体蛋白连接可以得到***抗原。所述***抗原可应用于制备***特异性抗体。本发明制备方法简便可行、成本较低,半抗原产率较高。本发明的***人工抗原,通过免疫动物可产生了针对***的特异性抗体,可用于制备检测***残留的酶联免疫检测试剂盒,具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特异性强等诸多优点。
Description
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域,具体涉及一种***半抗原、抗原制备方法及其应用。
背景技术
***(Dexamethasone, DSMS)又名氟美松、氟甲强地松龙、德沙美松,是一种人工合成的肾上腺皮质激素。是糖皮质类激素类抗炎、抗过敏药物,其药理作用主要是抗炎、抗毒、抗过敏、抗风湿,临床使用较广泛。此外,***还作为动物生长调节剂,促进动物蛋白质合成和代谢,增加产肉量,曾经被广泛应用作为家畜、家禽、使用。
但通过长期的实验室研究发现,***可以使实验动物发生癌变和基因突变,***及其残留对人、畜均有明显的毒副作用,使用高剂量的***可导致肌肉萎缩、生长抑制等副作用。并由此推断,人类长期使用该类药物或长期食用添加该类促生长剂的家畜、家禽、同样也可发生癌变和基因突变。所以此类药物禁止在治疗和饲料中使用。
我国于2002年在农业部发布的235号公告的《动物性食品中兽药最高残留限量》中,***在所有食品动物肌肉中不得超过0.75μg/kg,肝脏中不得超过2.0μg/kg。因此,为确保动物源性食品的安全和对外出口贸易的发展,建立准确可靠,灵敏度高的定性定量方法是十分必要的。
国内外现已开发出检测***的酶联免疫试剂盒,但是现在国内生产的试剂盒在准确性、灵敏度、特异性等方面还不能完全达到检测的要求。本发明公开的***半抗原、抗原为进一步研制***抗体及***酶联免疫试剂盒提供了原料。
发明内容
本发明的目的是提供一种***半抗原、抗原制备方法及其应用。
本发明提供的***半抗原,是式1所示化合物:
式1。
本发明还公开了式1所示产物的制备方法,包括如下步骤:
50ml圆底烧瓶中加入***原料药500mg,5ml吡啶溶解后加入琥珀酸酐110mg,80℃反应3h,TLC检测原料反应完毕后处理,减压蒸除吡啶,残余物中加入10ml冰水,析出白色固体,过滤,水洗干燥得350mg产品,即是半抗原。
本发明提供的***抗原,是将式1所示产物和载体蛋白偶联得到的偶联物。
本发明还保护所述***抗原的制备方法,包括如下步骤:
(1)、将半抗原22mg溶解于1.5mL DMF中,完全溶解后,依次加入EDC 25mg,NHS 25mg,室温磁力搅拌反应3h;
(2)、称取50mgBSA,溶解于3.5mL 0.1M碳酸缓冲液pH=9.6中,400rpm搅拌10min,充分溶解;
(3)、取上述步骤1中活化溶液,在冰水浴环境下逐滴加入到蛋白溶液中,边加边搅拌,室温磁力搅拌反应24h;
(4)、将反应产物装入1个蒸馏水冲洗干净透析袋(15cm),1LPBS透析3天,室温搅拌透析,每天更换透析液3次,透析产物4500rpm离心6min,0.5ml/管分装,将抗原编号,-20℃保存备用。
常用载体蛋白均可采用,如牛血清白蛋白(BSA),卵清蛋白(OVA),人血清白蛋白(HSA),鼠血清白蛋白(MSA),甲状腺蛋白(TG)或血蓝蛋白(KLH)等。
所述***抗原可以作为免疫原免疫动物制备***特异性抗体,也可以作为包被原制备酶标板。
所述抗体具体可为单克隆抗体。
式1所示产物、所述***抗原、所述抗体均可应用于检测***。
本发明还公布了应用***抗原和***单克隆抗体制备得到的酶联免疫试剂盒。
所述酶联免疫检测试剂盒,是由包被有***抗原的酶标板、酶标抗体工作液、***系列标准品、底物显色液、终止液、浓缩复溶液、浓缩洗涤液。
本发明依靠免疫学、免疫化学基本原理和残留分析技术手段,设计、合成小分子目标分析物半抗原,并与载体蛋白偶联,制备有效人工抗原。本发明制备方法简便可行、成本较低,半抗原产率较高。本发明的***人工抗原,通过免疫动物可产生了针对***的特异性抗体,用于快速检测食品中的***残留。
附图说明
图1为***半抗原的质谱检测结果。
图2为BSA的质谱检测结果。
