CN106232825B - 使用阳离子化合物加工木质纤维素材料的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于从木质纤维素材料获得糖和木质素级分的方法，以及涉及使用从木质纤维素获得的糖生产发酵产物的方法。特别地，本发明涉及通过在水热水解的预处理步骤中引入使用阳离子化合物的脱木质化步骤来改善酶促水解产物中的糖产率的方法。

Description

使用阳离子化合物加工木质纤维素材料的方法
发明领域
本发明涉及从木质纤维素材料获得糖和木质素级分的方法以及涉及使用从木质纤维素获得的糖生产单细胞油的方法。该方法还涉及再循环从木质纤维素材料的脱木质化处理获得的碱液流。
发明背景
木质纤维素是地球上最丰富的生物聚合物。木质纤维素是木本植物和非木本植物(如草)的主要结构组分。木质纤维素生物质是指由纤维素、半纤维素和木质素组成的植物生物质。通过林业、木材以及纸浆和纸张工业，以及农业实践(例如，禾秆、秸秆、甘蔗渣、谷壳、果壳)和许多农用工业，产生了大量木质纤维素残留物。此外，市政废物含有可以认为是木质纤维素残留物的级分，如纸张或纸板废物、花园废物或来自建筑的废木材。木质纤维素残留物，如农业残留物，提供了用于生物燃料生产的高度可持续的、非食物和非-ILUC(间接土地利用变化)的替代品。此外，由于高丰度和低价格，木质纤维素残留物是用于生物燃料生产的优选材料。此外，具有生物质生产力的专用木本或草本能量作物获得了作为生物燃料使用的关注。
通过微生物发酵，从木质纤维素材料生产生物燃料，尤其以乙醇，已经得到了广泛研究。利用木质纤维素用于生物燃料或生物燃料给料的微生物生产的最大挑战在于木质纤维素材料的复杂性及其对生物降解的抗性。在木质纤维素中，纤维素(20-50％植物干重)纤维包埋在半纤维素(20-40％)、果胶(2-20％)和木质素(10-25％)共价结合的基质中，形成对降解抵抗力非常高的结构。
此外，根据生物质，半纤维素的糖残基含有不同的己糖(例如，葡萄糖、甘露糖和半乳糖)和戊糖(例如，***糖和木糖)的混合物。
某些微生物可以从有机分子(如源自木质纤维素的糖)产生脂质。某些微生物，通常是酵母、真菌或细菌，可以有效地将木质纤维素材料中的C6和C5糖转化成油。通过异养微生物产生的油常常被称为单细胞油或微生物油。使用异养微生物的单细胞油生产方法包括在通气的生物反应器中培养微生物，使细胞累积脂质，回收富含脂质的细胞并从细胞回收油。基于微生物的脂质(即，单细胞油)可以用作用于生物燃料(如生物柴油、可再生柴油或生物喷气燃料)生产的原料。
经济上可行的通过微生物发酵从木质纤维素材料生产生物燃料需要木质纤维素材料的所有主要碳水化合物组分有效转化成生物燃料。另一方面，生物燃料生产的经济可行性需要木质纤维素材料的所有主要碳水化合物组分必须转化成糖，其适用于微生物发酵。通常，这表示破坏(水解)半纤维素和纤维素级分的聚合结构来获得单体糖。
现有技术公开了几种方法，其针对从木质纤维素材料生产糖并在微生物发酵过程中使用糖。
专利公开WO2010039783A1描述了一种从木质纤维素材料生产可发酵糖的方法，在该方法中，在进行纤维素级分酶促水解处理之前，在碱处理过程中溶解的木质素吸收至阳离子淀粉聚合物中。该公开文献没有包括在酶促水解之前的脱木质化处理之后的碱脱木质化液体的分离，以从脱木质化液体回收木质素，并在用阳离子化合物回收木质素后将液流再循环回脱木质化处理而pH没有变化。在已知方法中，在酶促水解处理之前，没有从纤维素级分除去吸收的木质素。根据WO 2010039783A1的教导，木质素吸收增强了酶促水解处理。
专利公开IN217148B公开了一种使用絮凝剂(如阳离子淀粉聚合物)和凝结剂(如矿物酸)的组合物从来自纸浆制备过程的黑液中分离木质素的方法，pH变化至低于pH 6。
从木质纤维素材料生产木质纤维素糖的主要挑战之一是提供一种方法，其能够成本有效地生产高品质的糖水解产物，其可以用于随后的发酵步骤的生产中。糖水解产物的高品质表示杂质(如酚类和酸类)的含量应当低于对发酵中使用的微生物有毒的浓度。成本效率需要将水解产物生产中使用的化学品的消耗保持在低水平。这可以例如通过蒸煮化学品的再循环来实现。经济可行性还需要测流(其不用作微生物发酵的原料)的品质尽可能地高，使得能够限定这些流的价格。
现有技术的木质纤维素预处理技术已经针对厌氧发酵(纤维素乙醇)进行了设计。微生物油生产不同于厌氧发酵，因为其是需氧过程(需要氧)。本发明描述了对需氧生物过程(如微生物油生产)尤为有益的木质纤维素发酵方法。然而，本发明也适用于厌氧生物过程。
发明概述
本发明的目的是提供一种木质纤维素发酵方法，其解决了现有技术方法关于来自木质纤维素材料的整体糖产率低和回收非碳水化合物产物的化学成本高的问题。
本发明的另一个目的是提供一种方法，其能够生产糖水解产物，所述糖水解产物用于使用异养微生物的微生物油生产中。
本发明的再另一个目的是提供一种具有提高的酶促水解处理产率和生产力的发酵方法。
本发明的再另一个目的是提供一种成本更有效且更通用的用于木质纤维素的非碳水化合物级分的回收和限价的方法。
为了实现上述目的，通过独立权利要求中限定的特征来表征本发明。其他优选的实施方案呈现于从属权利要求中。
本发明是基于用阳离子化合物可以有效地沉淀碱处理中溶解的木质素并且在沉淀物分离后可以将碱液再循环至碱脱木质化步骤中的发现。碱液的再循环明显改善了碱处理步骤的成本效率。
根据本发明，通过使用阳离子化合物，在碱性pH下沉淀木质素。此外，使用阳离子化合物的木质素沉淀以及沉淀物从碱液的分离可以在碱性pH下进行，不需要改变pH。这允许将碱剂有效地再循环至木质纤维素分级方法的碱处理步骤中。由于木质素回收过程中pH没有变化，与其中由于用于木质素回收的酸化合物降低pH的情况相比，降低了碱处理的补足(新鲜)碱剂的量。
本发明还基于令人惊讶的发现：通过在酶促水解步骤之前分离碱处理的木质素，纤维素级分的酶促水解的效率和需氧发酵的成本效率得到显著改善。由于需氧发酵中使用的糖级分中的惰性材料(木质素)和抑制剂化合物的含量低，改善了成本效率需氧培养。
因此，本发明的一个方面涉及一种用于木质纤维素材料的分级的方法，该方法包括：
a)在碱性脱木质化剂的存在下，将木质纤维素材料接受脱木质化处理，以产生包括第一固相和含有溶解的木质素的第一液相的混合物，
b)将第一固相与第一液相分离，
c)将阳离子化合物引入第一液相中，以产生包括第二固相和第二液相的混合物，
d)在能够水解第一固相的半纤维素和纤维素级分的酶的存在下，将第一固相接受酶促水解处理，以产生包括第三液相和第三固相的混合物。
e)将第三液相与第三固相分离。
本发明的第二个方面涉及通过本发明的方法可获得的酶促水解产物形式的液相。酶促水解产物可以任选地是浓缩的。
因此，本发明的第三个方面涉及通过根据本发明的方法可获得的浓缩糖水解产物。
再一个方面涉及微生物脂质的生产方法，该方法包括
(i)提供包括根据本发明的酶促水解产物或浓缩糖水解产物形式的第三液相的培养基，
(ii)通过给培养基接种含油微生物接种来提供发酵肉汤，
(iii)温育接种了所述含油微生物的所述培养基，使脂质累积，
(iv)从所述含油微生物回收脂质。
附图简述
图1至3列出了用于木质纤维素材料治疗的加工流程。
图4列出了根据本发明实施方案的酶促水解的过程。
图5呈现了室温下来自实施例5的NaOH脱木质化溶液的4h温育后，阳离子淀粉用量对280nm和600nm下吸收降低百分比的影响。
图6呈现了在室温下Na2CO3脱木质化溶液的4h温育后，阳离子淀粉用量对280nm和600nm下吸收降低百分比的影响。
图7呈现了阳离子淀粉“Raifix 25035”补充后8h，含有Na2CO3脱木质化溶液的试管的照片。相对于脱木质化溶液的干物质的阳离子淀粉用量从左至右为0mg/g，0.074g/g，0.147g/g，0.214g/g，0.267g/g和0.332g/g。
图8呈现了阳离子淀粉“Raifix 25035”的用量对280nm下吸收降低的影响。
图9显示了含有补充阳离子淀粉“Raifix 25035”后24h的非碱液的试管的照片。相对于非碱液的干物质的阳离子淀粉的用量从左至右为0mg/g，13mg/g，28mg/g，41mg/g和68mg/g。
图10呈现了24h、48h和72h后分批水解后，第1次、第2次和第3次连续水解后，以及固体再循环和另外24h反应后，来自NaOH脱木质化禾秆和自水解禾秆的总糖产率。
图11呈现了分批水解、连续水解和固体再循环中NaOH脱木质化禾秆和自水解禾秆的水解中的酶生产力。
