CN106265211B - 一种肉苁蓉上清混合物、其制备方法及其皮肤屏障修复作用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从肉苁蓉提取得到肉苁蓉上清混合物的方法，该方法包括以下步骤：水浴条件下，加水煎煮提取；浓缩后用有机溶剂沉淀；取上清液，离心后得到肉苁蓉上清混合物。在本发明的一些实施方式中，提取方法在加入煎煮提取之后还包括超滤的步骤。本发明还涉及所述方法制备得到的肉苁蓉上清混合物以及该肉苁蓉上清混合物在具有皮肤屏障修复作用的化妆品中的应用。

Description

一种肉苁蓉上清混合物、其制备方法及其皮肤屏障修复作用

技术领域

本发明涉及天然药物化学领域和化妆品领域，更具体地说，涉及一种通过水煎煮方式进行提取后采用醇沉取上清液方式得到的肉苁蓉上清混合物。此外，本发明还涉及所述方法提取得到的肉苁蓉上清混合物的皮肤屏障修复作用，具体涉及该肉苁蓉上清混合物在制备具有皮肤屏障修复作用的化妆品中的应用。

背景技术

皮肤屏障功能包括物理性屏障，色素屏障，神经屏障，免疫屏障作用以及其他与皮肤功能相关的诸多方面，而我们在日常生活中所说的皮肤屏障大多指的是其物理性皮肤屏障。从细胞分化和组织形成的角度来看，皮肤的物理性屏障功能不仅依赖于表皮角质层，而且依赖于表皮全层结构；从生化组成和功能作用方面看来，表皮的物理性屏障结构不仅和表皮的脂质有关，也和表皮的各种蛋白质、水、无机盐以及其他代谢产物密切相关。

现代皮肤科学认为，皮肤外观的健康舒适与屏障功能的完善密不可分，这也与传统理论中“固表护卫”的最重要健康观不谋而合。皮肤屏障受损或功能失调，是损美性肌肤问题的重要根因。皮肤屏障功能被破坏，表皮内的水分会经过角质层丢失，使皮肤变得干燥，从而引起或加重一些皮肤疾病。许多皮肤病如老年性皮肤瘙痒症、特应性皮炎、银屑病、痤疮以及干燥性皮肤等与皮肤屏障功能下降有关。

皮肤屏障主要由角化包膜和脂质膜、中间丝聚合蛋白、角蛋白、角化桥粒、板层小体和角质层角质形成细胞间质、紧密连接等一系列物质/结构组成，它能防止水分的丢失及阻止外界的侵害，维持机体内稳态。一部分表皮细胞从基底层开始，经过一系列生长分化过程，最终会迁移至皮肤表面形成完全角质化的细胞套膜，而这些正是表皮角质层屏障结构的物质基础。上述过程涉及的蛋白质主要有两类：即细胞角蛋白(Keratin)和角蛋白中间丝相关蛋白(Keratin intermediate filaments-associated protein，KI-PAP)。这些重要的中间丝相关蛋白，包括，丝聚合蛋白(Filaggrin)，兜甲蛋白(Loricrin)，外皮蛋白(Involucrin)，角质形成细胞转谷酰胺酶(Transglutaminase Keratinocyte，TGK)等等。中间丝相关蛋白是形成皮肤角质层屏障结构的重要物质，这些蛋白质的异常表达都可能引起一系列以皮肤屏障功能损伤为特征的皮肤病症。

皮肤屏障的完整性，同时还与角质形成细胞的活力有关，有利用皮肤细胞的增值更新。

肉苁蓉(Cistanche deserticola Y.C.Ma)为列当科肉苁蓉属多年生寄生性药用植物，现已发现其具有抗衰老、增强人体免疫力、抗疲劳等作用。肉苁蓉生长在极度干旱，炎热的沙漠中，自然条件的长期作用下，使之形成了一套适应环境的体系。如肉苁蓉叶片退化为鳞形，躯体富含水分形成肉质，独特的根部“吸器”。同时，在恶劣环境的刺激下，肉苁蓉能产生某一类次级代谢产物，保护机体生存。

