CN106316923B - 双取代吲哚-2(1h)-酮类衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

双取代吲哚-2(1h)-酮类衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双取代吲哚‑2(1H)‑酮类衍生物及其制备方法和应用，所述双取代吲哚‑2(1H)‑酮类衍生物的化学结构式如下所示：

Description

双取代吲哚-2(1H)-酮类衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及双取代吲哚-2(1H)-酮类衍生物，本发明还涉及它们的制备方法以及医药用途。
背景技术
近年来，肺癌的死亡率无论在男性或在女性癌症患者中均排在第一位，已成为严重危害人类健康的重大疾病之一。因此，寻找治疗肺癌的新型有效药物具有重要的实际意义。肺癌的发生发展是多因素、多基因、多途径的复杂过程，其中细胞生长失控是一个重要因素，并常以细胞信号转导异常为主要特征。
肺癌的治疗手段有手术、放疗和化疗。一线的化疗药物多属于细胞毒类药，具有不良反应多、选择性差的缺点。抗肺癌药物的研究已从传统的非选择性细胞毒药物向针对肺癌发生机制的新型靶向药物发展。寻找针对多个信号通路、多个作用靶点的肺癌治疗药物也成为药物化学研究的活跃领域。
RAF-MEK-ERK通路和PI3K-PDK1-AKT通路在肺癌中被大量激活，在肺癌细胞的增殖、分化、侵袭、转移等过程中发挥着重要作用，且两条通路间存在通路信号交联作用(Cross-talking)。大量的研究表明，使用特异性激酶抑制剂或RNA干扰技术可以显著抑制癌细胞的增殖、转移和侵袭能力。
RAF-MEK-ERK通路是丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated proteinkinases,MAPK)家族主要成员之一，通过三级级联放大方式发挥作用。首先，大量的细胞外因子(如PDGF、IGF和VEGF)与细胞膜相应受体结合，激活RAS蛋白(K-RAS、N-RAS和H-RAS)。活化型的RAS可以磷酸化下游的RAF(A-RAF、B-RAF和C-RAF)，并随后激活MEK(MEK1和MEK2)以及后续的ERK(ERK1和ERK2)。ERK被激活后，可以迅速作用于200多个下游底物，如作用于细胞质内的底物如RSKs、Paxillin、IQGAP、MSK1/2等；另一方面，磷酸化的ERK(PhosphorlatedERK,p-ERK)等以二聚体的形式转移至细胞核内，作用于细胞核内的大量底物，如Elk-1、c-Fos，这些大量的下游底物调控着细胞的转录、增殖、生长、分化和迁移等各个环节。
RAF-MEK-ERK通路的高表达和持续激活与肿瘤的发生发展密切相关，是癌症的发病和耐药的主要机制之一。统计数据表明，在近30％的肿瘤中可观察到RAS的突变，突变型的RAS可以导致持续的RAF磷酸化和MEK的激活[9]。另外的报道显示，在70％的黑色瘤，100％的多毛黑色素瘤和41％的肝癌中存在B-RAF的突变。B-RAFV600E在各种B-RAF突变癌症中占到了90％，例如恶性黑色素瘤、结肠直肠癌、卵巢癌和甲状腺***瘤。即使缺乏细胞外信号刺激时，B-RAFV600E仍可以将自身放大信号500倍然后促进MEK及ERK的强烈活化，这使得具备B-RAFV600E通路信号的癌细胞不依赖细胞外的细胞因子刺激而能自主大量激活下游通路。同时，在许多其他恶性肿瘤中，例如甲状腺癌，大肠癌和乳腺癌，RAF-MEK-ERK通路也被不同程度的过度激活。
PI3K-PDK1-AKT通路由磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphoinositol 3-kinase,PI3K)、PDK1和下游丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT组成。PI3K由相对分子量110×103道尔顿的催化亚基(p110)和相对分子量为85×103道尔顿的调节亚基(p85)所构成的异源二聚体组成，有两种激活方式：一种是与具有磷酸化酪氨酸残基的生长因子受体或连接蛋白相互作用，引起二聚体构象改变而被激活；一种是通过RAS和p110直接结合导致PI3K的活化。活化的PI3K能特异性催化磷酯酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)上的3-位羟基磷酸化，产生PIP3。PIP3作为第二信使与AKT的氨基端PH结构域结合，使得AKT从细胞质转位到细胞膜上，定位于磷酸肌醇依赖性激酶-1(3-phosphoinositol dedependent kinase 1,PDK1)。并促使PDK1磷酸化AKT上的Ser308使AKT完全活化。磷酸化的AKT进一步磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白mTOR、Bad、caspase 9、NF-κB、GSK-3、FKHR、p21Cip1等，进而调节细胞的增殖、分化、凋亡和迁移。因此，阻断该通路的持续活化为抗肺癌药物研究提供了新思路。
大量研究表明，PI3K-PDK1-AKT通路的过度激活与肺癌等多种实体瘤和急、慢性白血病、淋巴瘤等非实体瘤中呈明显相关性。编码p110亚基的pik3ca基因突变率在乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌和肝癌中最高，且在肺癌、子***和卵巢癌中，pik3ca高表达水平已被确证为关键靶标。同时，编码p85亚基的pik3r1基因突变也常常被检测到，可能也与PI3K-PDK1-AKT通路的高度激活相关。PTEN可以负反馈调节PI3K-PDK1-AKT通路的磷酸化水平，其功能的缺失是PI3K-PDK1-AKT通路高度激活的另一主要原因。而高表达和高磷酸化水平的PI3K-PDK1-AKT通路参与了癌症的整个病程，并介导了癌症细胞的耐药作用，如PI3K抑制剂可以用于克服肿瘤对抗西妥昔单抗(靶向结合EGFR)和拉帕替尼(EGFR和HER2双重抑制剂)等的耐药。目前，数十个用于治疗多种恶性肿瘤的PI3K-PDK1-AKT通路抑制剂进入了临床试验阶段。
随着高特异性单靶点抑制剂常常会导致的获得性耐药和联合用药的弊端，双通路抑制剂和单药多靶点抑制剂的研究逐渐成为研究的关注点，其目标就是寻找到能够同时调控多个信号通路而不是单一抑制某一个靶标。本课题组于2009年首次报道了RAF-MEK-ERK和PI3K-PDK1-AKT双通路抑制剂的研究，合成一系列的噻唑酮类化合物能够显著抑制人白血病U937细胞增殖，并首次发现化合物A能够同时抑制RAF-MEK-ERK通路和PI3K-PDK1-AKT通路激活，诱导细胞停滞在G0/G1细胞周期，该研究将有助于进一步的双通路抑制剂的开发。本课题组在通过结构拼接设计合成出了两个系列的吲哚-2(1H)-酮类结构，在肺癌细胞株A549中抑制浓度均达到了微摩尔水平，其中化合物B和化合物C的IC50分别为9.9μM和6.4μM。
Western Blot实验在100μM时，化合物B和化合物C均能显著抑制p-ERK水平，表明化合物抗肺癌的作用机制之一是通过抑制RAF-MEK-ERK通路，同时，进一步的PI3K-PDK1-AKT通路机制研究正在进行中。
发明内容
本发明的目的是提供了一种双取代吲哚-2(1H)-酮类衍生物，还提供了所述化合物的制备方法和它们在制备抗肺癌药物中的应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种双取代吲哚-2(1H)-酮类衍生物，结构通式如式(I-III)所示：
其中，R1选自H、羟基、氨基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基，C1-C6烷胺基，位置处于氨基的邻、间、对位。
吲哚-2(1H)-酮苯环上芳基氨的取代位置位于C4-C7位且为单取代。
R2选自C1-C8直链或支链烷基、C3-C6环烷基、含有羟基取代的C1-C8直链或支链烷基，C6-C10取代芳烃基，其中C6-C10取代芳烃结构中的取代基选自羟基、氨基、卤素、亚甲二氧基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基，C1-C6烷胺基；
及其药学上可用的盐。
优选方案，所述双取代吲哚-2(1H)-酮类衍生物，结构通式如式I所示：
其中，R1选自H、卤素；位置处于氨基的邻、间、对位；
吲哚-2(1H)-酮苯环上芳基氨的取代位置位于4-7位取代；
R2选自C3-C6环烷基、苯基或者有取代基的苯基。如实施例的化合物6和7等。
优选方案，所述双取代吲哚-2(1H)-酮类衍生物，结构通式如式II所示：
其中，R1选自H、C1-C6烷氧基；位置处于氨基的邻、间、对位；
吲哚-2(1H)-酮苯环上芳基氨的取代位置位于4-7位取代；
R2选自C1-C8直链或支链烷基。如实施例的化合物13等。
优选方案，所述双取代吲哚-2(1H)-酮类衍生物，结构通式如式III所示：
其中，R1选自H、C1-C6烷氧基；位置处于氨基的邻、间、对位；
吲哚-2(1H)-酮苯环上芳基氨的取代位置位于4-7位取代；
R2选自C1-C5直链或支链烷基。如实施例的化合物16等。
优选方案，所述双取代吲哚-2(1H)-酮类衍生物，结构通式如式III所示：
其中，R1选自H、卤素、C1-C6卤代烷基；位置处于氨基的邻、间、对位；
吲哚-2(1H)-酮苯环上芳基氨的取代位置位于4-7位取代；
R2选自C1-C8直链或支链烷基、如化合物17-42等。
所述双取代吲哚-2(1H)-酮类衍生物的制备方法，具体步骤包括：
所述化合物IV为：
化合物V为
R1选自H、F、Cl、-CF3、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、C1-C3卤代烷基；
(2)中间体V在钯碳还原下得到化合物VI