图12呈现了分批水解、连续水解和固体再循环中NaOH脱木质化禾秆和自水解禾秆的测定体积的糖生产力。48h过程包括48h分批水解或两个24h连续水解反应或在具有50％再循环率的稳态下的24h固体再循环反应。72h过程包括72h分批水解或三个连续的24h水解或再循环反应和另外的24h水解。
图13呈现了依据水解(A)、反应体积(B)和反应一致性(C)，具有50％再循环率的NaOH脱木质化和自水解禾秆的酶促水解中连续固体再循环反应的进展(糖产率、反应体积和反应一致性)。
图14呈现了使用米曲霉(Aspergillus.Oryzae)对麦秆纤维素和半纤维素水解产物的分批补料发酵的性能(微生物生物质中的细胞干重(CDW)(g/l)、脂肪酸(FA)浓度(g/l)、无脂肪细胞干重(CDW)(g/l)和脂肪酸(FA)含量(％))。
图15呈现了来自麦秆自水解的固体残余物的产率。
图16呈现了获自10％稠度(g禾秆固体干物质/g总计)麦秆的自水解的液体级分中的总可溶性糖浓度(g/l，左y-轴)和潜在的微生物抑制剂物质；糠醛、羟甲基糠醛(HMF)和可溶性酚醛类(g/l，右y-轴)。
表1.来自用不同脱木质化处理的自水解的禾秆的干物质产率(DM产率)的比较。来自脱木质化禾秆的酶促水解的糖产率取决于处理条件。以下的糖产率是基于自水解禾秆的干物质和基于自水解禾秆的碳水化合物含量给出的。
表2.通过醋酸钙和通过首先用阳离子淀粉然后用醋酸钙的连续处理，从碱上清液的木质素沉淀。
表3.通过醋酸钙和通过首先用阳离子淀粉然后用醋酸钙的连续处理，从碱上清液的木质素沉淀。
表4.补料前生长培养基的组成
发明详述
在描述本发明的实施方案中，为了清楚，将采用特定的术语。然而，本发明不打算受限于因此选择的特定术语，并且理解每个特定术语包括以相似方式操作来实现相似目的的所有技术等同物。
定义
木质纤维素材料
术语“木质纤维素生物质”或“木质纤维素材料”意思是包括但不限于木本植物或非木本、草本植物或其他含有纤维素和/或半纤维素的材料：材料可以是农业残留物(如麦秆、稻秆、谷壳、果壳、玉米秸秆、甘蔗渣、甘蔗尖和叶)、专用能量作物(如柳枝稷、Miscanthus、Arundo donax、草芦、柳树、水葫芦、能量甘蔗、能量高粱)、木材或残余物(包括锯木厂和纸浆和/或纸张厂残余物或级分，如半纤维素、废弃亚硫酸盐溶液、废纤维和/或生污泥)、苔藓或泥炭，或市政纸张废物。术语木质纤维素材料还包括低木质素材料，如大藻类生物质材料。此外，材料还包括来自工业实践的半纤维素或纤维素级分。术语木质纤维素材料包括任何种类的纤维素级分。不同来源、植物物种或工业过程的原料或原料的特定级分，如半纤维素和/或纤维素，可以混合在一起并用作原料，用于培养根据本发明的微生物生物质。通常，木质纤维素中的木质素含量高于5％。木质纤维素生物质还可以含有淀粉，例如，在整株植物的情况下。
水解
术语“水解”在本文中是指通过加入水将非单体碳水化合物的糖苷键或酯键降解成糖寡聚物和单体或羧酸。
水解产物
术语“水解产物”或“水解的材料”是指已经经受水解的材料。
严重程度
术语“严重程度”在本文中是指通过等式1计算的并且就温度和反应时间来描述水热条件的因素。
S＝Log(R0)，
其中
Figure BDA0001012262140000071
并且Tr是基础温度(100℃)。
木质纤维素水解产物
术语“木质纤维素水解产物”在本文中是指木质纤维素或木质纤维素材料的水解产物，包括纤维素和/或半纤维素，寡糖，单糖和/或双糖，乙酸，甲酸，其他有机酸，糠醛，羟甲基糠醛，乙酰丙酸，酚类化合物，从木质素、纤维素、半纤维素和/或木质纤维素的其他组分形成的其他水解和/或降解产物，源自蛋白质的氮化合物，金属和/或木质纤维素的非水解或部分水解片段。
水热处理
在本发明的内容中，术语“水热处理”是指在超过50℃的温度下含水木质纤维素悬浮液的热处理。水热处理可以在加压反应器中的压力下或在非加压反应器中的大气压力下进行。加压反应器中的压力可以通过从水加热至沸点时获得的蒸汽或通过增加的加压气相来产生。水热处理可以存在催化剂或不存在催化剂的情况下进行。将木质纤维素生物质的含水悬浮液接受压力下超过120℃温度的水热处理时，在不存在催化剂的情况下的水热处理(也称为“自水解”或“AH”)是指没有添加催化剂的木质纤维素生物素的水解。“自水解的禾秆”在本文中是指自水解后获得的固体级分。自水解的禾秆可以已经接受洗涤。
脱木质化处理
“脱木质化处理”在本文中是指从木质纤维素材料除去非碳水化合物材料(如木质素)的处理。脱木质化处理还指从木质纤维素生物质除去作为混合物的非碳水化合物和碳水化合物材料的处理。
蒸汽爆裂
在本发明的内容中，术语“蒸汽爆裂”是指如下处理，其中材料在压力下通过高压蒸汽(在110至250℃的温度下，通常140-230℃)加热，添加或未添加化学品(如酸)，并且在压力释放后将材料在所述温度下保持一定时间，引起材料的爆发性分解。在这种情况下，将蒸汽爆裂应用于木质纤维素材料，并且通常导致木质纤维素纤维刚性结构的破裂，即，纤维素纤维束的解纤。
碱性脱木质化剂
在本发明的内容中，术语“碱性脱木质化剂”是指加入水中时，使得溶液具有低于纯水的氢离子活性，即，pH高于7.0的化合物或化合物的混合物。碱性脱木质化剂可以选自以下组的化合物，所述化合物包括但不限于氢氧化物，如LiOH(氢氧化锂)、NaOH(氢氧化钠)、KOH(氢氧化钾)、Ca(OH)2(氢氧化钙)、NH4OH(氢氧化铵)或在水中可以形成氢氧化物离子的化合物，如液态或气态的NH3(氨)，碳酸盐，如HCO3-(碳酸氢根离子)、Li2CO3(碳酸锂)、Na2CO3(碳酸钠)、K2CO3(碳酸钾)，硫化物，如Na2S(硫化钠)，以及相应的水合物。
碱脱木质化处理
在本发明的内容中，术语“碱脱木质化处理”是指在碱性脱木质化剂存在下进行的木质纤维素的处理，pH(起始pH)通常为10至13。在碱脱木质化处理中，过氧化氢(H2O2)可以结合碱性脱木质化剂一起使用。
阳离子化合物
术语“阳离子化合物”是指术语“阳离子化合物”是指一种或多种包括阳离子的化合物或其包括阳离子的混合物。阳离子化合物包括但不限于包括阳离子基团(如季铵阳离子)的化合物。包括季铵阳离子的阳离子化合物包括但不限于阳离子聚合物和寡聚物，如阳离子淀粉、阳离子直链淀粉、阳离子支链淀粉、阳离子葡聚糖、阳离子木质素寡聚物、阳离子木质素聚合物、阳离子泥炭，或其混合物。优选的阳离子聚合物和寡聚物具有0.5-5meq/g的阳离子电荷密度。阳离子化合物还包括可以在水中形成二价或多价阳离子离子(如Ca2+或Mg2+)的化合物。这些可以形成二价或多价阳离子离子的化合物包括但不限于多价阳离子的乙酸盐、碳酸氢盐、溴化物、氯化物、甲酸盐、氢氧化物和硝酸盐。在本发明的优选实施方案中，分级的方法使用阳离子淀粉或氯化铝。
寡聚化合物
寡聚物和寡聚化合物是指由少于15个相同或不相同的连接的单体单元组成的化合物。
酶促水解
在本发明的内容中，术语“酶促水解”是指包括纤维素和/或半纤维素、寡糖的木质纤维素材料的酶处理，其中酶促进纤维素和/或半纤维素、寡糖水解获得单糖和/或双糖。通常，通过在水或缓冲剂的存在下将木质纤维素材料接受酶混合物来进行木质纤维素材料的酶促水解处理。酶混合物通常由但不限于1,4-β-葡聚糖酶(内葡聚糖酶和外葡聚糖酶，或内纤维素酶和外纤维素酶)、1,4-β-葡糖苷酶(纤维二糖酶)和半纤维素降解酶(半纤维素酶、木聚糖酶、***糖酶等)组成。
微生物脂质或脂质
在本发明的内容中，“微生物脂质”、“脂质”或“胞内脂质”是指脂肪物质，其分子通常含有作为一部分的脂肪族烃链，其溶解于非极性有机溶剂中，但在水中可溶性差。脂质是活细胞中大分子的必需基团。脂质是，例如，脂肪、油、蜡、蜡酯、固醇、类萜、类异戊二烯、类胡萝卜素、聚羟基链烷酸酯、核酸、脂肪酸、脂肪醇、脂肪醛、脂肪酸酯、磷脂、糖脂、鞘脂和酰基甘油，如三酰基甘油、二酰基甘油或单酰基甘油。本发明中的优选脂质是脂肪、油、蜡、酰基甘油和脂肪酸，及其衍生物，特别是三酰基甘油和蜡酯。在本发明的内容中，通过微生物合成脂质并在微生物中累积(胞内脂质)。在本发明的另一个实施方案中，通过微生物合成脂质并由微生物分泌(胞外脂质)。
结合本发明，将单细胞油用作脂质和脂肪的同义词。
术语“酰基甘油”是指甘油和脂肪酸的酯。酰基甘油通常作为脂肪和脂肪油产生。酰基甘油的实例包括三酰基甘油(TAG，甘油三酸酯)、二酰基甘油(甘油二酸酯)和单酰基甘油(甘油一酸酯)。
糖
在本发明的内容中，术语“糖”是指寡聚、二聚和单体碳水化合物。特别地，在本申请中，术语糖是指源自木质纤维素材料的水溶性寡聚、二聚和单体碳水化合物。术语“多聚糖”意思是多聚形式的并且通常不溶于水中的碳水化合物。
糖产率