目前关于肉苁蓉的研究大多都集中在水提物醇沉部分的抗衰老和清除自由基的作用。尚未发现将肉苁蓉进行水提醇沉后，对上清液部分的研究。也就是说，现有技术均未公开本发明所述的肉苁蓉上清混合物，该肉苁蓉上清混合物是通过水煎煮方式进行提取后采用醇沉取上清液得到的。意外地发现，该肉苁蓉上清混合物作用于角质细胞后，细胞内两个与皮肤屏障密切相关的蛋白(Involucrin以及Claudin-1)的表达情况得到改善，证实了该提取物的保护皮肤屏障的功效。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有皮肤屏障修复作用的肉苁蓉上清混合物。按照本发明方法制备得到的肉苁蓉上清混合物中糖含量范围为23.37％-62.60％之间，蛋白质含量范围为15.74-35.57％。本发明中，我们主要检测了肉苁蓉上清混合物作用于角质细胞后，细胞内两个与皮肤屏障密切相关的蛋白(Involucrin以及Claudin-1)的表达情况。研究证实这两种蛋白的表达均提高，进一步证明本发明的肉苁蓉上清混合物具有保护皮肤屏障的功效。

一方面，本发明提供了一种从肉苁蓉提取得到肉苁蓉上清混合物的方法，该方法包括以下步骤：

a)水浴条件下，加水煎煮提取；

b)浓缩后用有机溶剂沉淀；

c)取上清液，离心后得到肉苁蓉上清混合物。

在本发明优选的实施方式中，从肉苁蓉提取得到肉苁蓉上清混合物的方法还包括在步骤a)之后进行超滤的工艺。在本发明的一些实施方式中，超滤能够截留分子量在10000以上的分子。

在一些优选的实施方式中，步骤a)在80-100℃的条件下进行。在一些优选的实施方式中，步骤a)中肉苁蓉原料与水的重量比为1:20至1:30。

在一些优选的实施方式中，步骤b)的有机溶剂是具有1-4个碳原子的低级醇。在一些优选的实施方式中，步骤b)的有机溶剂是丙酮。

在本发明的另一方面，提供了通过本发明方法制备得到的肉苁蓉上清混合物。

在一些优选的实施方式中，以重量百分比计，本发明的肉苁蓉上清混合物中糖含量范围为23.37％-62.60％，蛋白质含量范围为15.74-35.57％。

在本发明的另一方面，提供了按照本发明方法制备得到的肉苁蓉上清混合物可应用于皮肤外用剂、保健食品和医药，尤其是可应用于化妆品中，根据制剂的不同类型添加不同的用量。

在本发明的另一方面，提供了一种具有皮肤屏障修复作用的化妆品，所述化妆品包含按照本发明方法制备得到的肉苁蓉上清混合物以及化妆品领域可接受的赋形剂。在本发明一个优选的实施方式中，所述化妆品还包含另一种具有皮肤屏障修复老作用的添加剂。在一个实施方式中，所述化妆品选自：洁面乳、化妆水、乳液、膏霜、啫喱、面膜。在一个优选的实施方式中，所述肉苁蓉上清混合物在皮肤外用剂中的重量百分比为0.0001％-20％(w/w)，优选的重量百分比为0.001％-10％(w/w)，更优选的重量百分比为0.01％-5％(w/w)。

所述皮肤外用剂组合物是通常用于皮肤外部的所有成分的统称概念，例如可以是化妆料组合物或药学组合物。所述化妆料组合物中可以是基础化妆料、面部妆容化妆料、身体用化妆料、头发护理用化妆料等，对其剂型无特殊限制，根据不同目的可合理选择。

所述化妆料组合物中根据剂型和目的的不同还含有不同的化妆品学层面允许的介质或基质赋形剂。

可以用于本发明皮肤外用剂组合物的化妆品、皮肤病学或药学上可接受的赋形剂为水相、油相、凝胶、水包蜡型乳液、水包油型乳液或油包水型乳液的形式。水相为一种或多种水溶性或分散性组分的混合物，其在室温(25℃)下可以为液体、半固体或固体。赋形剂包括或可以为在水或水-醇赋形剂中的混悬液、分散液或溶液的形式，其可以含有增稠剂或凝胶剂。本领域技术人员可以基于本领域技术人员掌握的知识选择合适的产品形式，其中包含的组分。