(3)化合物VI与有机醇在水合三氯化钌的作用下，短时间内优先得双键产物I；所述有机醇为选自但不仅限于正丁醇、正戊醇、异戊醇、正己醇、环己基甲醇等烷烃醇、苯甲醇、胡椒醇等芳香醇。
(4)化合物I发生双键还原反应，得产物II；
(5)化合物VI与有机醇在水合三氯化钌的作用下，延长反应时间，得产物III；
本发明还提供式(I)、式(II)和式(III)化合物的合成方法，以3-取代-5-取代苯胺吲哚-2(1H)-酮衍生物为例，合成路线如下：
所述化合物I和II优选以如下步骤的方法制得：
(1)2-氟-4-溴硝基苯在氢化钠的存在下与丙二酸二乙酯反应，进一步在醋酸、盐酸中进行脱羧得到5-溴-2-硝基苯乙酸。所选用的酸为硫酸、盐酸、磷酸，优选的是盐酸。温度优选的是120℃。
(2)5-溴-2-硝基苯乙酸在乙醇中回流酯化得到5-溴-2-硝基苯乙酸乙酯(IV)。
(3)5-溴-2-硝基苯乙酸乙酯(IV)在钯催化下，与取代苯胺反应得到得到化合物V。温度可以是80℃-150℃范围，优选的是100℃。
(4)中间体V在钯碳还原下得到化合物VI，温度可以是20-60℃范围，优选的是45℃。
(5)化合物VI通过与有机醇反应不同时间得到终产物I或化合物III。温度可以是90℃-140℃范围，优选的是110℃。
(6)化合物I在钯碳还原条件下，最终得产物II。
附图说明
图1化合物39对细胞信号通路的影响。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明做进一步的解释和说明
2-硝基-3-溴苯丙乙酸二乙酯的合成
向装有20ml正己烷、磁力搅拌子和温度计的250ml三颈瓶中加入60％NaH(5.0g，125mmol)，搅拌均匀后静置2min，弃去上层清液。缓慢加入DMSO溶剂90ml，调节搅拌速度至适中，用恒压滴液漏斗缓慢滴加丙二酸二乙酯(13.5g，100mmol)，滴加过程中产生大量氢气并放热(温度控制在40℃以内)，同时注意保持内外压力均一。滴加完毕后将反应液放入60℃油浴继续搅拌15min，取出并冷却至室温。逐步投入溶解在50ml的DMSO溶液中的原料2-氟-4-溴硝基苯(11.0g，50mmol)，溶液立即变成深黑红色，加上冷凝管，将装置放入80℃油欲反应4.5h。停止反应，冷却至室温，用100ml饱和NH4Cl溶液淬灭反应。用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯层用饱和NaCl溶液洗2次，Na2SO4干燥并放置5h；旋干有机溶剂，冷却后析出17.9g 2-硝基-3-溴苯丙二酸二乙酯，黄色晶体，直接投入下一步反应。
2-硝基-3-溴苯乙酸的合成
向250ml三颈瓶中加入60ml 6N盐酸、60ml AcOH和2-硝基-3-溴苯丙二酸二乙酯(18.0g，50mmol)，装上温度计和冷凝管，放入110℃搅拌反应过夜。反应完成后取出装置冷却至室温，取出搅拌子，用真空泵旋转蒸发仪旋干溶剂，得到12.5g白色2-硝基-3-溴苯乙酸，mp.174.4-175.9℃，收率98％。
2-硝基-3-溴苯乙酸乙酯的合成
取250ml的三颈瓶，依次加入100ml无水乙醇，0.5ml浓硫酸和2-硝基-3-溴苯乙酸(12.9g，50mmol)，组装上温度计和冷凝管，放入油浴回流反应过夜。停止反应，去容器并逐步降温至室温，然后放入-5℃冰箱过夜，析出大量白色絮状物，用布氏漏斗过滤，得到12.5g白色固体2-硝基-3-溴苯乙酸乙酯，收率99.2％。
2-硝基-3-取代苯胺基苯乙酸乙酯的合成
取一个装有温度计和氩气保护***的100ml三颈瓶，依次加入2-硝基-3-溴苯乙酸乙酯(2.9g，10mmol)、Cs2CO3(6.5g，20mmol)、Pd(PPh3)4(0.11g，1mmol)，加入45ml DMF，搅拌均匀后滴加取代苯胺(15mmol)，装上冷凝管，放入90℃油浴中，氩气保护反应5h。将反应冷却至室温，加入70ml水，然后用6N稀盐酸将溶液调节PH至5.0-6.0，用乙酸乙酯萃取3次，有机层用饱和NaCl溶液洗2次，加入过量的Na2SO4干燥5h。旋干即2-硝基-3-(取代苯胺基)苯乙酸乙酯，直接投入下一步反应。
5-取代苯胺吲哚-2(1H)-酮的合成
使用氢气还原仪装置，向装置的烧杯中加入2-硝基-3-(取代苯胺基)苯乙酸乙酯(10mmol)、0.14g 10％Pd/C，加入45ml AcOH溶剂，加入搅拌子，放入氢气还原仪中，调节氢气压力至0.4MPa，室温搅拌反应过夜。反应完成后过滤，回收Pd/C，将滤液旋干，用少量乙酸乙酯溶解样品，加入6g 200-300目硅胶拌样，使用50倍200-300目硅胶过柱分纯，洗脱体系使用石油醚：乙酸乙酯为2：1。
结构式I目标化合物的合成通法
取5-(取代苯胺)吲哚-2(1H)-酮(1.0mmol)放入50ml装有氩气保护装置的三颈瓶中，依次加入0.15g PPh3(0.4mmol)、40mg NaOH(1mmol)和42mg水合RuCl3(0.2mmol)，加入15ml甲苯，搅拌均匀后加入0.30g正丁醇(5mmol)，放入110℃氩气保护中回流反应，1.5h反应完全。加入50ml二氯甲烷和60ml水，用二氯甲烷萃取3次，有机层用饱和NaCl溶液洗涤2次，用过量无水Na2SO4干燥5h，将有机层旋干后用乙酸乙酯和200-300目硅胶拌样。洗脱体系用石油醚：乙酸乙酯＝3：1，加入15g 200-300目硅胶装柱，柱层析纯化。
(E)-3-正丁烯基-5-(4-甲基苯胺基)吲哚-2(1H)-酮(化合物1)
按照化合物I合成方法，得到红色固体，mp.>180℃,HPLC:95.90％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.25(s,1H),7.78(s,1H),7.30(d,J＝1.4Hz,1H,Ar-H),7.00(d,J＝8.2Hz,2H,Ar-H),6.95(dd,J＝8.3,1.9Hz,1H,Ar-H),6.89–6.85(m,2H,Ar-H),6.80–6.72(m,2H,Ar-H),2.55(q,J＝7.5Hz,2H),2.20(s,3H),1.65–1.55(m,2H),0.97(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:168.45,142.69,140.68,138.39,136.08,130.03,129.27,127.88,123.28,119.01,116.20,114.95,110.53,30.88,21.93,20.68,14.30.HRMS(ESI)m/z calcd for[C19H20N2O+H]+293.1654；found,293.16269[M+H]+.
(E)-3-环己甲烯基-5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物2)
按照化合物I合成方法，以5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮和环己基甲醇为原料，得到红色固体，yield:89.5％,mp.172.4-173.5℃,HPLC:99.2％.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.25(s,1H),7.82(s,1H),7.27(d,J＝1.8Hz,1H,Ar-H),7.01(d,J＝8.3Hz,2H,Ar-H),6.94(dd,J＝8.3,2.1Hz,1H,Ar-H),6.89(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H),6.74(d,J＝8.3Hz,1H,Ar-H),6.59(d,J＝9.5Hz,1H),2.79(d,J＝9.8Hz,1H),2.21(s,3H),1.75(dd,J＝20.0,11.6Hz,4H),1.67(d,J＝10.3Hz,1H),1.42–1.20(m,5H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:168.72,145.22,142.46,138.56,135.94,130.02,128.01,127.68,122.78,118.85,116.39,114.25,110.64,37.74,31.65,25.75,25.57,20.70.HRMS(ESI)m/z calcd for[C22H24N2O+H]+333.1967；found,333.1959[M+H]+.
(E)-3-(3，4-亚甲基二氧苯基)甲烯基-5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物3)
按照化合物I合成方法，以5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮和胡椒醇为原料，得到红色固体，yield:86.5％,mp.175.1-175.8℃,HPLC:97.5％.H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.34(s,1H),7.75(s,1H),7.49(s,1H),7.43(d,J＝2.0Hz,1H),7.30–7.22(m,2H),7.03–6.99(m,3H),6.90(dd,J＝8.3,2.1Hz,1H),6.83(dd,J＝7.7,5.9Hz,2H),6.76(d,J＝8.3Hz,1H),6.10(s,2H),2.20(d,J＝5.9Hz,3H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:169.26,148.89,148.06,142.20,138.27,136.62,136.07,130.03,128.79,127.96,127.38,124.77,122.01,120.08,116.54,112.25,111.02,109.70,109.11,102.04,20.71.HRMS(ESI)m/z calcd for[C23H18N2O3+H]+371.1396；found,371.1394[M+H]+.