在本发明的内容中，术语“糖产率”是指来自特定材料的寡聚、二聚合单体碳水化合物的产率。特别地，在本申请中，术语糖产率是指源自木质纤维素材料的水溶性寡聚、二聚和单体碳水化合物的产率。
单细胞油生产方法
“单细胞油生产方法”在本文中是指一种方法，包括形成或允许脂质合成微生物生长并允许由此获得的生物体集合产生和/或储存(累积)脂质，从脂相回收细胞，并从细胞提取或回收脂质的步骤。在特定情况下，单细胞油也可以是胞外的，如在培养过程中或培养后，从培养基中的细胞提取或释放。
需氧培养
术语“需氧培养”或“需氧发酵”是指其中微生物利用氧作为末端电子受体用于能量产生的培养(即，微生物使用需氧呼吸)。通常，在生物反应器中，通过添加氧气或含氧气体混合物(通常是空气)来进行需氧培养，即，给生物反应器通气。当微生物在培养中使用需氧呼吸时，可以称为“在需氧条件下的培养”。通常，这在通气生物反应器中进行。
单细胞油生产方法
“单细胞油生产方法”在本文中是指一种方法，包括形成或允许脂质合成微生物生长并允许由此获得的生物体集合产生和/或储存(累积)脂质，从脂相回收细胞，并从细胞提取或回收脂质的步骤。在特定情况下，单细胞油也可以是胞外的，如在培养过程中或培养后，从培养基中的细胞提取或释放。
含油微生物或油产生微生物
本发明中使用的含油微生物(也称为油产生微生物)选自细菌、蓝细菌、真菌(如酵母和丝状真菌)、古细菌或微藻。微生物可以容易地累积脂质或已经遗传修饰来累积脂质或提高脂质的累积。
优选地，使用能够利用C6和C5糖的生物体。优选地，生物体是酵母、丝状真菌或细菌。
在本发明的内容中，含油微生物是指能够累积胞内脂质的微生物，使得在合适的条件下培养时，脂质含量为总生物质的至少15％(w/w)(根据细胞干重)。在优选实施方案中，含油微生物能够累积微生物总生物质的至少20％(w/w)(根据细胞干重)。
用于本发明目的的优选微生物株包括，但不限于，以下所列的种和属：
根据本发明的一个实施方案，微生物是能够利用源自木质纤维素材料的糖的含油微生物。优选地，含油微生物能够利用木质纤维素水解产物中的C6糖(六碳糖，如葡萄糖、甘露糖和半乳糖)和C5糖(如木糖和***糖)。根据本发明的一个实施方案，含油生物体能够利用木质纤维素或其级分中的多聚或寡聚碳水化合物。
优选的(丝状)真菌株来自以下属的种：曲霉属(Aspergillus)，如米曲霉(Aspergillus oryzae)，被孢霉属(Mortierella)，如深黄被孢霉(Mortierellaisabellina)，毛壳菌属(Chaetomium)，麦角菌属(Claviceps)，Cladosporidium，小克银汗霉属(Cunninghamella)，翘孢霉属(Emericella)，镰刀霉属(Fusarium)，Glomus，毛霉属(Mucor)，Pseudozyma，腐霉属(Pythium)，根霉属(Rhizopus)，如米根霉(Rhizopusoryzae)，银耳属(Tremella)，接霉属(Zygorhynchus)，腐质霉属(Humicola)，枝孢属(Cladosporium)，畸枝霉属(Malbranchea)，伞形霉属(Umbelopsis)，如深黄伞形霉(Umbelopsis isabellina)和黑粉菌属(Ustilago)。最优选的真菌种来自曲霉属和/或被孢霉属。优选的真菌是那些能够有效生产脂质的真菌。
优选的酵母株是属于来自以下属的种的那些：地丝菌属(Geotrichum)，Deparyomyces，管囊酵母属(Pachysolen)，Galactomyces，汉逊酵母属(Hansenula)，Leucosporidium，掷孢酵母属(Sporobolomyces)，锁掷酵母属(Sporidiobolus)，Waltomyces，隐球菌属(Crytococcus)，如弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)，红冬孢酵母属(Rhodosporidium)，如圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)或Rhodosporidium fluviale，红酵母属(Rhodotorula)，如粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)，耶氏酵母属(Yarrowia)，如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，假丝酵母属(Candida)，如弯假丝酵母(Candida curvata)，油脂酵母属(Lipomyces)，如斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)和毛孢子菌属(Trichosporon)，如皮肤毛孢子菌(Trichosporoncutaneum)或芽毛孢子菌(Trichosporon pullulans)。最优选的酵母来自油脂酵母属、红冬孢酵母属和隐球菌属。优选的酵母是能够有效产生脂质的那些酵母。
优选的细菌是属于来自以下属的种的那些：红球菌属(Rhodococcus)，不动杆菌属(Acinetobacter)和链霉菌属(Streptomyces)。优选的细菌是能够有效产生脂质的那些细菌。
最优选的藻类是微藻，如来自以下属的微藻种，所述属包括咸胞藻属(Brachiomonas)，隐甲藻属(Crypthecodinium)，小球藻属(Chlorella)，杜氏藻属(Dunaliella)，菱板藻属(Hantzschia)，微球藻属(Nannochloris)，微绿球藻属(Nannochloropsis)，菱形藻属(Nitzschia)，原绿藻属(Prototheca)，栅藻属(Scenedesmus)，裂殖壶藻属(Schizochytrium)，Traustrochytrium和Ulkenia。优选的微藻是能够异养地生长和有效地生含油脂的那些微藻。属于裂殖壶藻属、破囊壶藻(Thraustochytrium)和隐甲(Crypthecodinium)和Ulkenia的生物体有时候也被称为海洋真菌。
根据本发明的另一个实施方案，来自木质纤维素生物质的碳水化合物主要是单体形式的并且将不能够利用寡聚或多聚碳水化合物的生物体用于单细胞油生产。这样的油生产微生物选自细菌、蓝细菌、真菌(如酵母和丝状真菌)、古细菌或微藻。微生物可以容易地累积脂质或已经遗传修饰来累积脂质或提高脂质的累积。
脂质回收
“油回收”或“脂质回收”或“从含油微生物回收脂质”是指其中通过机械、化学、热机械或自动催化方法或通过这些方法的组合从微生物细胞回收的脂质(胞内脂质)的过程。或者，“油回收”可以表示从培养(发酵)液回收胞外产生的脂质。
含脂质单细胞物质
“含脂质单细胞物质”代表具有至少优选微生物生物质干物质的至少10％，优选至少15％(w/w)或更多脂质含量的单细胞物质或细胞菌丝体。
残留细胞物质
在本发明的内容中，“残留细胞物质”是指固体、半固体或流动材料级分，其含有为回收胞内脂质而处理的微生物。
生物燃料
在本发明的内容中，“生物燃料”是指主要源自生物质或生物废物并且不同于化石燃料的固体、液体或气体燃料，所述化石燃料源自史前植物和动物的有机残留物。
根据欧盟指令2003/30/EU“生物柴油”是指从植物油或动物油产生的甲酯，具有用作生物燃料的柴油品质。更宽泛地，生物柴油是指柴油品质的植物油或动物油的长链烷基酯，如甲酯、乙酯或丙酯。生物柴油也可以从微生物脂质生产，由此微生物脂质可以源自细菌、真菌(酵母或霉菌)、藻类或另一种微生物。
可再生柴油
“可再生柴油”是指通过动物、植物或微生物来源的脂质的氢处理产生的燃料，或其混合物，由此微生物脂质可以源自细菌、真菌(酵母或丝状真菌)、藻类或另一种微生物。可再生柴油还可以通过气化和Fischer-Tropsch合成产自源自生物质的蜡。任选地，除了氢处理，可以进行异构化或其他加工步骤。可再生柴油方法还可以用于产生喷气燃料和/或汽油。可再生柴油的产生已经描述于专利公开EP1396531、EP1398364、EP 1741767和EP1741768中。
生物柴油或可再生柴油可以与化石燃料混合。可以将合适的添加剂，如防腐剂和抗氧化剂，加入到燃料产品中。
润滑剂