所述的组合物可以包括水相，该水相可以含有水或水与至少一种亲水性有机溶剂的混合物，所述的亲水性有机溶剂诸如醇，尤其是含有2-5个碳原子的直链或支链低级一元醇，如乙醇或丙醇；多元醇，如丙二醇、山梨醇、甘油、泛醇或聚乙二醇及其混合物。

当发明的组合物为乳液形式时，该组合物还可以任选包含表面活性剂。

所述的组合物还可以包含成膜聚合物，如聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸均聚物或共聚物、聚酯、基于烃的树脂和/或硅氧烷树脂。可以将聚合物溶于或分散于化妆品可接受的赋形剂中并且任选与增塑剂合并。

本发明的组合物还可以包含油相，所述的油相含有在室温(25℃)下为液体的油溶性或油分散性组分和/或在室温下为油状或蜡状的物质，如蜡、半固体、树胶及其混合物。该油相还可以含有有机溶剂。

通常在室温下为液体，合适的油性物质包括：来源于动物的基于烃的油，如全氢化角鲨烯；基于烃的植物油，如液体的C4-10脂肪酸的甘油三酯类，例如庚酸或辛酸甘油三酯类，或油，例如向日葵油、玉米油、大豆油、葡萄籽油、蓖麻油、鳄梨油、辛酸/癸酸甘油三酯类、霍霍巴油；矿物或合成来源的直链或支链烃类，例如液体石蜡及其衍生物、凡士林；合成酯类和醚类，特别是脂肪醇的酯类，例如肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸2-乙基己酯、硬脂酸2-辛基十二烷基酯、异硬脂酸异硬脂醇酯；羟基化酯类，例如乳酸异硬脂醇酯、羟基硬脂酸辛酯、羟基硬脂酸辛酯、羟基硬脂酸辛基十二烷基酯、脂肪醇的庚酸酯类、辛酸酯类和癸酸脂类；多元醇酯类，例如丙二醇二辛酸酯、新戊二醇二庚酸酯、二甘醇二异壬酸酯和季戊四醇酯类；含有C12-26的脂肪醇类，例如辛基十二烷醇、2-丁基辛醇、2-己基癸醇、2-十一烷基十五烷醇、油醇；基于部分烃的氟油和/或氟硅油，硅油，在室温下为液体或半固体的挥发性或非挥发性的直链或环状聚甲基硅氧烷，例如环状聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷，其任选包含苯基，例如苯基三甲基硅氧烷、硅氧烷及其混合物。

本发明的组合物可以进一步包含常用于化妆品领域中的任何组分。这些组分包括防腐剂、水相增稠剂(提取物生物聚合物、合成聚合物)和脂肪相增稠剂、芳香剂、亲水性和亲脂性活性剂及其混合物。

本发明的组合物还可以包含另外的颗粒相，所述的颗粒相可以为化妆品组合物中使用的颜料和/或珠光剂和/或填充剂。

颜料可以存在于组合物中，合适的无机颜料包括氧化钛、氧化锆和氧化铈以及氧化锌、氧化铁和铁蓝；合适的有机颜料包括钡、锶、钙和铝色淀和碳黑。

珠光剂可以存在于组合物中，合适的珠光剂包括涂覆了氧化钛、氧化铁或天然颜料的云母。

填充剂可以存在于组合物中，合适的填充剂包括滑石粉、二氧化硅、硬脂酸锌、云母、高岭土、尼龙粉末、聚乙烯粉末、特氟龙、淀粉、一氮化硼、共聚物微球，例如硅氧烷树脂微珠。

本发明组合物的油相可以包含一种或多种蜡、树胶或其混合物。蜡包括基于烃的蜡、氟蜡和/或硅氧烷蜡，并且可以来源于植物、矿物、动物和/或合成来源。合适的蜡包括蜂蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、石蜡、微晶蜡、地蜡；合成蜡包括聚乙烯蜡、含有C16-45的硅氧烷蜡。树胶一般为聚二甲基硅氧烷或羧甲基纤维素钠或提取物类，并且半固体物质一般为基于烃的化合物，如羊毛脂及其衍生物。