图3为***抗原“***半抗原+BSA”的质谱检测结果。
图4为***酶联免疫检测试剂盒标准曲线。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、***半抗原的制备
一、***半抗原的制备
50ml圆底烧瓶中加入***原料药500mg,5ml吡啶F溶解后加入琥珀酸酐110mg,80度反应3h,TLC检测原料反应完毕后处理,减压蒸除吡啶,残余物中加入10ml冰水,析出白色固体,过滤,水洗干燥得350mg产品,即为半抗原。
反应方程式如下:
二、***半抗原的鉴定
对所得产品进行质谱鉴定,-MS:M-1=491.2,+MS:M+K=531.7(图1)。
结果显示其化学结构式如式I所示(MW=492.53),即为***半抗原。
式1。
实施例2、***人工抗原的制备和鉴定
一、***免疫抗原(DSMS-BSA)的合成
(1)、将半抗原22mg溶解于1.5mL DMF中,完全溶解后,依次加入EDC 25mg,NHS 25mg,室温磁力搅拌反应3h;
(2)、称取50mgBSA,溶解于3.5mL 0.1M碳酸缓冲液pH=9.6中,400rpm搅拌10min,充分溶解;
(3)、取上述步骤1中活化溶液,在冰水浴环境下逐滴加入到蛋白溶液中,边加边搅拌,室温磁力搅拌反应24h;
(4)、将反应产物装入1个蒸馏水冲洗干净透析袋(15cm),1LPBS透析3天,室温搅拌透析,每天更换透析液3次,透析产物4500rpm离心6min,0.5ml/管分装,将抗原编号,-20℃保存备用。
二、***包被抗原(DSMS-OVA)的合成
(1)、将上述半抗原22mg溶解于1.5mL DMF中,完全溶解后,依次加入EDC 25mg,NHS 25mg,室温磁力搅拌反应3h。
(2)、称取67.0mgOVA,溶解于3.5mL 0.1M碳酸缓冲液pH=9.6中,400rpm搅拌10min,充分溶解。
(3)、取上述步骤1中活化溶液,在冰水浴环境下逐滴加入到蛋白溶液中,边加边搅拌,室温磁力搅拌反应24h。
(4)、将反应产物装入1个蒸馏水冲洗干净透析袋(15cm),1LPBS透析3天,室温搅拌透析,每天更换透析液3次,透析产物4500rpm离心6min,0.5ml/管分装,将抗原编号,-20℃保存备用。
三、***人工抗原的鉴定
免疫原MALDI-TOF-MS鉴定结果显示偶联比为:R=(DMS-HS-BSA)-(BSA)/492.53=(73828.009-67485.901)/492.53=12.88(图2和图3)。即免疫原中,所述***半抗原(式I)与牛血清白蛋白(BSA)偶联的摩尔比为12.88:1。
实施例3、酶标单抗的制备和特异性鉴定
一、***单抗的制备
1、用上述制备出的免疫原按100μg/只,以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀,颈背部皮下注射免疫6~8周龄Balb/c雌鼠,初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀,各追加免疫一次,融合前3天以免疫复合物100μg/只,不加弗氏佐剂再追加免疫一次。
2、按常规方法进行,取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合,然后在45s内缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合,用HAT培养基悬浮均匀,再加入适量的饲养细胞,培养于96孔培养板,于37℃,5%CO2培养箱中培养,5天后用HT培养基半换液,9天时候进行全换液。
3、细胞融合后,待细胞长到培养孔面积的1/4时,采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法,以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被酶标板,加入被测孔培养上清,孵育,清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP,OPD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选,先将细胞上清与100μg/mL的***等体积混合,37℃水浴作用30min,再加入到包被好的酶标板中。同时用PBS取代***作对照,其余步骤同上。若经***阻断后的OD450nm值下降到对照孔的50%以下,则判为阳性,经2~3次检测都为阳性的孔,立即用有限稀释法进行亚克隆化。