(E)-3-(3，4-亚甲基二氧苯基)甲烯基-5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物4)
按照化合物I合成方法，以5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮和胡椒醇为原料，得到红色固体，yield:90.3％,mp.161.2-162.8℃,HPLC:97.3％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.38(s,1H),7.86(s,1H),7.50(s,1H),7.42(d,J＝2.0Hz,1H,Ar-H),7.31–7.23(m,2H,Ar-H),7.07–7.00(m,3H,Ar-H),6.96–6.89(m,3H,Ar-H),6.78(dd,J＝9.5,5.3Hz,1H,Ar-H),6.09(s,2H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:169.26,148.92,148.05,141.31,138.04,136.95,136.25,128.74,127.26,124.77,122.08,120.33,117.67,117.61,116.18,116.01,112.42,111.10,109.75,109.10,102.05.HRMS(ESI)m/z calcd for[C22H15FN2O3+H]+375.1145；found,375.1118[M+H]+.
(E)-3-异戊烯基-5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物5)
按照化合物I合成方法，以5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮和异戊醇为原料，得到红色固体，yield:79.9％,mp.184.5-185.8℃,HPLC:96.4％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.34(d,J＝6.0Hz,1H),8.09(s,1H),7.34(d,J＝8.0Hz,1H,Ar-H),7.23–7.16(m,3H,Ar-H),7.01(dd,J＝8.3,1.9Hz,1H,Ar-H),6.81–6.79(m,1H,Ar-H),1.91(td,J＝13.4,6.7Hz,1H),1.66(dt,J＝11.9,6.6Hz,1H),1.56–1.34(m,1H),0.97(dd,J＝6.5,3.8Hz,6H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ:168.40,144.61,140.21,137.18,136.92,129.36,123.41,121.83,120.63,116.86,116.57,116.42,110.62,37.81,28.60,22.82.HRMS(ESI)m/z calcd for[C19H19ClN2O+H]+327.1264；found,327.1238[M+H]+,343.1186[M+Na]+.
(E)-3-环己甲烯基-5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物6)
按照化合物I合成方法，以5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮和环己基甲醇为原料，得到红色固体，yield:83.6％,mp.165.2-167.1℃,HPLC:95.1％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.26(s,1H),7.82(s,1H),7.27(d,J＝1.5Hz,1H),6.99(t,J＝9.7Hz,2H),6.93(dt,J＝6.5,3.2Hz,1H),6.90–6.86(m,2H),6.74(t,J＝7.4Hz,1H),6.59(d,J＝9.5Hz,1H),2.78(q,J＝10.1Hz,1H),1.75(dd,J＝24.6,12.0Hz,4H),1.67(d,J＝11.8Hz,1H),1.38–1.22(m,5H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:168.72,145.22,142.46,138.55,135.94,130.01,128.00,127.68,122.78,118.84,116.37,114.25,110.64,37.74,31.65,25.75,25.57,20.70.HRMS(ESI)m/z calcd for[C21H21ClN2O+H]+355.1391.(E)-3-苯甲烯基-5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物7)
按照化合物I合成方法，以5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮和苯甲醇为原料，得到红色固体，yield:88.1％,mp.192.4-194.8℃,HPLC:98.2％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.48(s,1H),8.04(s,1H),7.70(d,J＝7.5Hz,2H),7.62(s,1H),7.50(dd,J＝11.4,4.4Hz,2H),7.45(d,J＝7.2Hz,1H),7.34(d,J＝2.0Hz,1H),7.20(d,J＝2.1Hz,1H),7.19(d,J＝2.0Hz,1H),6.96(dd,J＝8.3,2.2Hz,1H),6.88(d,J＝2.1Hz,1H),6.86(d,J＝2.1Hz,1H),6.81(d,J＝8.3Hz,1H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:169.05,144.08,137.80,136.81,136.24,134.92,130.05,129.64,129.34,129.24,128.59,121.95,121.87,116.83,113.89,111.20.HRMS(ESI)m/z calcd for[C21H15ClN2O+H]+347.0951；found,347.9225[M+H]+.
(E)-3-(3，4-亚甲基二氧苯基)甲烯基-5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物8)
按照化合物I合成方法，以5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮和胡椒醇为原料，得到红色固体，yield:87.4％,mp.197.9-199.2℃,HPLC:98.1％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.43(s,1H),8.05(s,1H),7.52(s,1H),7.45(d,J＝1.9Hz,1H,Ar-H),7.28(d,J＝7.1Hz,2H,Ar-H),7.22–7.17(m,2H,Ar-H),7.04(d,J＝8.6Hz,1H,Ar-H),6.95(dd,J＝8.4,2.1Hz,1H,Ar-H),6.91(dd,J＝7.0,5.0Hz,2H,Ar-H),6.81(d,J＝8.3Hz,1H,Ar-H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:169.26,148.96,148.07,144.13,137.63,136.83,136.43,129.38,128.74,127.16,124.82,122.13,121.94,121.51,116.93,113.72,111.10,109.74,109.12,102.05.HRMS(ESI)m/z calcd for[C22H15ClN2O3+H]+391.0849；found,391.0620[M+H]+.
结构式II目标化合物的合成通法
使用氢化还原仪催化还原，取化合物I(0.5mmol)放入容器中，加入10mg 10％Pd/C和10ml无水乙醇，调节氢气压力至0.4MPa，搅拌反应1.5h。过滤回收Pd/C，将滤液旋干至6ml左右，放入75℃油浴重结晶，缓慢滴加水，至恰好沉淀不溶解为止，约4ml水。逐步冷却至室温，然后放入-5℃冰箱过夜，得到化合物II。
3-异戊基-5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物9)
按照化合物II合成方法，以3-环己甲烯基-5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮为原料，得到白色固体，yield:99.1％,mp.185.1-185.8℃,HPLC:98.5％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.16(s,1H),7.72(s,1H),6.97(d,J＝7.8Hz,3H,Ar-H),6.86(dd,J＝13.7,5.1Hz,3H,Ar-H),6.71(d,J＝8.2Hz,1H,Ar-H),2.19(s,3H),1.89–1.71(m,2H),1.48(dt,J＝13.2,6.6Hz,1H),1.14–1.07(m,2H),0.83(d,J＝6.6Hz,6H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:179.09,142.88,138.34,136.55,131.15,129.96,127.66,117.64,116.05,115.67,109.93,45.94,34.60,28.16,27.97,22.85,20.66.HRMS(ESI)m/z calcd for[C20H24N2O+H]+309.1967；found,309.1943[M+H]+.
3-环己甲-5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物10)
按照化合物II合成方法，以3-环己甲烯基-5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮为原料，得到白色固体，yield:98.4％,mp.171.2-172.8℃,HPLC:97.5％.1H NMR(500MHz,DMSO)δ10.15(s,1H),7.74(s,1H),7.00(t,J＝11.0Hz,2H,Ar-H),6.93(s,1H,Ar-H),6.90–6.81(m,3H,Ar-H),6.71(d,J＝8.2Hz,1H,Ar-H),3.42(dt,J＝13.6,4.1Hz,1H),2.20(s,3H),1.76–1.51(m,8H),1.21–1.11(m,3H),0.95–0.85(m,2H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:179.55,142.80,138.25,136.23,131.59,129.97,127.70,117.42,116.10,115.82,109.97,43.59,38.27,34.65,33.54,32.84,26.49,26.27,26.17,20.68.HRMS(ESI)m/z calcd for[C22H26N2O+H]+335.2123；found,335.2100[M+H]+.
3-(3，4-亚甲基二氧苯基)甲烯基-5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物11)
按照化合物II合成方法，以3-胡椒烯基-5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮为原料，得到白色固体，yield:99.2％,mp.194.5-195.8℃,HPLC:98.5％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.16(s,1H),7.64(s,1H),6.96(d,J＝8.2Hz,2H,Ar-H),6.77(dd,J＝7.7,3.2Hz,3H,Ar-H),6.73(d,J＝8.3Hz,2H,Ar-H),6.67–6.62(m,3H,Ar-H),5.93(d,J＝4.5Hz,2H),3.73(dd,J＝8.1,5.0Hz,1H),3.23(dd,J＝13.9,4.9Hz,1H),2.81(dd,J＝13.9,8.5Hz,1H),2.20(d,J＝4.4Hz,3H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:178.37,147.46,146.08,142.72,138.09,136.32,132.42,130.27,129.94,129.88,127.54,122.76,118.14,116.05,115.74,110.05,109.82,108.36,101.12,77.25,47.25,35.62,20.68.HRMS(ESI)m/z calcd for[C23H20N2O3+H]+373.1552；found,373.1526[M+H]+,395.1340[M+Na]+.