“润滑剂”是指作为表面涂层施用于移动部件时降低摩擦力的油脂、脂质或油。润滑剂的两个其他主要功能是除热和溶解杂质。润滑剂的应用包括，但不限于，在内燃机中作为机油、燃料中的添加剂、在油驱动设备(如泵和液压装置)中或在不同类型的轴承中的用途。通常，润滑剂含有75-100％基油，剩余的是添加剂。合适的添加剂例如是去污剂、储存稳定剂、抗氧化剂、阻蚀剂、去雾剂、破乳剂、消泡剂、助溶剂和润滑添加剂(参见，例如US 7,691,792)。用于润滑的基油可以源自矿物油、植物油、动物油或来自细菌、真菌(酵母或丝状真菌)、藻类或另一种微生物。基油还可以通过气化和Fischer-Tropsch合成产自源自生物质的蜡。使用粘度指数来表征基油。通常，高粘度指数是优选的。
根据本发明中所述方法生产的脂质可以用作用于水生物柴油、可再生柴油、喷气燃料或汽油生产的给料。生物柴油可以由脂肪酸甲酯组成，并且通常通过酯交换来产生。在酯交换中，酰基甘油转化成长链脂肪酸烷基(甲基、乙基或丙基)酯。可再生柴油是指通过脂质的氢处理(氢脱氧、氢化或加氢处理)产生的燃料。在氢处理中，酰基甘油转化成相应的链烷(石蜡)。链烷(石蜡)可以进一步通过异构化或通过其他加工替换方案来修饰。可再生生物柴油方法也可以用于产生喷气燃料和/或汽油。此外，可以进行脂质的裂化来产生生物燃料。此外，在某些应用中，脂质可以用作生物燃料。
使用该方法产生的脂质也可以用作用于润滑剂的基油(润滑油)或作为用于基油生产的起始材料，所述基油用于润滑剂。
干物质
“DM”或“干重”在本文中是指干物质并且是已经接受基本上从材料中除去水的处理时材料质量的测量(即，材料是完全干燥的)。
稠度
“稠度”在本文中是指固体与悬浮液总重的比。
用于木质纤维素材料分级的方法
本发明提供了一种用于木质纤维素材料分级的方法，用于获得从已经除去相当大部分的木质素分离的纤维素碳水化合物材料。任选地，该方法还可以提供包括半纤维素糖的级分。该方法进一步提供浓缩木质素的级分。包括从木质纤维素材料获得的纤维素碳水化合物材料的级分可以用于培养基的制备，所述培养基用于生产微生物脂质，如本文中所述的，任选地在培养中将包含碳水化合物材料的级分与包含半纤维素糖的级分混合，用于微生物脂质的生产。
在第一个方面中，本发明涉及一种用于木质纤维素材料分级的方法，该方法包括
a)在碱性脱木质化剂存在下，将木质纤维素材料接受脱木质化处理，以产生包括第一固相和含有溶解的木质素的第一液相的混合物，
b)将第一固相与第一液相分离，
c)将阳离子化合物引入第一液相中，以产生包括第二固相和第二液相的混合物，
d)在能够水解第一固相的半纤维素和纤维素级分的酶的存在下，使第一固相接受酶促水解处理，以产生包括酶促水解产物形式的第三液相和第三固相的混合物。
e)将第三液相与第三固相分离。
发明人已经发现了通过将碱脱木质化步骤结合随后的阳离子化合物的应用，可以除去溶解的木质素，使材料的液相再循环，而不需要通过降低pH来沉淀木质素的步骤。
在本发明的优选实施方案中，将第二液相与第二固相分离，并将第二液相再循环至步骤a)。通过再循环第二液相并由此进行一轮或多轮步骤a)至e)，可以从液相除去更多木质素。因此，在使纤维素糖接受酶促水解之前，材料可以接受两个重复的碱脱木质化(溶解的木质素)接着用阳离子化合物处理(除去溶解的木质素)的循环。
使用碱性脱木质化剂的脱木质化步骤
在木质纤维素材料的分级方法的步骤a)中，使第一固相(包括任选地从其已经部分地除去半纤维素材料的木质纤维素材料)接受碱脱木质化步骤，其中至少部分木质素溶解。通过使木质纤维素材料(任选从其已经部分地去除半纤维材料)接受碱性脱木质化剂来进行碱脱木质化。
通常通过制备包括木纤维素材料(任选地水热处理的或自水解的)、含水液体和一种或多种碱化学品或其混合物(以获得高于pH7的悬浮液pH)的悬浮液来进行碱处理。优选地，加入的碱化学品的含量可以获得10至13的悬浮液pH。
将碱悬浮液保持在其中悬浮液含有至少一个液相的温度下。温育不限于任何特定温度，但可以在等温或非等温的宽温度范围中进行。温育优选在25℃至160℃，更优选25至120℃的温度下进行。
任选地进行搅拌，以提高温育过程中的热转移的效率。根据计划的分解材料的程度，选择处理时间。优选地，处理时间为半小时至二十小时。
反应时间后，通过使用任一种方法，包括但不限于过滤，例如，压力过滤或螺旋压榨，来分离液相和固相。将固相用于酶促水解，以释放糖，用于进一步的使用，如微生物油生产。可以处理液相来沉淀木质素，如通过酸处理，并且可以通过任一种方法来分离沉淀的木质素。
在本发明的一个实施方案中，碱性脱木质化剂选自氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸钾、氢氧化钙和碳酸钙、氢氧化锂、碳酸锂、氢氧化铵、氨、硫化钠和相应的水合物。在优选实施方案中，碱性脱木质化剂是氢氧化钠。在优选实施方案中，碱性脱木质化剂是碳酸钠。
根据本发明的再另一个实施方案，使用铵作为脱木质化化学品来进行木质纤维素材料的脱木质化。根据本发明的一个实施方案，铵纤维膨胀(AFEX)或氨。
如上所述，发明人已经令人惊讶地发现了如果在碱脱木质化之前，木质纤维素材料接受水热处理，如自水解，可以有效地进行碱脱木质化，而不需要过量应用碱性脱木质化剂。水热处理导致固体级分(包括纤维素、木质素和残余半纤维素)降低的酸度。因此，在碱脱木质化步骤中，与没有进行水热处理时的情况相比，需要较少的碱剂、因此，与没有自水解的情况相比，在水热处理后，可以在较低pH下进行碱处理。因此，在木质纤维素材料的碱处理前，水热处理是有益的。使用较低量的碱性脱木质化剂的一个优势是与在高用量的碱性脱木质化剂存在下进行的相似处理相比，碱脱木质化步骤中的糖损耗较低。
因此，在本发明的优选实施方案中，脱木质化剂的浓度为0.1至10wt％，更优选0.1-4wt％，基于干物质基础的木质纤维素材料的量。在进一步的实施方案中，将碱性脱木质化剂加入到木质纤维素材料中，获得具有高于7，优选10至13的pH的悬浮液。
在进一步的实施方案中，在高于25，优选30至160℃的温度下进行脱木质化处理。
使用阳离子化合物的木质素回收步骤
在用于木质纤维素材料的分级方法的步骤b)中，使从碱脱木质化的产品获得的液体(通过分离第一固相和第一液相的混合物)接受使用阳离子化合物的处理，以从材料除去木质素。阳离子化合物捕获从分离碱脱木质化产品获得的液相(第一液相)中溶解的木质素。
从碱脱木质化处理获得的碱脱木质化液体包括有机材料和无机材料，如木质素或其他碱溶性材料。所述碱溶液(碱脱木质化液体)具有7>pH<14的酸度。将一种或多种阳离子化合物以足以沉淀之前可溶性有机材料的剂量加入到碱溶液中。据此，实现沉淀，而没有碱溶液的酸化，使得碱溶液的pH保持基本上不变。
通过常规方式，将沉淀的固体级分与碱溶液分离，由此产生“澄清的碱溶液”以及包括沉淀的有机材料和阳离子物质的沉淀的固体级分。沉淀的固体级分可以按原样使用或进一步处理，以回收阳离子物质。优选地，与热值相比，分离的木质素可以用于增值应用。任选地，洗涤分离的木质素级分。
将澄清的碱溶液再循环至碱处理步骤，并且将产生的碱脱木质化液体按照以上所述的再次沉淀。任选地，将澄清的碱溶液与新鲜碱和/或液体混合，以替代碱处理中消耗的量。重复该过程，直至碱脱木质化液体被非沉淀物质饱和。
在本发明的一个实施方案中，阳离子化合物选自阳离子聚合物和寡聚物，如阳离子淀粉多糖、阳离子直链淀粉、阳离子支链淀粉、阳离子葡聚糖、阳离子木质素寡聚物、阳离子木质素聚合物、阳离子泥炭，或其混合物。在另一个优选的实施方案中，阳离子化合物是阳离子淀粉聚合物。
在进一步的实施方案中，阳离子聚合物和寡聚物具有0.5-5meq/g的阳离子电荷密度。
在一个实施方案中，阳离子化合物是选自碱土金属以及二价和三价铁(Fe)的阳离子的元素阳离子离子。在另一个实施方案中，阳离子离子可以源自化合物，如AlCl3氯化铝、Ba(C2H3O2)2醋酸钡、Ba(HCO3)2碳酸氢钡、BaBr2溴化钡、BaCl2氯化钡、Ba(HCO2)2甲酸钡、(Ba(OH)2氢氧化钡)、Ba(NO3)2硝酸钡、Ca(C2H3O2)2醋酸钙、Ca(HCO3)2碳酸氢钡、CaBr2溴化钙、CaCl2氯化钙、Ca(HCO2)2甲酸钙、(Ca(OH)2氢氧化钙)、Ca(NO3)2硝酸钙、Mg(C2H3O2)2醋酸镁、Mg(HCO3)2碳酸氢镁、MgBr2溴化镁、MgCl2氯化镁、Mg(HCO2)2甲酸镁、(Mg(OH)2氢氧化镁)、Mg(NO3)2硝酸镁、Fe(C2H3O2)2醋酸铁、FeCl3氯化铁，以及相应的水合物。在优选的实施方案中，阳离子化合物的含量为0.001-0.25g/g，基于第一液相的干物质含量。在另一个优选实施方案中，阳离子化合物是氯化铝。
在本发明的一个实施方案中，所述方法使用阳离子化合物的混合物，如阳离子聚合物的混合物、阳离子离子的混合物或阳离子离子和阳离子聚合物的混合物，如阳离子化合物的混合物，其中混合物包括阳离子淀粉聚合物和氯化铝，或混合物由阳离子淀粉聚合物和氯化铝组成。