可以将本发明的组合物配制成任何合适的产品形式。这类产品形式包括，但不限于气溶胶型喷雾剂、霜剂、乳液、固体、液体、分散体、泡沫、凝胶、化妆水、摩丝、软膏、粉剂、贴剂、润发油、溶液、手按泵型喷雾剂、棒状物、面膜和湿纸巾。可以将本发明的组合物通过本领域众所周知的各种方法便利地用于制备或作为化妆品、皮肤病学或药物局部施用产品。

本发明的皮肤外用剂组合物可以包括一种或多种下列成分：抗过敏剂、抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、着色剂去色素剂、润肤剂、乳化剂、表皮脱落剂、成膜剂、香料、保湿剂、昆虫驱避剂、润滑剂、药物活性剂、增湿剂、耐光剂、防腐剂、护肤剂、皮肤渗透增强剂、防晒剂、稳定剂、表面活性剂、增稠剂、粘度调节剂、维生素或其任意组合。

附图说明

图1是本发明肉苁蓉上清混合物的提取工艺流程图。

图2显示了本发明肉苁蓉上清混合物对表皮细胞活力影响的结果。

图3显示了本发明肉苁蓉上清混合物对皮肤屏障修复相关蛋白表达的影响结果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。但是，应该明白，这些实施例仅用于说明本发明而不构成对本发明范围的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按重量计。

本发明实施例中使用的仪器设备如下：

SHB-III循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸易有限公司。

85-2型恒温磁力搅拌器：上海思乐仪器有限公司。

DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司。

N-1100D-WD真空旋转蒸发仪：日本EYELA公司。

UV260可见分光光度计：日本Shimadzu。

GL-21M低温高速离心机：上海离心机研究所有限公司。

Labconco大型冷冻干燥机：美国Labconco公司。

Edwards小型冷冻干燥机：英国Edwards公司。

全波长双板多功能仪(酶标仪)：美国BMG Labtech公司Novostar

细胞培养箱：美国Thermo serial II

以下实施例1-6描述了本发明涉及的肉苁蓉上清混合物的制备方法并对制备工艺进行考察。所述肉苁蓉产自甘肃或新疆。

实施例1

取肉苁蓉鳞茎500g，水浴温度80℃提取，肉苁蓉药材与每次加水量的比例为1:20,提取物浓缩至3-5L，超滤，收集分子量约10000以上的截留液，浓缩后，加入有机溶剂(甲醇、乙醇等低级醇，丙酮)搅拌进行沉淀，静置，沉淀离心，4℃过夜，离心取上清液。

实施例2

取肉苁蓉鳞茎500g，水浴温度80℃提取，肉苁蓉药材与每次加水量的比例为1:30，提取物浓缩至3-5L，超滤，收集分子量约10000以上的截留液，浓缩后，加入有机溶剂(甲醇，乙醇等低级醇，丙酮)搅拌进行沉淀，静置，沉淀离心，4℃过夜，离心取上清液。

实施例3

取肉苁蓉鳞茎500g，水浴温度80℃提取，肉苁蓉药材与每次加水量的比例为1:50，提取物浓缩至3-5L，超滤，收集分子量约10000以上的截留液，浓缩后，加入有机溶剂(甲醇，乙醇等低级醇，丙酮)搅拌进行沉淀，静置，沉淀离心，4℃过夜，离心取上清液。

实施例4

取肉苁蓉鳞茎500g，水浴温度100℃提取，肉苁蓉药材与每次加水量的比例为1:20，提取物浓缩至3-5L，超滤，收集分子量约10000以上的截留液，浓缩后，加入有机溶剂(甲醇，乙醇等低级醇，丙酮)搅拌进行沉淀，静置，沉淀离心，4℃过夜，离心取上清液。

实施例5

取肉苁蓉鳞茎500g，水浴温度100℃提取，肉苁蓉药材与每次加水量的比例为1:30，提取物浓缩至3-5L，超滤，收集分子量约10000以上的截留液，浓缩后，加入有机溶剂(甲醇，乙醇等低级醇，丙酮)搅拌进行沉淀，静置，沉淀离心，4℃过夜，离心取上清液。