3-(3，4-亚甲基二氧苯基)甲烯基-5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物12)
按照化合物II合成方法，以3-胡椒烯基-5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮为原料，得到白色固体，yield:99.5％,mp.195.2-197.1℃,HPLC:97.5％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.19(s,1H),7.75(s,1H),6.99(dd,J＝15.2,6.3Hz,2H,Ar-H),6.78(td,J＝8.7,4.1Hz,5H,Ar-H),6.64(dd,J＝20.3,7.6Hz,3H,Ar-H),5.93(s,2H),3.73(dd,J＝8.2,5.0Hz,1H),3.23(dd,J＝13.9,4.9Hz,1H),2.81(dd,J＝13.9,8.4Hz,1H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:178.39,147.45,146.07,141.92,137.79,136.77,132.41,130.37,122.78,118.57,116.97,116.91,116.14,116.00,115.82,110.13,109.84,108.37,101.12,47.26,35.55.HRMS(ESI)m/z calcd for[C22H17FN2O3+H]+377.1301；found,377.1270[M+H]+.
3-异戊基-5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物13)
按照化合物II合成方法，以3-异戊烯基-5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮为原料，得到绿色固体，yield:98.5％,mp.173.4-174.8℃,HPLC:95.7％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.13(s,1H),7.75(s,1H),6.91(d,J＝7.8Hz,3H,Ar-H),6.86(dd,J＝13.7,5.1Hz,3H,Ar-H),6.73(d,J＝8.2Hz,1H,Ar-H),1.88–1.71(m,2H),1.47(dt,J＝13.2,6.6Hz,1H),1.14–1.07(m,2H),0.83(d,J＝6.6Hz,6H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:179.05,142.82,138.35,136.55,131.15,129.96,127.66,117.64,116.05,115.67,109.93,45.94,34.60,27.97,22.85,20.66.HRMS(ESI)m/z calcd for[C19H21ClN2O+H]+329.1421；found,329.1481[M+H]+.
3-环己甲-5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物14)
按照化合物II合成方法，以3-环己甲烯基-5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮为原料，得到白色固体，yield:99.3％,mp.202.6-204.1℃,HPLC:94.9％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.09(d,J＝58.9Hz,1H),7.75(d,J＝16.6Hz,1H),6.98(d,J＝8.2Hz,2H),6.94(s,1H),6.86(dd,J＝12.5,5.1Hz,3H),6.70(t,J＝6.8Hz,1H),3.39(dd,J＝13.9,7.4Hz,1H),1.79–1.49(m,8H),1.21–1.10(m,3H),0.91(dd,J＝22.7,9.0Hz,2H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:179.55,142.81,138.26,136.24,131.58,129.97,127.70,117.43,116.10,115.82,109.97,43.59,34.65,33.54,32.84,26.50,26.28,26.18,20.68.HRMS(ESI)m/z calcd for[C21H23ClN2O+H]+355.1577；found,355.1600[M+H]+.
3-(3，4-亚甲基二氧苯基)甲烯基-5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物15)
按照化合物II合成方法，以3-胡椒烯基-5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮为原料，得到白色固体，yield:98.9％,mp.212.3-212.9℃,HPLC:97.1％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.23(s,1H),7.96(s,1H),7.14(dd,J＝11.9,8.4Hz,2H),6.80(dd,J＝18.6,7.3Hz,5H),6.71–6.63(m,3H),5.93(s,2H),3.76(dd,J＝7.6,4.4Hz,1H),3.25(dd,J＝13.7,4.4Hz,1H),2.84(dd,J＝13.7,8.3Hz,1H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:178.44,147.45,146.08,144.69,137.52,136.63,132.37,130.39,129.46,129.21,122.78,121.57,119.83,117.31,116.41,115.27,110.15,109.88,108.37,101.13,47.25,35.48.HRMS(ESI)m/z calcd for[C22H17ClN2O3+H]+393.1006；found,393.2147[M+H]+,415.1575[M+Na]+.
结构式III目标化合物的合成
结构式III目标化合物的合成和结构式I目标化合物合成的投料部分一致，不同的是，反应时间需要5.5h，洗脱体系是石油醚：乙酸乙酯为3：2具体如下：取1mmol化合物V放入50ml装有氩气保护装置的三颈瓶中，依次加入0.15g PPh3(0.4mmol)、40mg NaOH(1mmol)和42mg水合RuCl3(0.2mmol)，加入15ml甲苯，搅拌均匀后加入0.44g正戊醇(5mmol)，放入110℃氩气保护中回流反应，5.5h反应完全。加入50ml二氯甲烷和60ml水，用二氯甲烷萃取3次，有机层用饱和NaCl溶液洗涤2次，用过量无水Na2SO4干燥5h，将有机层旋干后用乙酸乙酯和200-300目硅胶拌样。洗脱体系用石油醚：乙酸乙酯＝3：1，加入15g 200-300目硅胶装柱纯化。
3-羟基-3-正戊基-5-(4-甲氧基苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物16)
按照化合物III合成方法，以5-(4-甲氧基苯胺)吲哚-2(1H)-酮和正己醇为原料，得到黄色固体，yield:75.1％,mp.192.6-194.3℃,HPLC:97.9％.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.98(s,1H),7.63(s,1H),6.94(t,J＝6.3Hz,3H,Ar-H),6.70–6.77(m,3H,Ar-H),6.68(t,J＝13.7Hz,1H,Ar-H),5.76(s,1H),3.71(s,3H),1.79–1.64(m,2H),1.26–1.11(m,6H),1.12–0.90(m,2H),0.85(t,J＝6.8Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:179.99,153.45,139.96,138.19,134.53,133.58,118.87,116.87,115.02,113.89,110.30,76.45,55.69,38.37,31.55,29.22,23.16,22.39,14.35.HRMS(ESI)m/z calcd for[C20H24N2O3+H]+341.1865；found,341.1414[M+H]+.
3-羟基-3-正己基-5-(4-甲氧基苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物17)
按照化合物III合成方法，以5-(4-甲氧基苯胺)吲哚-2(1H)-酮和正己醇为原料，得到白色固体，yield:76.4％,mp.174.9-178.1℃,HPLC:96.0％.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.99(s,1H),7.61(s,1H),6.92(t,J＝6.3Hz,3H,Ar-H),6.88–6.77(m,3H,Ar-H),6.67(t,J＝13.7Hz,1H,Ar-H),5.76(s,1H),3.69(s,3H),1.76–1.62(m,2H),1.24–1.11(m,6H),1.09–0.90(m,2H),0.81(t,J＝6.8Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:179.63,153.44,139.93,138.19,134.50,133.58,118.87,116.87,115.02,113.89,110.30,76.45,55.69,38.37,31.53,29.22,23.16,22.39,14.35.HRMS(ESI)m/z calcd for[C21H26N2O3+H]+355.2021；found,355.2013[M+H]+.
3-羟基-3-苯甲基-5-(4-甲氧基苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物18)
按照化合物III合成方法，以5-(4-甲氧基苯胺)吲哚-2(1H)-酮和苯甲醇为原料，得到白色固体，yield:81.2％,mp.194.3-195.4℃,HPLC:95.33％.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.87(s,1H),7.55(s,1H),7.20–7.10(m,3H,Ar-H),7.05–6.93(m,2H,Ar-H),6.87–6.78(m,4H,Ar-H),6.77(d,J＝2.2Hz,1H,Ar-H),6.71(dd,J＝8.2,2.3Hz,1H,Ar-H),6.50(d,J＝8.2Hz,1H,Ar-H),6.05(s,1H),3.70(s,3H),3.18–2.87(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:179.13,153.30,139.48,138.29,135.78,134.55,132.29,130.66,128.03,126.76,118.62,117.86,115.00,114.51,110.28,77.27,55.71,44.04.HRMS(ESI)m/z calcd for[C22H20N2O3+H]+361.1552；found,361.1546[M+H]+.
3-羟基-3-正丁基-5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物19)
按照化合物III合成方法，以5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮和正丁醇为原料，得到绿色固体，yield:74.5％,mp.212.3-213.7℃,HPLC:95.5％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.03(s,1H),7.77(s,1H),6.99(dd,J＝7.9,5.1Hz,3H,Ar-H),6.93–6.83(m,3H,Ar-H),6.69(d,J＝8.2Hz,1H,Ar-H),5.80(s,1H),2.20(s,3H),1.80–1.67(m,2H),1.26–1.15(m,2H),1.09–0.89(m,2H),0.79(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:179.68,142.63,138.74,135.18,133.56,130.00,127.87,118.30,116.28,115.15,110.30,76.42,38.14,25.50,22.79,20.68,14.34.HRMS(ESI)m/z calcd for[C19H22N2O2+H]+311.1759；found,293.1647[M-HO]+,311.1751[M+H]+,333.1570[M+Na]+.
3-羟基-3-正戊基-5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物20)
按照化合物III合成方法，以5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮和正戊醇为原料，得到褐色固体，yield:69.5％,mp.192.8-194.2℃,HPLC:96.7％.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.02(s,1H),7.75(s,1H),6.99(d,J＝8.4Hz,3H,Ar-H),6.86(t,J＝9.8Hz,3H,Ar-H),6.68(d,J＝7.9Hz,1H,Ar-H),5.78(s,1H),2.20(s,3H),1.69(d,J＝7.0Hz,2H),1.13(d,J＝32.9Hz,4H),1.02(d,J＝36.1Hz,2H),0.78(s,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:179.67,142.65,138.72,135.18,133.54,129.99,127.85,118.36,116.27,115.14,110.30,76.42,38.29,31.79,22.85,22.34,20.68,14.25.HRMS(ESI)m/z calcd for[C20H24N2O2+H]+325.1916；found,307.1806[M-HO]+,325.1908[M+H]+,347.1726[M+Na]+.