因此，如上所述，因此使包括碳水化合物的第二液相再循环并在步骤a)中引入，并接受另一轮的碱脱木质化步骤，接着用阳离子化合物处理(如图1中所示)。可以进行第二液相的再循环，而不需要添加碱性脱木质化剂，与其中用酸替代应用阳离子化合物沉淀溶解的木质素的情况不同。
因此，在进一步的实施方案中，将第二液相与第二固相分离，并将第二液相再循环至步骤a)。
根据本发明，可以通过阳离子化合物从碱脱木质化液体沉淀出木质素，而没有pH的变化，并且将木质素沉淀物(去除后)的澄清碱脱木质化液体再循环至碱脱木质化步骤。这是有益的，因为与其中为了木质素回收必须通过酸化合物降低pH的情况相比，碱处理的补足(新鲜)碱剂的量较低。
碱脱木质化之前从木质纤维素材料部分去除半纤维糖的任选步骤
用于木质纤维素材料分级的方法可以任选地包括其中从木质纤维素材料至少部分去除半纤维素的步骤，以产生包括半纤维素的液相和木质纤维素材料的固相，将其在方法的步骤a)中引入(如图2中所示)。
因此，在一个实施方案中，使木质纤维素材料接受处理，其中作为含水半纤维素水解产物从木质纤维素材料至少部分地除去半纤维素，将木质纤维素材料接受步骤a)。在进一步的实施方案中，将至少部分含水半纤维素水解产物与第一固相合并，并接受酶促水解处理。
在分级方法的这个任选步骤中，半纤维素在包括半纤维素的液相中至少部分溶解和分离。
因而断定在使木质纤维素材料接受碱脱木质化步骤中的碱性脱木质化剂之前，通过木质纤维素或木质纤维素材料的一种或多种处理可以获得通过本发明的方法获得的木质纤维素水解产物，所述处理包括水解(水热处理和/或自水解)、蒸汽爆裂(添加或未添加酸)、一个或多个脱木质化步骤。
在本发明的一个实施方案中，通过水热处理，从木质纤维素材料至少部分地除去半纤维素。在第二个实施方案中，在100至250℃，优选140至240℃，并且最优选140至200℃的温度下进行水热处理。水热处理的增强可以根据严重程度来表述，该术语在本文中有限定。在优选实施方案中，在对应于2.0至4.5，更优选3.0至4.1，并且最优选3.5至4.0的严重程度的条件下进行水热处理。
在本发明的另一个实施方案中，通过自水解处理，从木质纤维素材料至少部分地除去半纤维素。自水解通常在5-60％干物质含量下，在140至240℃的温度下进行1-120min，没有添加酸化合物，导致包含半纤维素碳水化合物的木质纤维素材料中5-40％的干物质含量溶解。通常，自水解从木质纤维素材料溶解30至100％，更优选>50％，更优选>70％，更优选>80％，甚至更优选>90％半纤维素碳水化合物。溶解的半纤维素碳水化合物至少部分是寡聚形式的。更常见地，自水解在10-50％干物质含量下，在160-220℃下进行，这取决于木质纤维素原料。自水解后，通过任何方法，如过滤，例如，压滤，或通过螺旋压榨，来分离固相和液相。可以洗涤固体级分，以从固相除去溶解的半纤维素。
根据本发明的再另一个实施方案，使木质纤维素材料接受蒸汽或蒸汽爆裂，添加或未添加酸化合物，通常在110至250℃的温度下，更常见在140至230℃的温度下进行。所述处理导致半纤维素碳水化合物的溶解。任选地，洗涤来自蒸汽爆裂的固体材料，以回收溶解的半纤维素碳水化合物。
在一个实施方案中，在引入步骤a)前，使从其除去了至少部分半纤维素的木质纤维素材料接受蒸汽爆裂。在本发明的另一个实施方案中，首先使木质纤维素材料接受水热处理，接着接受蒸汽爆裂步骤。在另一个实施方案中，在碱性脱木质化剂存在下的脱木质化处理前，使水热处理和/或自水解获得的固相接受蒸汽爆裂。
根据本发明，令人惊讶地发现了同时包括其中半纤维素糖变成至少部分溶解的处理步骤(如自水解)和允许方法中高的整体(总)糖产率的碱脱木质化的处理步骤(如使用NaOH的处理)的木质纤维素处理方法。高的整体糖产率对于微生物方法(如单细胞油的生产)的成本效益是有益的。
脱木质化产物的酶促水解
在木质纤维素材料的分级方法的步骤d)中，使使用阳离子化合物从分级步骤获得的第一固相进一步接受酶促水解。在可替换的实施方案中，其中已经通过重复的碱脱木质化和随后的阳离子化合物处理步骤除去了相当大部分的木质素，可以将第二液相用于酶促水解中，以获得包括纤维素糖的第三液相。
酶促水解
酶促水解由使用酶混合物温育预先处理的禾秆或其他底物或原料组成，所述酶混合物通常由以下酶组成，但不限于，1,4-β-葡聚糖酶(内葡聚糖酶和外葡聚糖酶，或内纤维素酶和外纤维素酶)、1,4-β-葡糖苷酶(纤维二糖酶)和半纤维素降解酶(半纤维素酶、木聚糖酶、***糖酶等)。酶可以是或可以不是商业酶产品。将分级(预处理)的木质纤维素材料以合适的比例与水或缓冲液混合物以及酶混合物混合。添加剂，如聚乙二醇、去污剂或其他表面活性剂，或蛋白质，可以加入或可以不加入反应中。可以使用悬浮液中任何比例(或“稠度”)，优选10-35％，或特别地15-25％的固体。根据针对所用的酶混合物的最佳条件，调节浆液的pH。在添加酶之前和/或之中，通过加入合适浓度的酸或碱，进行pH调节，所述酸或碱例如H2SO4、HCl、HNO3、NaOH、NH3或其他酸或碱。在加入酶之后或水解过程中，可以进行或不进行进一步的pH调节。
根据酶混合物的最佳条件，在水解过程中维持恒定的温度，常常为40-60℃，或特别为50℃。在加入悬浮液之前，预处理的禾秆、水和/或缓冲液以及水解悬浮液的其他组分，可以预热或不预热至反应温度。在反应过程中，通过搅拌、振荡、自由落体或通过其他方式的搅动，来搅动悬浮液。
在本发明的一个实施方案中，通过使木质纤维素材料在水或缓冲剂的存在下接受酶混合物，来进行木质纤维素材料的酶促水解处理。酶混合物通常由以下酶组成，但不限于，1,4-β-葡聚糖酶(内葡聚糖酶和外葡聚糖酶，或内纤维素酶和外纤维素酶)、1,4-β-葡糖苷酶(纤维二糖酶)和半纤维素降解酶(半纤维素酶、木聚糖酶、***糖酶等)。
通过使获自碱脱木质化步骤的第一固相接受酶促水解，进一步从材料除去固体木质素形式的木质素(第三固相)。从酶促水解获得的液相包括从材料释放的糖。第三液相也称为酶促水解产物，其可以用于微生物脂质的生产。
部分半纤维素糖，其任选地通过例如水热处理或自水解从材料分离，可以引入***并与获自碱脱木质化步骤的固相材料一起接受酶促水解。
因此，使这种混合物接受步骤d)的酶促水解处理之前，可以加入至少部分分离的半纤维素(液相)，并与碱脱木质化步骤的固相(第一固相)混合。因此，在本发明的一个实施方案中，将至少部分的第一液相与第二固相混合，并接受酶促水解处理。
在一个实施方案中，按照分批水解进行酶促水解。
分批水解
分批水解是指其中将反应成分混合形成悬浮液或浆液或糊状物，并且温育合适的时间段，此后通过过滤、离心或其他分离方式分离固体，并获得可溶性糖的液流的水解反应，所述可溶性糖包括葡萄糖、木糖、***糖、半乳糖、甘露糖和其他，及其寡聚物。在反应过程中，可以加入或不加入反应成分或其他物质。然而，在反应结束前，没有从浆液分离液流。
分批反应也可以按照连续过程来进行。在连续分批水解中，将预先处理的禾秆、液体、酶、pH调节剂和其他反应成分的恒定流加入反应器中，同时从反应器中除去恒定的浆液流，将液流与其分离。在连续分批水解中，反应器可以细分或不细分成连续的两个或更多个反应器，浆液通过其恒定地流动，特别是为了改善原料的停留时间分布。在概念上，只在反应后从液体分离固体材料，并且在反应过程中没有进行分离。因此，除了来自最后一个反应器的浆液，来自其他反应的流出浆液没有进行分离，并且因此，没有从浆液除去其他分离的液流，除了来自最终流出浆液分离的液流。然而，在该过程的任何点，可以进行另外的反应成分的补料。如果在两个反应器之间进行液体的分离，反应器应当限定为分开的反应步骤，并且水解过程应当被限定为按序(逐步)水解。
在本发明的第二个实施方案中，按照按序水解进行酶促水解。
按序水解
按序水解，也称为逐步水解，或两步、三步或多步水解等，由一系列连续的分批反应组成，其中在分批反应之间，从浆液分离液流并将浓缩的固体流加入下一批反应中，并与新鲜水和/或缓冲液混合。在第二个、第三个或之后的反应中，可以进行或不进行新鲜酶和其他反应成分的添加。反应时间在随后的反应步骤中可以相等或不同。
与针对分批反应所述的相似，按序水解可以作为连续过程来进行，并且按序水解的单个反应步骤可以细分至一系列的分开反应器中，浆液通过其恒定地流动。在反应器之间可以进行或不进行液体的分离和新鲜液体的添加。在概念上，如果在两个反应器之间分离液体并且液体被或不被新鲜液体替代，反应器应当限定为分开的反应步骤。
在再进一步的实施方案中，作为固体再循环水解来进行酶促水解。