实施例6

取肉苁蓉鳞茎500g，水浴温度100℃提取，肉苁蓉药材与每次加水量的比例为1:50，提取物浓缩至3-5L，超滤，收集分子量约10000以上的截留液，浓缩后，加入有机溶剂(甲醇，乙醇等低级醇，丙酮)搅拌进行沉淀，静置，沉淀离心，4℃过夜，离心取上清液。

实施例7：糖含量测定

采用苯酚-硫酸法对实施例1-6制备得到的肉苁蓉上清混合物进行糖含量测定。

苯酚-硫酸法是目前应用最广泛的测定糖含量的方法，其原理是在强酸条件下将待测的糖样品水解成单糖，单糖在浓硫酸中脱水生成糠醛，进而与苯酚形成黄色复合物，利用比色法可进行测定，该方法特别适用于寡糖，多糖或糖复合物中糖含量的测定。

试剂：苯酚(分析纯)，重蒸后配成50g/L(5％，w/v)水溶液；浓硫酸(分析纯，d＝1.84g/cm³)；标准溶液(150μg/mL)：取已经干燥的葡萄糖7.5mg，溶于水中，定溶至50mL。待测样液配制成固含1％的溶液，并稀释50倍。

测定时取上取浓度分别为0,30,60,90,120,150μg/ml的标准液0.2mL，加5％苯酚0.4mL，振荡后加浓硫酸2.0mL，振荡，在室温放置30min，以空白管(0#)为对照测定OD₄₉₀。

取0.2mL样品，按标准液同样方法测定OD₄₉₀。

结果如下表所示：

表1

实施例8：蛋白质含量测定(凯氏定氮法)

对实施例1-6制备得到的肉苁蓉上清混合物进行蛋白质含量的测定。样品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸钱。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量即刻得到氮的含量，再乘以相应的换算系数，即为蛋白质的含量。

结果如下表所示：

表2

通过表1-2中糖含量及蛋白质含量的比较和分析，同时考虑到工业生产的可操作性以及成本经济性，我们选择提取温度为100℃，物料比为1:20，这一提取物做为研究对象，并对其皮肤屏障修复作用进行检测。

因此，在下面的实施例中取实施例4制备得到的肉苁蓉上清混合物，制得1g/ml生药浓度的样品，其固体含量为11.38％。

做功效评价时，对样品进行配制，其母液浓度为1％，即10mg/ml。

实施例9：肉苁蓉上清混合物的皮肤屏障作用

(1)肉苁蓉上清混合物对表皮细胞活力的作用

在96孔板每孔加入50μl含0.2％生长因子的细胞培养液，再用排枪加入150μl成纤维细胞悬液。细胞接种量为8500个/孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。吸出150μl培养基，再加入含有肉苁蓉上清混合物的培养基150μl/孔，使其终浓度为0.1mg/ml，0.3mg/ml，加入含有肉苁蓉沉淀部分的培养基150μl/孔，使其终浓度为0.02mg/ml，0.1mg/ml。继续培养48h后重新按之前所述方法更换一次培养基，24h后吸出培养基，用PBS清洗后，加入125μl0.2mg/ml的XTT反应液(含0.1％PMS，Sigma)，再培养2h后在酶标仪上450nm处测定吸光度。

实验结果如图2表明，肉苁蓉上清混合物在浓度为0.1mg/ml和0.3mg/ml的条件下，分别使得表皮细胞活力分别增加了7.06％和13.34％。而肉苁蓉沉淀部分在浓度为0.02mg/ml和0.1mg/ml的条件下，使得表皮细胞活力分别下降了15.71％和19.37％。从该结果可以看出，肉苁蓉沉淀部分对细胞状态有一定的影响，因此在接下来考察对皮肤相关蛋白的影响实验中，我们着重对肉苁蓉上清混合物进行检测。

(2)肉苁蓉上清混合物对跟皮肤屏障相关蛋白表达的影响

在8孔板每孔加入500μl细胞培养液，再分别加入500μl角质细胞悬液。细胞接种量为1.83×104个/孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。吸出培养基，再加入含有肉苁蓉上清混合物的培养基各1ml，使其终浓度为0.1mg/ml。药物浓度已做过细胞毒性检测，对该细胞密度下的角质细胞无毒害作用。37℃5％CO₂培养箱培养72h。用丙酮固定细胞后，用单克隆抗体(一抗)分别处理每孔细胞12h后洗去，再用含有荧光集团的二抗(sigma)染色2h。洗去后，最终用DAPI溶液衬染细胞核，洗去，并封片。