3-羟基-3-异戊基-5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物21)
按照化合物III合成方法，以5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮和异戊醇为原料，得到棕色固体，yield:71.3％,mp.223.7-225.5℃,HPLC:94.9％.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.02(s,1H),7.77(s,1H),7.00(s,1H,Ar-H),6.99–6.95(m,2H,Ar-H),6.87(dd,J＝7.7,5.3Hz,3H,Ar-H),6.69(d,J＝8.2Hz,1H,Ar-H),5.79(s,1H),2.20(s,3H),1.80–1.64(m,2H),1.41(dt,J＝13.2,6.6Hz,1H),1.03–0.82(m,2H),0.84–0.75(m,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:179.62,142.67,138.69,135.21,133.49,129.99,127.84,118.43,116.21,115.18,110.32,76.42,36.26,32.22,28.10,22.92,22.86,20.68.HRMS(ESI)m/z calcdfor[C20H24N2O2+H]+325.1916；found,307.1806[M-HO]+,325.1909[M+H]+,347.1727[M+Na]+.
3-羟基-3-正己基-5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物22)
按照化合物III合成方法，以5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮和正己醇为原料，得到棕色固体，yield:70.9％,mp.195.8-198.4℃,HPLC:95.1％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:10.02(s,1H),7.76(s,1H),6.99(dd,J＝8.5,5.3Hz,3H),6.93–6.81(m,3H),6.69(d,J＝8.2Hz,1H),5.78(s,1H),2.20(s,3H),1.78–1.65(m,2H),1.16(s,9H),0.82(t,J＝6.8Hz,3H).D2O交换1H NMR(500MHz,DMSO)δ6.98(d,J＝8.8Hz,3H),6.89–6.82(m,3H),6.72(d,J＝8.2Hz,1H),2.18(s,3H),1.71(t,J＝8.2Hz,2H),1.19–1.09(m,6H),1.04–0.87(m,2H),0.78(t,J＝6.3Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ:179.67,142.66,138.74,135.19,133.54,129.99,127.86,118.38,116.29,115.15,110.31,76.43,38.34,31.52,29.21,23.15,22.37,20.68,14.34.HRMS(ESI)m/z calcd for[C21H26N2O2+H]+339.2073；found,321.1964[M-HO]+,339.2067[M+H]+,361.1883[M+Na]+.
3-羟基-3-苯甲基-5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物23)
按照化合物III合成方法，以5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮和苯甲醇为原料，得到白色固体，yield:79.6％,mp.212.4-214.5℃,HPLC:97.8％.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.91(s,1H),7.70(s,1H),7.20–7.08(m,3H,Ar-H),6.99(d,J＝8.5Hz,4H,Ar-H),6.86(d,J＝2.1Hz,1H,Ar-H),6.82–6.70(m,3H,Ar-H),6.52(d,J＝8.2Hz,1H,Ar-H),6.08(s,1H),3.12(d,J＝12.8Hz,1H),2.96(d,J＝12.8Hz,1H),2.21(s,3H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:179.16,142.78,138.34,135.76,135.26,132.29,130.64,129.96,128.02,127.66,126.78,119.28,116.11,115.91,110.27,77.29,44.04,20.70.HRMS(ESI)m/z calcd for[C22H20N2O2+H]+345.1603；found,345.1595[M+H]+,367.1412[M+Na]+.
3-羟基-3-(3，4-亚甲基二氧苯基)甲烯基-5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮((化合物24)
按照化合物III合成方法，以5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮和胡椒醇为原料，得到白色固体，yield:80.1％,mp.199.7-200.2℃,HPLC:98.4％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:9.94(s,1H),7.71(s,1H),6.99(d,J＝8.2Hz,2H,Ar-H),6.84(d,J＝2.2Hz,1H,Ar-H),6.81–6.75(m,3H,Ar-H),6.71(dd,J＝9.6,5.5Hz,1H,Ar-H),6.56(t,J＝4.8Hz,2H,Ar-H),6.44(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H,Ar-H),6.05(s,1H),5.98–5.89(m,2H),2.95(dd,J＝92.8,13.0Hz,2H),2.21(s,3H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:179.23,146.89,146.13,142.71,138.40,135.22,132.28,129.94,129.47,127.72,123.81,119.20,116.23,115.77,110.81,110.33,108.00,101.07,77.25,43.49,20.71.HRMS(ESI)m/z calcd for[C23H20N2O4+H]+389.1501；found,389.1494[M+H]+.
3-羟基-3-正丁基-5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物25)
按照化合物III合成方法，以5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮和正丁醇为原料，得到棕色固体，yield:78.4％,mp.175.1-177.3℃,HPLC:95.1％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.05(s,1H),7.87(s,1H),7.03(t,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),6.97(s,1H,Ar-H),6.96–6.88(m,3H,Ar-H),6.71(d,J＝8.2Hz,1H,Ar-H),5.81(s,1H),1.78–1.69(m,2H),1.20(dd,J＝14.6,7.3Hz,2H),0.99(ddd,J＝20.3,13.5,6.0Hz,2H),0.79(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:179.68,157.06,155.19,141.80,138.49,135.60,133.69,118.65,117.26,117.20,116.15,115.97,115.48,110.37,76.41.HRMS(ESI)m/z calcd for[C18H19FN2O2+H]+315.1509；found,297.1399[M-HO]+,315.1503[M+H]+,337.1323[M+Na]+.
3-羟基-3-正戊基-5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物26)
按照化合物III合成方法，以5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮和正戊醇为原料，得到褐色固体，yield:74.2％,mp.213.6-215.3℃,HPLC:96.2％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.08(s,1H),7.88(s,1H),7.67–7.62(m,4H),7.55(d,J＝1.7Hz,2H),7.00–6.96(m,1H),6.72(d,J＝8.2Hz,1H),5.83(s,1H),1.73(t,J＝8.1Hz,2H),1.25–1.11(m,5H),1.01(ddd,J＝20.8,13.5,6.4Hz,2H),0.83–0.70(m,3H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ179.70,138.50,135.63,133.70,132.51,132.48,118.71,110.39,76.44,38.29,31.79,22.86,22.35,14.25.HRMS(ESI)m/z calcd for[C19H21FN2O2+H]+329.1665；found,329.1654[M+H]+.
3-羟基-3-异戊基-5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物27)
按照化合物III合成方法，以5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮和异戊醇为原料，得到棕色固体，yield:72.5％,mp.175.2-177.0℃,HPLC:94.6％.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.06(s,1H),7.88(s,1H),7.06–7.00(m,2H,Ar-H),6.98(d,J＝2.1Hz,1H,Ar-H),6.96–6.89(m,3H,Ar-H),6.73–6.70(m,1H,Ar-H),5.82(s,1H),1.74(p,J＝6.0Hz,2H),1.41(tt,J＝14.8,7.4Hz,1H),0.98–0.83(m,2H),0.79(dd,J＝6.6,2.0Hz,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:179.64,138.47,135.64,133.64,118.75,117.22,117.15,116.16,115.94,115.52,110.39,76.43,36.25,32.21,28.10,22.89,22.86.HRMS(ESI)m/z calcd for[C19H21FN2O2+H]+329.1665；found,311.1552[M-HO]+,329.1654[M+H]+,351.1474[M+Na]+.
3-羟基-3-正己基-5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物28)
按照化合物III合成方法，以5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮和正己醇为原料，得到褐色固体，yield:69.0％,mp.156.8-158.8℃,HPLC:95.1％.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.89(s,1H),8.70(s,1H),7.88–7.72(m,6H,Ar-H),7.54(d,J＝8.1Hz,1H,Ar-H),6.64(s,1H),2.13–1.73(m,10H),1.62(d,J＝6.6Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:179.37,157.29,154.96,141.82,138.49,135.61,133.68,118.70,117.26,117.19,116.15,115.93,115.47,110.38,76.44,38.32,31.52,29.22,23.16,22.39,14.33.HRMS(ESI)m/z calcdfor[C20H23FN2O2+H]+343.1822；found,325.1711[M-HO]+,343.1814[M+H]+,365.1633[M+Na]+.
3-羟基-3-苯甲基-5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物29)
按照化合物III合成方法，以5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮和苯甲醇为原料，得到褐色固体，yield:81.3％,mp.175.6-176.6℃,HPLC:97.9％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:9.93(s,1H),7.79(s,1H),7.18–7.13(m,3H),7.04–6.97(m,4H),6.85–6.80(m,3H),6.78(dd,J＝8.2,2.3Hz,1H),6.55(d,J＝8.1Hz,1H),6.08(s,1H),3.13(d,J＝12.8Hz,1H),2.95(d,J＝12.8Hz,1H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:179.21,156.97,155.11,141.92,138.04,135.77,135.67,132.37,130.66,128.03,126.80,119.66,117.05,116.99,116.20,116.08,115.91,110.36,79.65,77.24,43.98.加入D2O后1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:7.28–7.07(m,3H),7.06–6.91(m,4H),6.88–6.72(m,4H),6.56(d,J＝8.2Hz,1H),3.12(d,J＝12.8Hz,1H),2.95(d,J＝12.8Hz,1H).HRMS(ESI)m/z calcd for[C21H17FN2O2+H]+349.1352；found,331.1243[M-HO]+,349.1347[M+H]+,371.1165[M+Na]+.