酶促水解中残余固体的再循环(或“固体再循环”)
使用残余固体再循环或“固体再循环”的水解过程包括水解反应，此后从浆液分离液流，并且将一部分浓缩的固体流再循环回相同的反应器中(图5)。再循环的残余固体部分被称为再循环比例并且通过图5中的r和等式2&3来表示。在恒定的原料给料速率下，固体再循环延长了固体材料根据几何级数的反应时间，呈现于等式2中，其中tn是n次随后的再循环反应后固体的平均反应时间，t0是单次反应的反应时间，或反应器中浆液的停留时间，或r是再循环比例。最后，恒定给料和再循环比例以及恒定停留时间下的再循环过程将达到稳态，从等式3可以计算固体材料在稳态下的平均反应时间。
Figure BDA0001012262140000251
Figure BDA0001012262140000252
例如，在24h反应中的50％再循环比例，固体的平均反应时间在稳态下将是48h。
再循环反应可以作为分批反应来进行，此后进行固体再循环，或作为连续过程来进行，其中将该过程的成分恒定地补料至反应器中，进行浆液的恒定流出并且将流出的浆液分成液体和浓缩的残余固体流，并且将残余固体的恒定流再循环回反应器中。再循环反应可以细分或不细分至一系列的分开反应器中，以改善液体形式的停留时间分布和分离，或在这些反应器后，可以进行或不进行将过程成分另外补料至这些反应器中。在固体再循环反应之后或之前或之中，可以包括或不包括另外的按序反应步骤。
任选地通过使木质纤维素材料接受水热处理或自水解获得的半纤维素材料可以在酶促水解步骤再次引入(至少部分)。因此，在本发明的一个实施方案中，将至少部分含水半纤维素水解产物与第一固相混合，并接受酶促水解处理。
步骤d)中获得的液体酶促水解产物可以接受浓缩水解产物的步骤，以获得浓缩的水解产物，如通过蒸发，以获得具有较高浓度的纤维素碳水化合物的级分。
因此，在一个实施方案中，根据本发明的方法包括进一步包括浓缩第三液相的步骤。优选地，通过蒸发进行第三液相的浓缩。
液体酶促水解产物(第三液相)
本发明方法的步骤d)中获得的液相(酶促水解产物)包括从方法的步骤a)中提供的起始材料释放的糖或在方法任选的之前的水热处理和/或自水解步骤中释放的糖。包含糖的液相可以用于培养基的制备中，如按照本文中所述的，用于生产微生物脂质的方法中的培养。
因此，本发明的第二个方面涉及通过本发明的方法可获得的酶促水解产物形式的液相(第三液相)。
或者，液相酶促水解产物可以浓缩，以获得具有较高浓度糖的液体。因此，本发明的再一个方面提供了通过本发明的方法可获得的浓缩糖水解产物。
来自第一液相的半纤维素水解产物(包括半纤维素糖单体)和酶促水解产物，第三液相(包括纤维素糖)可以单独用于培养液中或混合在一起作为用于单细胞油生产的碳源。
微生物脂质的生产方法
本发明的再一个方面涉及一种用于生产微生物脂质的方法，该方法包括
(i)提供培养基，其包括通过木质纤维素材料分级方法获得的酶促水解产物形式的液体(第三液相)或本发明的浓缩糖水解产物，
(ii)通过给培养基接种含油微生物来提供发酵肉汤，
(iii)温育接种了所述含油微生物的所述培养基，允许脂质累积，
(iv)从所述含油微生物回收脂质。
本发明的方法也称为单细胞油生产方法。本发明的方法可以是如本文中所述的用于生产生物燃料的方法的一部分，其中通过本文中所述的方法以微生物油的形式提供油或至少一部分油。
根据本发明的优选实施方案，培养基包含源自纤维素和/或半纤维素的木质纤维素糖。根据本发明，木质纤维素生物质的半纤维素和/或纤维素级分都作为同一过程中(生物反应器***)中用于微生物油(单细胞油)生产的原料使用。该方法优选地使用能够同时利用C6(例如，葡萄糖、甘露糖、半乳糖)和C5(例如，木糖、***糖)糖的含油微生物。
根据本发明的另一个实施方案，培养基包含源自木质纤维素的半纤维素糖。根据本发明的再另一个实施方案，给料至单细胞油生产过程时，半纤维素糖至少部分是寡聚形式的。
在本发明的优选实施方案中，根据前述权利要求的用于微生物脂质生产的方法，该方法包括
a)在碱性脱木质化剂存在下使木质纤维素材料接受脱木质化处理，以产生包括第一固相和含有溶解的木质素的第一液相的混合物，
b)将第一固相与第一液相分离，
c)将阳离子化合物引入到第一液相中，以产生包括第二固相和第二液相的混合物，
d)使第一固相接受酶促水解处理，以水解第一固相的半纤维素和纤维素级分，以产生包括酶促水解产物形式的第三液相和包括木质素的第三固相的混合物，
(i)提供包括步骤d)的酶促水解产物形式的第三液相的培养基，
(ii)通过给培养基接种含油微生物来提供发酵肉汤，
(iii)温育接种了所述含油微生物的所述培养基，允许脂质累积，
(iv)从所述含油微生物回收脂质。
在步骤a)中引入木质纤维素材料并使其接受碱脱木质化之前，木质纤维素材料可以任选地预处理，以从材料分离或部分分离半纤维素。
因此，在一个实施方案中，使木质纤维素材料接受处理，其中在步骤a)前，从木质纤维素材料作为含水半纤维素水解产物至少部分地除去半纤维素
本发明使用的用于生产微生物脂质的微生物是含油微生物。(如本文中所述的)含油微生物能够累积胞内脂质，使得在合适条件下培养时，脂质占据至少15％(w/w)的微生物总生物质(按照细胞干重)。在优选的实施方案中，含油微生物能够累积至少20％(w/w)的微生物总生物质(按照细胞干重)。在本发明的一个实施方案中，用于脂质生产的含油微生物选自酵母和丝状真菌。优选地，在需氧条件下进行用于微生物脂质生产的方法。因此，在本发明的一个实施方案中，如本文中所述的，作为需氧培养，进行步骤(iii)中的温育。
当描述本发明的实施方案时，没有明确地描述所有可能实施方案的组合和排列。然而，在相互不同的从属权利要求中记述了或在不同实施方案中描述了某些措施这一仅有的事实并不表示这些措施的组合不能使用而获益。本发明设想了所述实施方案的所有可能的组合和排列。
申请人打算将本文中的术语“包括(comprising)”、“包括(comprise)”和“包括(comprises)”在每种情况下可任选地分别被术语“由……组成(consisting of)”、“由……组成(consist of)”或“由……组成(consists of)来替代。
项
在下文中，通过非限制性项来描述本发明。
项1.用于木质纤维素材料分级的方法，该方法包括
a)在碱性脱木质化剂的存在下，使木质纤维素材料接受脱木质化处理，以产生包括第一固相和含有溶解的木质素的第一液相的混合物，
b)将第一固相与第一液相分离，
c)将阳离子化合物引入到第一液相中，以产生包括第二固相和第二液相的混合物，
d)在能够水解第一固相的半纤维素和纤维素级分的酶的存在下，使第一固相接受酶促水解处理，以产生包括酶促水解产物形式的第三液相和第三固相的混合物。
e)将第三液相与第三固相分离。
项2.根据项1的方法，其中阳离子化合物选自阳离子聚合物和寡聚物，如阳离子淀粉多糖、阳离子直链淀粉、阳离子支链淀粉、阳离子葡聚糖、阳离子木质素寡聚物、阳离子木质素聚合物、阳离子泥炭，或其混合物。
项3.根据项2的方法，其中阳离子聚合物和寡聚物具有0.5-5meq/g的阳离子电荷密度。
项4.根据项1的方法，其中阳离子化合物是选自铁(Fe)或铝(Al)的二价和三价阳离子以及碱土金属的元素阳离子离子。
项5.根据项4的方法，其中阳离子离子可以源自化合物，如AlCl3氯化铝、Ba(C2H3O2)2醋酸钡、Ba(HCO3)2碳酸氢钡、BaBr2溴化钡、BaCl2氯化钡、Ba(HCO2)2甲酸钡、(Ba(OH)2氢氧化钡)、Ba(NO3)2硝酸钡、Ca(C2H3O2)2醋酸钙、Ca(HCO3)2碳酸氢钡、CaBr2溴化钙、CaCl2氯化钙、Ca(HCO2)2甲酸钙、(Ca(OH)2氢氧化钙)、Ca(NO3)2硝酸钙、Mg(C2H3O2)2醋酸镁、Mg(HCO3)2碳酸氢镁、MgBr2溴化镁、MgCl2氯化镁、Mg(HCO2)2甲酸镁、(Mg(OH)2氢氧化镁)、Mg(NO3)2硝酸镁、Fe(C2H3O2)2醋酸铁、FeCl3氯化铁，以及相应的水合物。
项6.根据之前任一项的方法，其中阳离子化合物的含量为0.001-0.25g/g，基于第一液相的干物质含量。
项7.根据之前任一项的方法，其中将第二液相与第二固相分离，并且将第二液相再循环至步骤a)。
项8.根据之前任一项的方法，其中碱性脱木质化剂选自氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸钾、氢氧化钙和碳酸钙、氢氧化锂、碳酸锂、氢氧化铵、氨、硫化钠和相应的水合物。