4、将2~3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养,收集上清液用间接ELISA测定效价,冻存;并取8~10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只,7~10日后腹腔注射杂交瘤细胞1~2×106/只,7~10日后抽取小鼠腹水,离心取上清,测定效价,并冻存备用。
二、酶标抗体的制备
(1)称取辣根过氧化物酶(HRP)2 mg溶解于0.5 mL水中,加入0.5 mL 0.06 mol/L NaIO4溶液,4℃避光作用30 min;
(2)加入160 mmol/L的乙二醇0.5mL,室温作用30 min;
(3)加入步骤一制备的***单抗2 mg,混匀后装入处理过的透析袋中,置1000 mL的0.05 mmol/L碳酸钠缓冲液中透析,4℃过夜;
(4)透析液吸至10 mL的离心管中,加0.25mL 5g/L的NaBH4溶液,混匀后置4℃2 h;
(5)加入等体积的饱和硫酸铵溶液,4℃作用30 min后4℃下3000 r/min离心25 min,弃上清;
(6)将沉淀溶于1.5 mL0.02 mol/L pH 7.4的PBS中,吸入透析袋内,在0.02mol/L pH 7.4 PBS透析,4℃过夜(中途更换PBS 3次);
(7)将透析袋中液体吸至微量离心管中,4℃下10000r/min离心30min,将上清液吸出,加等量甘油,混匀,-20℃保存备用。
三、酶标***抗体效价的测定
***标准品购自Sigma公司。
用方阵滴定法确定***包被抗原和步骤一制备的单抗的工作浓度,***包被抗原的工作浓度为1.5μg/mL,单克隆抗体的工作浓度为1:50000。
用不同浓度的***标准品溶液做实验溶液,其浓度如下:0、0.02、0.06、0.18、0.54、1.62μg/L。采用8组平行试验(n=8)。间接竞争性ELISA方法:
(1)用上述工作浓度的***抗原包被酶标板,将***标准品实验溶液与酶标抗体溶液同时加入酶标板微孔中,同时设置空白孔(将添加的抗体溶液换成高纯水,其它一致)和阴性对照孔(将标准品实验溶液用PBS溶液代替,其它一致),25℃避光环境中反应30min;
(2)倒出孔内液体,用洗涤液洗涤3~5次,将酶标板倒置在吸水纸上拍干;
(3)加入底物显色溶液到酶标板微孔中,25℃避光环境中反应15min;
(4)加入终止液,轻轻振荡混匀,用酶标仪在波长450nm处测定OD值。
以OD值为纵坐标,以***实验溶液浓度的log10值为横坐标,绘制半对数标准曲线图。标准曲线具有完整的反S形状,并具有上平台和下平台,标准曲线的平行测定次数8次,实验重复性良好,相对标准偏差(变异系数)均在10%以内。
根据标准曲线得出半数抑制量(IC50),确定检测灵敏度。
抑制率用以下式计算:
(ODmax- ODmin)-(ODx-ODmin)
抑制率(%)=------------------------------------------------×100%
(ODmax-ODmin)
式中:ODmax:为不加标准品时的吸光值,ODx为标准品x时的吸光值,ODmin为空白对照孔的吸光值。
由上述公式计算得***抗体在缓冲液中的半数抑制量(IC50)为0.06μg/L。
实施例4、检测***的酶联免疫试剂盒及其制备
一、酶联免疫试剂盒由下述物质组成:
(1)包被***半抗原的酶标板;
(2)酶标***抗体工作液:实施例3中所述酶标抗体溶液;
(3)***标准品:***标准品溶液浓度分别为0、0.02、0.06、0.18、0.54、1.62μg/L;
(4)底物显色液:由A液和B液组成,A液为2%过氧化脲的水溶液,B液为1%四甲基联苯胺(TMB)的水溶液;
(5)终止液:0.2M硫酸水溶液;
(6)浓缩洗涤液:每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的:将10mL吐温-20、5g叠氮化钠和990mL磷酸盐缓冲液混合,得到所述洗涤液;所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M pH值为7.4;