3-羟基-3-(3，4-亚甲基二氧苯基)甲烯基-5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物30)
按照化合物III合成方法，以5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮和胡椒醇为原料，得到白色固体，yield:82.9％,mp.204.8-209.1℃,HPLC:98.4％.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.98(s,1H),7.82(s,1H),7.01(t,J＝8.8Hz,2H,Ar-H),6.89–6.77(m,4H,Ar-H),6.71(d,J＝7.9Hz,1H,Ar-H),6.62–6.53(m,2H,Ar-H),6.44(d,J＝7.9Hz,1H,Ar-H),6.08(s,1H),5.91(d,J＝4.8Hz,2H),3.06(d,J＝13.0Hz,1H),2.87(d,J＝13.0Hz,1H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:179.26,146.88,146.11,138.09,135.68,132.52,132.49,132.38,132.00,131.91,129.46,129.28,129.17,123.82,119.66,117.13,117.06,116.18,116.08,115.86,110.85,110.42,108.01,101.07,77.24,43.44.HRMS(ESI)m/z calcd for[C22H17FN2O4+H]+393.1251；found,375.1141[M-HO]+,393.1246[M+H]+,415.7747[M+Na]+.
3-羟基-3-正丁基-5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物31)
按照化合物III合成方法，以5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮和正丁醇为原料，得到棕色固体，yield:77.6％,mp.180.3-182.0℃,HPLC:97.1％.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.11(s,1H),8.08(s,1H),7.19(d,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),7.01(s,1H,Ar-H),6.96(dd,J＝8.2,1.8Hz,1H,Ar-H),6.91(d,J＝8.8Hz,2H,Ar-H),6.74(d,J＝8.2Hz,1H,Ar-H),5.84(s,1H),1.78–1.70(m,2H),1.19(dt,J＝14.3,7.2Hz,2H),1.08–0.90(m,2H),0.79(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:179.70,144.56,137.28,136.35,133.71,129.35,121.79,120.03,116.57,110.40,76.38,38.06,25.48,22.77,14.32.HRMS(ESI)m/z calcdfor[C18H19ClN2O2+H]+331.1213；found,313.1102[M-HO]+,331.1206[M+H]+,353.1025[M+Na]+.
3-羟基-3-正戊基-5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物32)
按照化合物III合成方法，以5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮和正戊醇为原料，得到褐色固体，yield:75.1％,mp.202.6-203.9℃,HPLC:96.3％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.09(s,1H),8.06(s,1H),7.17(d,J＝8.8Hz,2H,Ar-H),7.01(d,J＝2.1Hz,1H,Ar-H),6.98–6.88(d,J＝8.8Hz,2H,Ar-H),6.74(d,J＝8.2Hz,1H,Ar-H),5.82(s,1H),1.77–1.70(m,2H),1.23–1.12(m,4H),1.11–0.93(m,2H),0.79(t,J＝6.9Hz,3H).D2O交换1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:7.17(d,J＝8.8Hz,2H,Ar-H),7.01(d,J＝2.0Hz,1H,Ar-H),6.94(dd,J＝8.2,2.1Hz,1H,Ar-H),6.90(d,J＝8.8Hz,2H,Ar-H),6.76(d,J＝8.2Hz,1H,Ar-H),1.73(dd,J＝15.8,7.4Hz,2H),1.18–1.11(m,4H),1.06–0.88(m,2H),0.75(t,J＝6.8Hz,3H).13CNMR(126MHz,DMSO-d6)δ:179.71,144.60,137.29,136.38,133.71,129.33,121.80,120.11,116.62,116.56,110.41,76.41,38.23,31.78,22.85,22.33,14.25.HRMS(ESI)m/z calcdfor[C19H21ClN2O2+H]+345.1369；found,327.1260[M-HO]+,345.1364[M+H]+,367.1183[M+Na]+.
3-羟基-3-异戊基-5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物33)
按照化合物III合成方法，以5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮和异戊醇为原料，得到白色固体，yield:76.4％,mp.182.0-184.1℃,HPLC:97.4％.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.11(s,1H),8.10(d,1H),7.19(dd,J＝9.5,2.5Hz,2H,Ar-H),7.01(d,J＝2.1Hz,1H,Ar-H),6.95(dt,J＝6.2,3.1Hz,1H,Ar-H),6.93–6.88(m,2H,Ar-H),6.74(d,J＝8.2Hz,1H,Ar-H),5.85(s,1H),1.79–1.68(m,2H),1.48–1.36(m,1H),1.01–0.82(m,2H),0.78(dd,J＝6.6,2.0Hz,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:179.66,144.59,137.25,136.37,133.65,129.33,121.77,120.11,116.60,116.52,110.42,76.39,36.20,32.20,28.09,22.90,22.86.HRMS(ESI)m/z calcd for[C19H21ClN2O2+H]+345.1369；found,327.1260[M-HO]+,345.1363[M+H]+,367.1182[M+Na]+.
3-羟基-3-正己基-5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物34)
按照化合物III合成方法，以5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮和正己醇为原料，得到白色固体，yield:80.2％,mp.191.2-191.6℃,HPLC:98.1％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.09(s,1H),8.07(s,1H),7.19(d,J＝8.8Hz,2H,Ar-H),7.01(d,J＝1.7Hz,1H,Ar-H),6.98–6.83(m,3H,Ar-H),6.74(d,J＝8.2Hz,1H,Ar-H),5.82(s,1H),1.84–1.66(m,2H),1.18(dd,J＝12.3,5.2Hz,6H),1.10–0.91(m,2H),0.81(t,J＝6.9Hz,3H).D20交换1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:7.16(d,J＝8.8Hz,2H),7.00(d,J＝2.0Hz,1H),6.96–6.92(m,1H),6.90(d,J＝8.8Hz,2H),6.76(d,J＝8.2Hz,1H),1.72(p,J＝7.1Hz,2H),1.14(dd,J＝14.2,7.9Hz,6H),1.04–0.86(m,2H),0.77(t,J＝6.8Hz,3H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:179.71,144.61,137.28,136.38,133.71,131.99,129.33,121.80,120.11,116.57,110.41,76.40,38.28,31.51,29.20,23.15,22.38,14.33.HRMS(ESI)m/z calcd for[C20H23ClN2O2+H]+359.1526；found,359.1519[M+H]+,381.1338[M+Na]+.
3-羟基-3-苯甲基-5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物35)
按照化合物III合成方法，以5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮和苯甲醇为原料，得到白色固体，yield:79.5％,mp.218.2-221.0℃,HPLC:98.2％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:9.98(s,1H),8.00(s,1H),7.20–7.12(m,5H,Ar-H),6.99(dd,J＝6.5,2.6Hz,2H,Ar-H),6.87(d,J＝1.9Hz,1H,Ar-H),6.85–6.78(m,3H,Ar-H),6.57(d,J＝8.1Hz,1H,Ar-H),6.11(s,1H),3.15(d,J＝12.8Hz,1H),2.96(d,J＝12.8Hz,1H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:179.25,144.69,136.89,136.41,135.71,132.41,130.65,129.29,128.05,126.82,121.68,120.93,117.40,116.45,110.40,77.25,43.95.HRMS(ESI)m/z calcd for[C21H17ClN2O2+H]+365.1057；found,347.0953[M-HO]+,365.1056[M+H]+,387.0875[M+Na]+.
3-羟基-3-(3，4-亚甲基二氧苯基)甲烯基-5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物36)
按照化合物III合成方法，以5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮和胡椒醇为原料，得到白色固体，yield:83.5％,mp.198.4-199.8℃,HPLC:98.8％.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.02(s,1H),8.01(s,1H),7.17(t,J＝6.0Hz,2H),6.87(t,J＝4.6Hz,1H),6.86–6.78(m,3H),6.71(d,J＝7.9Hz,1H),6.60(d,J＝8.1Hz,1H),6.56(d,J＝1.4Hz,1H),6.44(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),6.09(s,1H),5.91(dd,J＝9.3,4.8Hz,2H),3.07(d,J＝13.0Hz,1H),2.87(d,J＝13.0Hz,1H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:179.28,146.89,146.12,144.69,136.90,136.43,132.42,129.44,129.28,123.80,121.67,120.94,117.39,116.49,110.83,110.44,108.02,101.08,77.22,43.38.HRMS(ESI)m/z calcd for[C22H17ClN2O4+H]+409.0955；found,391.0849[M-HO]+,409.0952[M+H]+,431.0765[M+Na]+.
3-羟基-3-正丁基-5-(4-三氟甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物37)
按照化合物III合成方法，以5-(4-三氟甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮和正丁醇为原料，得到褐色固体，yield:78.3％,mp.213.0-215.7℃,HPLC:94.7％.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.17(s,1H),8.49(s,1H),7.47(d,J＝8.6Hz,2H,Ar-H),7.08(d,J＝2.1Hz,1H,Ar-H),7.04(dd,J＝8.2,2.2Hz,1H,Ar-H),6.97(d,J＝8.6Hz,2H,Ar-H),6.79(d,J＝8.1Hz,1H,Ar-H),5.87(s,1H),1.80–1.72(m,2H),1.25–1.16(m,2H),1.10–0.90(m,2H),0.79(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:149.35,137.48,135.84,133.79,126.99,126.95,124.18,121.90,118.09,117.71,113.79,110.48,76.36,38.00,25.48,22.76,14.31.HRMS(ESI)m/z calcd for[C19H19F3N2O2+H]+365.1477；found,347.1369[M-HO]+,365.1481[M+H]+,387.1294[M+Na]+.