本发明中，我们主要检测了肉苁蓉上清混合物作用于角质细胞后，细胞内两个与皮肤屏障密切相关的蛋白(Involucrin以及Claudin-1)的表达情况，并证实了该提取物的保护皮肤屏障的功效。Involucrin(外皮蛋白)，是在角质细胞再分化过程中角质包膜形成的关键蛋白，而角质包膜是角质层内细胞膜广泛交联后形成的坚韧外膜，是表皮防御屏障功能的基础，保障皮肤不受外界刺激物损伤故而外皮蛋白对皮肤维持正常的屏障功能非常重要；Claudin-1，是一种紧密连接蛋白，是构成细胞间紧密连接的主要蛋白股骨架，在维持紧密连接特有的栅栏功能和屏障功能具有很重要的作用，调控皮肤内水分及无机盐的交换，并阻止其他物质通过，维持皮肤内在的稳态。

实验结果如图3表明，肉苁蓉上清混合物在0.1mg/ml的条件下(XTT实验验证的无毒浓度)能够明显提高角质细胞中与肌肤屏障功能密切相关的外皮蛋白和紧密连接蛋白的表达：Involucrin以及Claudin的含量。

取实施例1-6中制备的肉苁蓉上清混合物，用于皮肤外用剂的制备。所述皮肤外用剂优选为化妆品组合物，例如化妆水、精华液、乳霜等。所述黄精果胶类多糖在皮肤外用剂中的重量百分比为0.0001％-20％(w/w)，优选的重量百分比为0.001％-10％(w/w)，更优选的重量百分比为0.01％-5％(w/w)。

以下是肉苁蓉上清混合物在皮肤外用剂中的具体应用的实施例，及其这些剂型的配方和制备方法。以下各表中“-”表示无添加。

以下实施例10-20中所使用的肉苁蓉上清混合物均为实施例4制备得到的肉苁蓉上清混合物，其生药浓度为1g/ml；实施例3-13中各组分的单位均为重量百分比。

实施例10：面霜的制备

实施例11：乳液的制备

实施例12：啫喱的制备

实施例13：化妆水的制备

实施例14：精华液的制备

实施例15：面膜的制备

实施例16：眼霜的制备

实施例17：气雾(清洁泡)的制备

实施例18：喷雾的制备

实施例19：沐浴露的制备

实施例20：洗面奶的制备

以上实施例10-20中所述的肉苁蓉上清混合物均经过①稳定性测试，将料体分别在-20℃、4℃、室温、48℃、循环(连续变换四个温度条件)放置12周，各料体的颜色和形态都保持稳定；②皮肤安全性测试，证实对皮肤无刺激，不会引发红斑、脱屑、刺痛及灼热等不良反应，可安心使用。

Claims (8)

1.一种肉苁蓉上清混合物在制备用于皮肤屏障修复的产品中的应用，其中，所述肉苁蓉上清混合物通过以下方法制备：

a)水提取后，进行超滤；

b)浓缩后用有机溶剂沉淀；

c)取上清液，离心后得到肉苁蓉上清混合物，

其中，所述肉苁蓉上清混合物中糖含量范围为23.37％-62.60％，蛋白质含量范围为15.74-35.57％，

其中，所述超滤截留分子量在10000以上的分子，所述产品是皮肤外用剂组合物。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤a)在80-100℃的条件下进行。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤a)中肉苁蓉原料与水的重量比为1:20至1:30。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤b)的有机溶剂沉淀采用选自以下的有机溶剂：甲醇、乙醇、丙酮。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括提高角质细胞内的外皮蛋白和紧密连接蛋白的表达。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品是皮肤外用剂组合物，所述肉苁蓉上清混合物在所述皮肤外用剂组合物中的重量百分比为0.0001-20重量％。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肉苁蓉上清混合物在所述皮肤外用剂组合物中的重量百分比为0.001-10重量％。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肉苁蓉上清混合物在所述皮肤外用剂组合物中的重量百分比为0.01-5重量％。

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