(7)浓缩复溶液:0.04mo1/L的磷酸盐缓冲液。
二、包被有DSMS-OVA的酶标板及其制备
包被DSMS-OVA的聚苯乙烯酶标板:用0.05M的碳酸盐溶液将抗原稀释至1.5μg/mL,包被96孔聚苯乙烯酶标板,每孔100μL, 37℃温育2h,倾去包被液,用洗涤液洗涤3次,每次10s,拍干,然后在每孔中加入150μL封闭液,37℃温育2h,倾去孔内液体,干燥后用铝膜真空密封保存。
包被缓冲液:pH9.6,0.05mo1/L的碳酸钠缓冲液;
封闭液:每1升封闭液按照如下方法配制:将5mL马血清、1g叠氮化钠、30g酪蛋白混合,用磷酸盐缓冲液溶解并定容至1000mL,得到封闭液;其中,磷酸盐缓冲液的浓度为0.02M, pH值为7.2。
三、试剂盒检测方法
(一)样品前处理
(1)鸡肉、鸭肉(稀释系数:4)
a) 准确称取1±0.01 g 样品于 50 mL离心管中;b) 鸡肉样本:加入3 mL 鸡肉样品提取液;鸭肉样本:加入3 mL 鸭肉样品提取液;c) 充分涡动 1 min;
(注:须涡动至组织完全分散!)d) 4000 g 离心10 min;e) 取50 mL上清液进行检测;
(2)原奶、还原乳(稀释系数:5)
a) 还原乳:准确称取 1±0.01 g 新鲜奶粉于 50 mL 离心管中,加入10mL 去离子水充分涡动溶解备用;b) 取 200 mL 混匀样品于离心管中;c) 加入200 mL原奶提取液和 600 mL 15%甲醇水溶液,充分涡动30 s;d) 取 50 mL 进行检测。
(3)猪肉(稀释系数:10)
a) 准确称取 1±0.01 g 样品于 50 mL离心管中,加入 9 mL 猪肉样品提取液,充分涡动 1 min;b) 4000 g 离心10 min;c) 取 50 mL进行检测。
(4)猪肝、鸡肝(稀释系数:5)
a) 准确称取 1±0.01 g新鲜样品于50mL 离心管中,加入1 mL 肝脏样品提取液,充分涡动至组织分散;b) 猪肝样品:加入5 mL 猪肝样品提取液;鸡肝样品:加入5 mL 鸡肝样品提取液;c) 高速涡动1 min;d) 4000 g 离心10 min;
e) 取1 mL 上清液于4 mL 离心管中;f) 50-60℃水浴中氮气吹干;g) 依次加入 2 mL 正己烷、1 mL 肝脏样品稀释液,高速涡动1 min;h) 4000 g 离心 5 min;i) 去除上层正己烷及中间层杂质;j) 取 50 mL进行检测。
(二)用试剂盒检测
1、标准曲线的制作
向包被有DSMS-OVA的酶标板微孔中加入***标准品溶液50μL,然后加入酶标抗体工作液100μL/孔,轻轻振荡混合均匀,用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,加入洗涤工作液250mL/孔,充分洗涤4~5次,每次间隔10s,泼掉板孔内洗涤液,用吸水纸拍干。加入底物A液50μL/孔、底物B液50μL/孔,轻轻振荡混匀,25℃恒温箱避光显色15min,每孔加入终止液50μL,轻轻振荡混匀,用酶标仪,测定每孔吸光度值。
用每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100%,得到百分吸光度值。以***标准品浓度(μg/L)的半对数值为X轴,百分吸光度值为Y轴,绘制标准曲线图。得到的标准曲线如图4所示。
百分吸光度值(%)=(B/B0) ×100%
2、样品中***浓度的测定
用每个检测样本溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100%,得到百分吸光度值。相对应每一个检测样本溶液的百分吸光度值,则可从标准曲线上读出检测样本溶液的吸光度值,再根据标准品溶液的浓度值换算出样本溶液中***的残留量,最后再乘以各样品前处理过程的稀释倍数,即可计算出样品中***的浓度。
四、试剂盒检测效果评价
(一)准确度和精密度试验
向不含***的原奶样品中添加***标准品,使***标准品在样品中的终浓度分别为0.1、0.2、0.4μg/L;将添加后的样品分别按照实验三中所述方法进行前处理,得到检测样本溶液。