项9.根据之前任一项的方法，其中脱木质化剂的浓度为0.1至10wt％-，更优选0.1-4wt-％，基于干物质基础的木质纤维素材料的含量。
项10.根据之前任一项的方法，其中将碱性脱木质化剂加入木质纤维素材料中，以获得具有高于7，优选在10和13之间的pH的悬浮液。
项11.根据之前任一项的方法，其中脱木质化处理在高于25℃的温度下进行，优选30至160℃。
项12.根据之前任一项的方法，其中在使木质纤维素材料接受步骤a)之前，使木质纤维素材料接受一种处理，在该处理中作为含水半纤维素水解产物从木质纤维素材料至少部分除去半纤维素。
项13.根据项12的方法，其中通过水热处理从木纤维素材料至少部分除去半纤维素。
项14：根据项12的方法，其中通过自水解处理从木质纤维素材料至少部分除去半纤维素。
项15.根据项12的方法，其中在步骤a)前，将从其除去至少部分半纤维素的木质纤维素材料接受蒸汽爆裂。
项16.根据项12的方法，其中至少部分含水半纤维素水解产物是酶促水解的，任选地通过在使混合物接受酶促水解处理之前，将半纤维素水解产物与第一固相混合。
项17.根据之前任一项的方法，其中酶促水解作为分批水解来进行。
项18.根据之前任一项的方法，其中酶促水解作为按序水解来进行。
项19.根据之前任一项的方法，其中酶促水解作为固体再循环水解来进行。
项20.根据之前任一项的方法，进一步包括浓度第三液相的步骤。
项21.根据之前任一项的方法可获得的酶促水解产物形式的液相。
项22.根据项20的方法可获得的浓缩糖水解产物。
项23.一种用于生产微生物脂质的方法，该方法包括
(i)提供包括项21的酶促水解产物或根据项22的浓缩糖水解产物形式的第三液相的培养基，
(ii)通过给培养基接种含油微生物接种来提供发酵肉汤，
(iii)温育接种了所述含油微生物的所述培养基，使脂质累积，
(iv)从所述含油微生物回收脂质。
项24.根据之前项的用于生产微生物脂质的方法，该方法包括
a)在碱性脱木质化剂的存在下，使木质纤维素材料接受脱木质化处理，以产生包括第一固相和含有溶解的木质素的第一液相的混合物，
b)将第一固相与第一液相分离，
c)将阳离子化合物引入到第一液相中，以产生包括第二固相和第二液相的混合物，
d)使第一固相接受酶促水解处理，以水解第一固相的半纤维素和纤维素级分，以产生包括第三液相和包括木质素的第三固相的混合物，
e)将第三液相与第三固相分离，
(i)提供包括步骤e)的酶促水解产物形式的第三液相的培养基，
(ii)通过给培养基接种含油微生物来提供发酵肉汤，
(iii)温育接种了所述含油微生物的所述培养基，允许脂质累积，
(iv)从所述含油微生物回收脂质。
项25.根据项23或24的方法，其中微生物选自酵母和丝状真菌。
项26.根据项23-25任一项的方法，其中在步骤a)之前，使木质纤维素材料接受处理，其中作为含水半纤维素水解产物从木质纤维素材料至少部分除去半纤维素。
项27.根据之前任一项的方法，其中将至少部分含水半纤维素水解产物与第一固相混合并接受酶促水解处理。
项28.根据项23-25任一项的方法，其中培养基包括至少部分第一液相。
实施例
通过以下非限制性实施例来说明本发明。本发明可以应用于实施例中说明的那些以外的其他木质纤维素原料。应当理解以上描述中和实施例中给出的实施方案只是用于说明的目的，并且各种变化和改变在本发明的范围内都是可能的。
实施例1
麦秆的自水解(使用预先调节的pH)
通过将20g预先碾碎通过1mm筛网的麦秆和180g水混合来制得悬浮液。用乙酸将悬浮液调节至pH4.5。将悬浮液转移至高压灭菌反应器中，然后用加热套非等温地加热至170℃至200℃之间的温度，使用持续搅拌。记录加热过程中的温度数据并用于计算自水解严重程度(等式1)。将反应器冷却至大约50℃，然后手动回收悬浮液，用于过滤。将液体级分与固体级分分离，并且使用HPLC测量液体级分中的糠醛和羟甲基糠醛(HMF)。在将寡聚和多聚的糖转化成单糖的稀酸水解后，测定液体级分中的糖的总浓度(g/l)。用水(0.5dm3)洗涤固体级分并压榨。将获得的固体残余物称重，取样测定干物质，并将固体残余物的产率(％)计算为固体残余物与自水解处理称重的麦秆的重量比(100％*g干麦秆/g干固体残余物)。使用Folin-Ciocalteu方法测定液体中的可溶性酚物质，使用guiaiacol作为标准品。
图15和图16中显示的结果概括了所述结果。固体残留物的产率随着自水解严重程度而降低，在最高严重程度下(Log(R0)＝4.4)具有67％产率(图15)。液体级分中的单糖糖浓度开始提高，然后随着递增的自水解严重程度而降低。自水解严重程度为Log(R0)＝3.8时，获得了最大糖浓度(23.1g/l)。超过这个自水解严重程度，液体级分中的糖浓度急剧降低，并且糠醛和HMF的浓度猛增，分别达到4.8g/l和0.3g/l的浓度。与糠醛和HMF的突然产生相反，可溶性酚的浓度随着递增的自水解严重程度从0.5g/l逐渐提高至2.0g/l。
这个实施例表明可以根据自水解严重程度(Log(R0))选择最佳的自水解条件，以避免糠醛、HMF和可溶性酚的过量形成，同时最大化液体级分中的单糖浓度。
实施例2
通过将33.8kg含有11％水分的切碎麦秆与350kg自来水混合制得具有8.5％稠度的悬浮液。将悬浮液加热至大约60℃，并通过在搅拌的Nutsche滤器中过滤，将液体级分与固体分离。将固体级分(31.2kg干物质)与水混合，获得192.4kg 5％稠度的悬浮液。将悬浮液加热至180℃，并冷却至室温，获得S＝4.15的严重程度。在沉降式离心机中，将固体级分与液体级分分离。固体级分用水洗涤，并且使用沉降式离心机回收洗过的不溶性级分“自水解的禾秆”(15.3kg干物质)，并储存在冰箱中。基于HPLC分析，液体级分(6.3kg干物质)含有大约干物质一半的半纤维素衍生的糖。
液体和固体级分的分离以及任选的固体级分的洗涤分离了自水解中从自水解的固体级分释放的酚物质和有机酸。因此，随后脱木质化步骤中消耗的碱脱木质化化学品协同地降低。
该实施例表明了自水解能够在进一步水解处理之前从木质纤维素材料分离半纤维素糖。从这个实施方案产生的固体级分随后用于脱木质化测试中，其形成具有低木质素和高碳水化合物含量的固体级分。
实施例3
通过将10.5kg 7.3％水分的磨碎禾秆和54.1kg自来水在100dm3容器中混合来制得悬浮液。在室温下储存18h后，称重64.2kg的悬浮液至水平圆柱250dm3搅拌高压灭菌反应器中。将反应器关闭并在75min内加热至140℃，在140℃下维持5h，并在30min内冷却至室温。从反应器中取出水热处理过的悬浮液，并且通过过滤分离液体和固体级分。固体级分用自来水洗涤并使用水压压榨。压榨过的固体级分(20.9kg)具有42.7％干物质含量。
从这个实验产生的固体级分随后用于脱木质化测试中，形成具有低木质素和高碳水化合物含量的固体级分。
自水解的禾秆的脱木质化
自水解的禾秆含有相当大含量的木质素，这在酶促水解中引起抑制作用。为此，在碱条件下提取来自自水解的固体材料，以在酶促水解之前出去木质素。
实施例4
通过将来自实施例2的20.5kg(8kg干物质)自水解的禾秆与262g颗粒NaOH和自来水在180dm3配备有搅拌装置的不锈钢反应器中混合来制备悬浮液。通过在30min内将反应器加热至95℃，接着在95℃下使用连续搅拌等温处理1h，来处理6.6％稠度的悬浮液。通过在离心机中的过来，从液体级分中分离出固体级分，用自来水洗涤，压榨，并将NaOH提取的AH-禾秆(23.64kg，27％干物质含量)储存在6℃。将含有1.62kg来自自水解禾秆的溶解材料的液体级分(“NaOH脱木质化溶液”)储存在6℃。
用35μl/g Flashzyme Plus(Roal Oy，芬兰)的酶剂量(这等于6FPU(滤纸单位)/gDM的纤维素酶活性)酶促水解NaOH提取的AH-禾秆从自水解禾秆碳水化合物获得了65.0％的糖产率。这与来自没有脱木质化的自水解禾秆碳水化合物的61.0％糖产率相比，是个提高的结果。
作为NaOH提取的AH-禾秆酶促水解中释放的单糖的总量与从相似重量的AH-禾秆在酸水解中释放的单糖的总量的比乘以来自脱木质化处理的NaOH提取的AH-禾秆的干物质产率来计算糖产率。
这个实施例表明了在酶促水解之前通过碱处理(NaOH)除去木质素时，酶促水解中相同的酶量产生了更高的糖产率。该实施例还表明了部分木质素溶解于碱液体级分中，并且可以通过沉淀回收木质素。
实施例5