3-羟基-3-正戊基-5-(4-三氟甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物38)
按照化合物III合成方法，以5-(4-三氟甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮和正戊醇为原料，得到白色固体，yield:79.9％,mp.198.4-200.5℃,HPLC:96.8％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.18(s,1H),8.49(s,1H),7.46(d,J＝8.6Hz,2H,Ar-H),7.08(d,J＝2.0Hz,1H,Ar-H),7.04(dd,J＝8.2,2.2Hz,1H,Ar-H),6.97(d,J＝8.6Hz,2H,Ar-H),6.79(d,J＝8.1Hz,1H,Ar-H),5.87(s,1H),1.79–1.69(m,2H),1.18(tq,J＝15.4,7.7Hz,4H),1.10–0.93(m,2H),0.79(t,J＝6.9Hz,3H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:179.75,149.38,137.50,135.83,133.79,126.97,126.95,121.97,118.11,113.79,110.49,76.38,38.17,31.76,22.85,22.33,14.25.HRMS(ESI)m/z calcd for[C20H21F3N2O2+H]+379.1633；found,361.1525[M-HO]+,379.1627[M+H]+,401.1445[M+Na]+.
3-羟基-3-异戊基-5-(4-三氟甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物39)
按照化合物III合成方法，以5-(4-三氟甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮和异戊醇为原料，得到白色固体，yield:79.6％,mp.201.4-203.7℃,HPLC:96.4％.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.17(s,1H),8.50(s,1H),7.46(d,J＝8.6Hz,2H,Ar-H),7.07(t,J＝3.9Hz,1H),7.03(dt,J＝9.1,4.5Hz,1H,Ar-H),6.97(d,J＝8.6Hz,2H,Ar-H),6.78(dd,J＝12.2,8.3Hz,1H,Ar-H),5.88(s,1H),1.83–1.67(m,2H),1.48–1.35(m,1H),1.04–0.82(m,2H),0.82–0.74(m,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:179.71,149.38,137.50,135.83,133.73,126.97,126.93,124.17,121.98,118.11,118.02,113.77,110.50,76.38,36.15,32.20,28.09,22.88,22.84.HRMS(ESI)m/z calcd for[C20H21F3N2O2+H]+379.1633；found,361.1521[M-HO]+,379.1627[M+H]+,401.1444[M+Na]+.
3-羟基-3-正己基-5-(4-三氟甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物40)
按照化合物III合成方法，以5-(4-三氟甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮和正己醇为原料，得到白色固体，yield:81.1％,mp.199.6-201.4℃,HPLC:96.9％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.18(s,1H),8.49(s,1H),7.46(d,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),7.08(d,J＝2.0Hz,1H,Ar-H),7.03(dt,J＝11.9,5.9Hz,1H,Ar-H),6.97(d,J＝8.6Hz,2H,Ar-H),6.79(d,J＝8.1Hz,1H,Ar-H),5.87(s,1H),1.80–1.69(m,2H),1.22–1.13(m,6H),1.09–0.94(m,2H),0.80(t,J＝6.9Hz,3H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:179.77,149.38,137.49,135.83,133.77,126.95,126.92,121.97,118.12,113.78,110.49,76.38,38.21,31.51,29.20,23.15,22.38,14.31.HRMS(ESI)m/z calcd for[C21H23F3N2O2+H]+393.1789；found,375.1653[M-HO]+,393.1757[M+H]+,415.1575[M+Na]+.
3-羟基-3-苯甲基-5-(4-三氟甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物41)
按照化合物III合成方法，以5-(4-三氟甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮和苯甲醇为原料，得到灰色固体，yield:84.4％,mp.202.5-204.6℃,HPLC:98.6％.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.05(s,1H),8.43(s,1H),7.46(d,J＝8.6Hz,2H,Ar-H),7.24–7.08(m,3H,Ar-H),7.04–6.97(m,2H,Ar-H),6.96(d,J＝2.1Hz,1H,Ar-H),6.90(dt,J＝8.9,4.4Hz,2H,Ar-H),6.87(s,1H),6.62(t,J＝6.4Hz,1H,Ar-H),6.16(s,1H),3.17(d,J＝12.8Hz,1H),2.99(d,J＝12.7Hz,1H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:179.26,149.50,137.56,135.66,135.44,132.52,130.64,128.06,126.95,126.91,126.82,122.69,119.05,113.70,110.44,77.25,43.87.HRMS(ESI)m/z calcd for[C22H17F3N2O2+H]+399.1320；found,381.1210[M-HO]+,399.1314[M+H]+,421.1131[M+Na]+.
3-羟基-3-(3，4-亚甲基二氧苯基)甲烯基-5-(4-三氟甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮(化合物42)
按照化合物III合成方法，以5-(4-三氟甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮和胡椒醇为原料，得到绿色固体，yield:79.4％,mp.198.2-200.1℃,HPLC:96.9％.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.10(s,1H),8.44(s,1H),7.46(d,J＝8.6Hz,2H,Ar-H),6.96(d,J＝2.0Hz,1H,Ar-H),6.93–6.90(m,1H,Ar-H),6.88(d,J＝8.6Hz,2H,Ar-H),6.72(d,J＝7.9Hz,1H,Ar-H),6.65(d,J＝8.1Hz,1H,Ar-H),6.59(d,J＝1.4Hz,1H,Ar-H),6.46(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H,Ar-H),6.14(s,1H),5.90(dd,J＝8.0,0.7Hz,2H),3.16–2.84(m,2H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ:179.35,149.48,146.92,146.13,137.56,135.47,132.51,129.41,126.92,126.89,123.82,122.69,119.00,113.74,110.84,110.51,108.04,101.07,77.21,43.32.HRMS(ESI)m/z calcd for[C23H17F3N2O4+H]+443.1219；found,425.1106[M+H]+,443.1210[M+Na]+.
活性筛选实验
为了验证所设计合成化合物的抗肺癌活性，本课题设计了两大部分的活性测试。首先使用MTT法对所有化合物进行肺癌A549和NCI-H460细胞增殖抑制活性筛选。同时，为了进一步确证化合物的靶向性，本课题设计了信号通路机制的研究，主要是基于WesternBlot实验观察细胞信号通路水平的变化。
肺癌细胞增殖抑制实验
MTT法的原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的溴化四氮唑蓝(MTT)还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长下检测吸光值，可反映活细胞数量。
细胞实验选用A549细胞和NCI-H460细胞系，两者均是RAS突变引起的大量增殖，是常用的肺癌细胞系。选用的阳性对照药为RAF-MEK-ERK通路阻断剂AZD6244和PI3K-PDK1-AKT通路阻断剂MK2206，同时还用细胞毒类药物顺铂起辅助参考作用。通过上述的MTT法，三次平行实验得到最终的IC50值，并进行初步的抗肺癌构效关系讨论。
【实验材料】
a..细胞株：肺腺癌A549细胞株和NCI-H460细胞株。
b.药品和试剂：四甲基偶氮唑盐(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购于Sigma公司；胰酶、新生牛血清、胎牛血清、RPMI-1640、DMEM和青霉素-链霉素购于Gibco公司；其它试剂未经特殊说明均购于Sigma公司仪器CO2培养箱(Thermo)、酶标仪(Thermo)和荧光倒置显微镜(Olympus)。
【操作步骤】
a.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度5×104个/mL，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度10000/孔。
b.5％CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物，共设置5个浓度梯度，每孔100ul，同时做3个复孔.建议，用于对比组间差异。
c.放入5％CO2，37℃恒温培养箱孵育72小时，放在倒置显微镜下观察。
d.每孔加入10ul MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。
e.4h后终止培养，小心吸去孔内培养液。
f.每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值，并计算抑制率。。
g.同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。
【数据处理】
每个浓度梯度重复三个复孔，采用Sigmaplot 5.1软件，以浓度为横坐标，抑制率为纵坐标拟合曲线，计算化合物的IC50值。酶标仪上于490nm处测定每孔的吸光度OD值，细胞生长抑制率按下式计算：
表1：被测化合物对人肺癌A549和NCI-H460细胞的抑制数据
作用机制研究
蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象，又称Western免疫印迹或Western Blot。采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。Western Blot实验是非常常用、可靠的作用机制研究方法。
本课题选用A549肺癌细胞为受试细胞，阳性对照药为RAF-MEK-ERK通路阻断剂AZD6244和PI3K-PDK1-AKT通路阻断剂MK2206。为了确切的验证本课题的设计，我们检测p-ERK和总ERK水平、p-AKT和总AKT水平，并选择β-actin为内参物。p-ERK水平反应了癌细胞内RAF-MEK-ERK通路的活化状态，p-AKT则反应了PI3K-PDK1-AKT通路的激活水平。根据p-ERK和p-AKT水平，可以直接评价所设计、合成的化合物的双通路抑制能力。
选用两个活性较好的化合物进行Western Blot实验，分析P-ERK表达及磷酸化。以考察目标化合物对MEK通道的作用机制。
【实验材料】
a.细胞株：肺腺癌A549细胞株。抗体：p-ERK抗体购于Abcam.GAPDH抗体购于江苏碧云天生物有限公司。
b.药品和试剂：四甲基偶氮唑盐(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购于Sigma公司；胰酶、新生牛血清、胎牛血清、RPMI-1640、DMEM和青霉素-链霉素购于Gibco公司；其它试剂未经特殊说明均购于Sigma公司仪器CO2培养箱(Thermo)、酶标仪(Thermo)和荧光倒置显微镜(Olympus)。
【样品的配置】
a.SDS-聚丙烯酰胺凝胶:
b.蛋白凝胶上样缓冲液：
c.Tris-甘氨酸电泳缓冲液：
d.电转移缓冲液：
e.10×TBS：
f.TBST：
向1000mL 1×TBS中加入0.5mL Tween-20，溶解后室温储存。
g.封闭液：
100mL TBST中加入5g脱脂奶粉，溶解后4℃储存。
【操作步骤】
a.蛋白样品的制备：收集贴壁细胞，1000r/min离心5min，留细胞沉淀，加入60μL裂解液并反复吹打,超声(200w)3次，3s/次，12000r/min，4℃，离心10min，收上清于新EP管中，即得细胞全蛋白。取少量上清用于蛋白定量，其余上清用5×蛋白凝胶上样缓冲液调成1×浓度，100℃变性10min后，收于-80℃保存；
b.蛋白定量：用BCA法对蛋白样品进行浓度测定，以570nm为探测波长，630nm为参考波长，用酶标仪测量吸光值。根据标准曲线计算样品的蛋白浓度；
c.蛋白电泳及转膜：将所有蛋白样品用1×蛋白凝胶上样缓冲液调至等浓度后，100℃变性3min后上样，每孔40μg。进行不连续SDS-PAGE(5％浓缩胶，10分离胶)。以80V电泳至分离胶界面，以120V电泳至溴酚兰达到距胶前沿1cm处终止电泳。割取凝胶，200mA恒流转膜2h至硝酸纤维素膜上；
d.杂交与显影：印迹膜于室温封闭1h后，进行一抗杂交，和二抗杂交，抗体以1:5000的浓度稀释于封闭液中，室温孵育2h，TBST洗膜后，用ECL发光法发光，X光胶片曝光，显影定影；
e.同一印迹膜可多次重复使用，先用H2O洗10min，再用0.2M NaOH室温摇动洗涤10min，最后H2O再洗10min。重新从封闭开始，进行新一轮的杂交，步骤同前。
Western Blot实验条件
选用活性较好的化合物39(IC50＝136.0μM)进行RAF-MEK-ERK通路和PI3K-PDK1-AKT通路作用机制研究。
实验结果见图1.