从三个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测,检测方法如实验三中所述,每个实验重复5次,分别计算变异系数。结果分别见表1。
表1准确度和精密度试验结果
批内变异系数:同一次测定中各平行样本的变异系数。
批间变异系数:同一样本在不同批次测定结果的变异系数,取其平均值。
结果表明:原奶样品的平均添加回收率在86.9~97.3%,批内变异系数在6.4~13.6%,批间变异系数在9.8~10.1 %。
(二)试剂盒保存期
试剂盒保存条件为2~8℃,经过15个月的测定,试剂盒的最大吸光度值(0标准),50%抑制浓度、***添加实际测定值均在正常范围之内。考虑到运输和使用过程中,会有非正常保存条件出现,将试剂盒在37℃保存的条件下放置9天,进行加速老化实验,结果表明该试剂盒的各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生,将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻9天,测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2~8℃至少可以保存12个月以上。
(三)交叉反应率试验
选择与DSMS结构或功能相似的其他药物进行交叉反应试验,通过各种药物的标准曲线分别得到其50%抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它类似物的交叉反应率。与其他药物的交叉反应率越小,说明***酶联免疫检测试剂盒对***的检测特异性越好。结果见表2。
引起50%抑制的***浓度
交叉反应率(%) =
------------------------------------------ ×100%
引起50%抑制的其他药物浓度
表2 ***试剂盒交叉反应率
试验结果表明,本发明试剂盒对***的交叉反应率为100%、曲安西龙的交叉反应率为52%、***龙的交叉反应率为14%、倍他米松的交叉反应率为24%、氢化可的松的交叉反应率为1.5%,所以试剂盒对***的特异性好,即本发明试剂盒可以检测***。
Claims (10)
1.一种***半抗原,为式1所示产物:
式1。
2.式1所示产物的制备方法,包括如下步骤:50ml圆底烧瓶中加入***原料药500mg,5ml吡啶溶解后加入琥珀酸酐110mg,80℃反应3h,TLC检测原料反应完毕后处理,减压蒸除吡啶,残余物中加入10ml冰水,析出白色固体,过滤,水洗干燥得350mg产品,即是半抗原。
3.一种***抗原,是将式1所示产物和载体蛋白偶联得到的偶联物。
4.根据权利要求3所述的***抗原,其特征在于,所述载体蛋白可为牛血清白蛋白,卵清蛋白,人血清白蛋白,鼠血清白蛋白,甲状腺蛋白或血蓝蛋白。
5.权利要求3所述***抗原的制备方法,包括如下步骤:(1)、将半抗原22mg溶解于1.5mL DMF中,完全溶解后,依次加入EDC 25mg,NHS 25mg,室温磁力搅拌反应3h;(2)、称取50mgBSA,溶解于3.5mL 0.1M碳酸缓冲液pH=9.6中,400rpm搅拌10min,充分溶解;(3)、取上述步骤1中活化溶液,在冰水浴环境下逐滴加入到蛋白溶液中,边加边搅拌,室温磁力搅拌反应24h;(4)、将反应产物装入1个蒸馏水冲洗干净透析袋(15cm),1LPBS透析3天,室温搅拌透析,每天更换透析液3次,透析产物4500rpm离心6min,0.5ml/管分装,将抗原编号,-20℃保存备用。
6.权利要求3所述***抗原在制备***特异性抗体中的应用。
7.应用权利要求3所述***抗原制备得到的特异性抗体。
8.权利要求1所述产物、权利要求3所述***抗原、权利要求7所述抗体在检测***中的应用。
9.应用权利要求1所述产物、权利要求3所述***抗原、权利要求7所述特异性抗体制备得到的酶联免疫检测试剂盒。
10.权利要求8所述酶联免疫检测试剂盒,其特征在于,它包括:包被有***抗原的酶标板、酶标抗体工作液、***系列标准品、底物显色液、终止液、浓缩复溶液、浓缩洗涤液。
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