图1所示为活性药物对处理A549细胞株的Western Blot实验结果。药物组：化合物39(0,1,10,25,50μM)，AZD-6244(1μM)，MK-2206(1μM)；药物处理时间：4h和8h。当药物处理4h时(图1B)，RAF-MEK-ERK阻断剂AZD6244可以降低p-ERK水平至85％，而PI3K-PDK1-AKT抑制剂MK2206和化合物39对p-ERK水平没有显著性差异，而对于p-AKT水平而言，只有MK2206显著抑制其水平。当给药时间延长至8h时，化合物39对10μM、25μM和50μM对p-ERK的抑制水平分别约20％、39％和53％，呈明显浓度相关性。同样，在p-AKT磷酸化水平中也观察到了化合物39浓度明显相关性。
上述机制研究初步表明，化合物39可以较好抑制A549增殖，IC50＝136.0μM，在8h可以显著性抑制p-ERK水平和p-AKT水平，呈浓度依赖性。因此，本课题所设计的化合物是通过抑制RAF-MEK-ERK通路和PI3K-PDK1-AKT通路而发挥抑制肺癌细胞增殖作用。

Claims (9)

1.一种双取代吲哚-2(1H)-酮类衍生物，结构通式如式III所示：
其中，R1选自H、羟基、氨基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基，C1-C6烷胺基，位置处于氨基的邻、间、对位；
吲哚-2(1H)-酮苯环上芳基氨的取代位置位于4-7位取代；
R2选自C1-C8直链或支链烷基、C3-C6环烷基、含有羟基取代的C1-C8直链或支链烷基，苯基或C6-C10取代芳烃基，其中C6-C10取代芳烃结构中的取代基选自羟基、氨基、卤素、亚甲二氧基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基，C1-C6烷胺基；
及其药学上可用的盐。
2.根据权利要求1所述双取代吲哚-2(1H)-酮类衍生物，其特征是，R1选自H、C1-C6烷氧基；位置处于氨基的邻、间、对位；
吲哚-2(1H)-酮苯环上芳基氨的取代位置位于4-7位取代；
R2选自C1-C5直链或支链烷基。
3.根据权利要求1所述双取代吲哚-2(1H)-酮类衍生物，其特征是，R1选自H、卤素、C1-C6卤代烷基；位置处于氨基的邻、间、对位；
吲哚-2(1H)-酮苯环上芳基氨的取代位置位于4-7位取代；
R2选自C1-C8直链或支链烷基、苯基、亚甲二氧苯基。
4.根据权利要求1所述的双取代吲哚-2(1H)-酮类衍生物，所述药学上可用的盐是盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、高氯酸盐、甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、马来酸盐、丁二酸盐、三氟乙酸盐、琥珀酸盐、水杨酸盐、DL-天冬氨酸盐、D-天冬氨酸盐、L-天冬氨酸盐、DL-谷氨酸盐、D-谷氨酸盐、L-谷氨酸盐、甘油酸盐、硬脂酸盐、DL-酒石酸盐、D-酒石酸盐、L-酒石酸盐、(±)扁桃酸盐、(R)-(-)扁桃酸盐、(S)-(+)扁桃酸盐、柠檬酸盐、粘酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、DL-苹果酸盐、(±)乳酸盐、L-(+)-乳酸盐、D-(+)-乳酸盐、扑酸盐、D-α-半乳糖醛酸盐、甘油酸盐、DL-半胱氨酸盐、D-半胱氨酸盐、L-半胱氨酸盐、(4S)-羟基-L-脯氨酸盐、环丙烷-1,1-二羧酸盐、2,2-甲基丙二酸盐、酪氨酸盐、脯氨酸盐、富马酸盐、1-羟基-2-萘甲酸盐、膦酰基乙酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、3-膦酰基丙酸盐、DL-焦谷氨酸盐、D-焦谷氨酸盐、L-焦谷氨酸盐、对甲苯磺酸盐、苯磺酸盐、乙磺酸盐、(±)樟脑磺酸盐、萘磺酸盐、1R-(-)-樟脑磺酸盐、1S-(+)-樟脑磺酸盐、1,5-萘二磺酸盐、1,2-乙烷二磺酸盐、1,3-丙烷二磺酸盐、3-(N-吗啉代)丙烷磺酸盐、联苯基磺酸盐，羟乙基磺酸盐、1-羟基-2-萘磺酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢钾盐、磷酸二钾盐、磷酸钾盐、磷酸氢钠盐、磷酸二钠盐、磷酸钠盐、磷酸二氢钠盐、磷酸钙盐、三代磷酸钙盐、六氟代磷酸盐、乙烯基磷酸盐、2-羟基乙基磷酸盐和苯基磷酸盐。
5.根据权利要求1所述双取代吲哚-2(1H)-酮类衍生物，其特征是，具体化合物为以下化合物：
3-羟基-3-正戊基-5-(4-甲氧基苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-正己基-5-(4-甲氧基苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-苯甲基-5-(4-甲氧基苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-正丁基-5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-正戊基-5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-异戊基-5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-正己基-5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-苯甲基-5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-(3，4-亚甲基二氧苯基)甲烯基-5-(4-甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-正丁基-5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-正戊基-5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-异戊基-5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-正己基-5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-苯甲基-5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-(3，4-亚甲基二氧苯基)甲烯基-5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-正丁基-5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-正戊基-5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-异戊基-5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-正己基-5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-苯甲基-5-(4-氯苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-(3，4-亚甲基二氧苯基)甲烯基-5-(4-氟苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-正丁基-5-(4-三氟甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-正戊基-5-(4-三氟甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-异戊基-5-(4-三氟甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-正己基-5-(4-三氟甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-苯甲基-5-(4-三氟甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮
3-羟基-3-(3，4-亚甲基二氧苯基)甲烯基-5-(4-三氟甲基苯胺)吲哚-2(1H)-酮。
6.权利要求1-5之一所述双取代吲哚-2(1H)-酮类衍生物的制备方法，具体步骤包括：
(1)化合物IV通过与取代苯胺进行碳负离子反应得到化合物V；
所述化合物IV为：
化合物V为
(2)中间体V在钯碳还原下得到化合物VI
(3)化合物VI与有机醇在催化剂水合三氯化钌的作用下，反应时间5小时以上，得产物结构式III的化合物。
7.权利要求1-5之一所述双取代吲哚-2(1H)-酮类衍生物在制备MEK抑制剂或PDK1抑制剂的应用。
8.权利要求1-5之一所述双取代吲哚-2(1H)-酮类衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征是，所述抗肿瘤药物为抗肺癌药物。
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