通过将来自实施例2的自水解禾秆(403g，156g干物质)与4050g自来水和37.5g固体Na2CO3在配备有磁搅拌器的玻璃反应器中混合来制得3.6％稠度的悬浮液。将反应器在30min内加热至95-100℃并在95-100℃下使用悬浮液的持续搅拌处理4h。通过过滤从液体级分(3325g)中分离出812g具有15％干物质含量的Na2CO3提取的固体级分(“Na2CO3提取的AH-禾秆)”，用自来水洗涤，压榨并储存在6℃。固体级分的产率(脱木质化的禾秆的DM/自水解的禾秆的DM)为78％。液体级分(Na2CO3脱木质化溶液)具有pH9.8，并储存在6℃。所用的碳酸盐的含量高于NaOH，因为碳酸盐是比氢氧化物弱的碱。
用35μl/g Flashzyme Plus(Roal Oy，芬兰)的酶剂量(这等于6FPU(滤纸单位)/gDM的纤维素酶活性)酶促水解Na2CO3提取的AH-禾秆从自水解禾秆碳水化合物获得了59.1％的糖产率。这低于来自自水解禾秆的NaOH提取的AH-禾秆的65.0％糖产率或来自没有脱木质化的自水解禾秆碳水化合物的61.0％糖产率。
作为酶促水解中释放的单糖的总量与从相似重量的AH-禾秆在酸水解中释放的单糖的总量的比乘以来自脱木质化处理的Na2CO3提取的AH-禾秆的干物质产率来计算糖产率。
与接受没有脱木质化的酶促水解的自水解禾秆相比，Na2CO3脱木质化的优势在于获得了另外的木质素级分(Na2CO3脱木质化溶液)。
这个实施例表明了在酶促水解之前通过碱处理(Na2CO3)除去木质素时，酶促水解中相同的酶量产生了更高的糖产率。该实施例还表明了部分木质素溶解于碱液体级分中，并且可以通过沉淀回收木质素。
实施例6
通过将来自实施例3的10.0kg(4.41kg干物质)的自水解禾秆与自来水(29.5kg)和3.401g 50％(w/w)含水NaOH混合来制得悬浮液。按照以上实施例3中所述的，在相似的反应器和热条件下处理悬浮液。通过过滤分离固体级分(“NaOH-脱木质化禾秆”)，并且在洗涤后，具有30.4％干物质含量。液体级分(“NaOH-脱木质化溶液”)具有pH13.0并储存在6℃。
实施例7
该实施例的目的是研究自水解禾秆的碱处理对酶促水解以及来自自水解禾秆的糖产率的影响。为此，通过将15g来自实施例1的自水解禾秆的干物质与去离子水和表1中所列的化学品混合来制得7.5％稠度的悬浮液。在加热至所示值之前，使用不同的碱化学品来调节pH。将悬浮液在微波炉中快速加热至90℃。将热悬浮液过滤，以分离固体和液体级分。固体级分用水洗涤，并将滤饼搅拌至均质，并测量其干物质含量。用350μL(6FPU/g)水解纤维素制备物Flashzyme Plus(Roal，芬兰)在10％稠度下在pH5的0.05M醋酸钠缓冲液中在山梨酸钾的存在下水解洗过的固体级分(10g干物质)。在设定为50℃反应的恒温培养箱中的250mL圆锥烧瓶中进行水解，持续使用200rpm振荡72h。通过HPLC测定从液体级分释放的单糖。获得的干物质和糖产率呈现于表1中。
该实施例表明了自水解禾秆的脱木质化提高了通过酶促水解来自自水解禾秆的糖产率，即使是考虑脱木质化处理中的干物质损耗时。脱木质化处理的另一个优势是产生了适用于进一步加工的可溶性木质素级分。
该实施例令人惊讶的发现是在自水解禾秆的脱木质化中只需要少量的碱化学品。另一个令人惊讶的发现是从脱木质化固体级分分离的液体级分的pH相对低，这表示需要较低含量的酸来通过降低pH从溶液沉淀木质素。
实施例8
该实施例的目的是研究阳离子淀粉对从脱木质化液体沉淀木质素的作用，其中碱度是由NaOH引起的。在该实施例中，将来自实施例6的15g pH10NaOH木质素溶液(1.5％干物质含量)称重至玻璃试管中。将精确重量的阳离子淀粉“Raifix 25035”(Chemigate，芬兰)加入到试管中。将含有混合物的试管塞上橡胶软塞，振荡以混合成分，并且在室温下静置。根据添加的阳离子淀粉的含量，但通常在几分钟后，观察到混合物中的相分离。4h后，从在碱水中1:10稀释的混合物的上层相中取出0.1mL样品，在10000g下离心5min，并且从上清液测量280nm和600nm下的吸光度，使用碱水中的合适稀释。与未处理的木质素溶液的吸光度相比，计算280nm或600nm下的吸光度的降低百分比。上清液的吸光度的降低表明通过阳离子化合物(阳离子淀粉)从液体除去(沉淀)了木质素。
图5中的结果表明了阳离子淀粉用量对UV280nm吸光度或溶解物质的降低百分比的作用。阳离子淀粉的用量在0.2g/g至0.6g/g之间时，吸光度明显降低最多，所述含量是基于干物质给出的。24h温育后，滗掉液相并通过1级孔隙率玻璃烧结滤器。回收滤液，并且测试pH，显示为pH9.4至pH9.6之间的值，而对于未处理的溶液，为pH9.5。阳离子淀粉用量不是pH变化的原因，但相反，从初始pH10降低很可能是由于从空气中吸收了二氧化碳。比重和分光光度计分析关于观察到的最大沉淀都给出了相似的结果。
结果表明阳离子化合物，如阳离子淀粉，可以用于从碱脱木质化液体沉淀木质素，其中碱度由氢氧化物化合物引起，如NaOH，没有调节pH。
实施例9
这个实施例的目的是研究阳离子淀粉对从脱木质素液体沉淀木质素的作用，其中碱度是由Na2CO3引起的，替代NaOH。如上所述，用阳离子淀粉“Raifix 25035”处理来自实施例5的pH9.8的Na2CO3脱木质化溶液，但使用较低用量的阳离子淀粉。相对于从未处理的木质素溶液测量的吸光度，测量了4h温育后280nm下吸光度的降低。呈现于图6中的结果表明了阳离子淀粉用量之间递增的趋势和280nm下吸光度的降低。当阳离子淀粉相对于木质素溶液的干物质的用量为0.35g/g时，获得了280nm下吸光度高达79％的降低。
为了说明阳离子淀粉对木质素溶液的沉淀的作用，在图7中显示了8h反应时间后获得的试管的照片。与实施例8中24h反应后碱度的轻微降低相反，在该实验中观察到pH没有变化。
图7中显示的试管的视觉观察证实了木质素沉淀的定量结果。从图5和6中显示的结果，清楚阳离子淀粉“Raifix 25035”从脱木质化溶液沉淀高达80％的紫外光吸收物质。
该结果表明了阳离子化合物，如阳离子淀粉，可以用于从碱脱木质化液体沉淀木质素，其中碱度由碳酸盐化合物引起，如Na2CO3，没有调节pH。
实施例10
该实施例的目的是研究碱度对阳离子淀粉沉淀木质素的影响。通过6M硫酸将来自实施例6的NaOH脱木质化溶液酸化至pH5来获得非碱溶液。通过离心和过滤，将液体级分(“非碱液体”)与沉淀的固体分离。按照以上实施例9中所述的，用阳离子淀粉“Raifix25035”处理15g液体(6.3％干物质含量)，但阳离子淀粉的用量不同。相对于从未处理的木质素溶液测量的吸光度，测量了4h温育后280nm下吸光度的降低。图8中呈现的结果表明阳离子淀粉用量与总的溶解物质的比例为0.01g/g至0.07g/g时，280nm下的吸光度降低为8％至24％。值得注意的是pH5的非碱液体含有大量作为硫酸盐的溶解物质。为了进一步说明阳离子淀粉对非碱液体的作用，在图9中，显示了24h反应时间后的试管照片。
如图8中所示，补充阳离子淀粉“Raifix 25035”时，从pH5的非碱液获得了低程度的沉淀。因此，与从非碱溶液沉淀木质素相比，本发明获得了从碱溶液更有效的木质素沉淀。
实施例11
通过将100kg预先清洁的含有7％水分的麦秆与374kg具有6.4％干物质含量和pH12.8的碱脱木质化再循环溶液混合来制备悬浮液。将悬浮液接受70℃的温度和pH 12的脱木质化2小时。通过压滤，将提取的固体级分与液体级分分离，用水洗涤。NaOH提取的禾秆具有35％的干物质含量，并且其主要含有纤维素和木聚糖。
用1.2kg具有40％干物质含量的阳离子淀粉(Raifix 01035)处理液体级分(NaOH脱木质化溶液)，获得含有木质素的固体沉淀物和碱液级分。通过静置和离心，将沉淀物与碱液相分离，并将碱液再循环至脱木质化处理。
这个实施例表明了可以从预处理的木质纤维素材料有效地分离木质素，并且可以通过用阳离子化合物絮凝，从NaOH脱木质化溶液回收溶解的木质素。该实施例表明了通过阳离子化合物沉淀木质素并除去沉淀物后，可以将碱脱木质化液再循环。
实施例12
碱溶液中溶解的木质素的沉淀
用锤式粉碎机研磨麦秆，并将2.445kg部分浸没在46.615kg水中，形成49.060kg的总质量。通过771克50％NaOH溶液，使得混合物成为碱性。将悬浮液在200-L混合室中在60℃下使用100rpm混合4h。此后，将悬浮液在相同温度下过滤。获取具有2.8％干物质含量的碱上清液，用于随后的处理。
给上清液补充阳离子淀粉(Raifix 25035)至5％(w/w)浓度。分离所形成的沉淀，此后上清液的干重浓度为2.5％。
在另一个实验中，给具有2.8％干物质含量的上清液补充醋酸钙或CaCl2至2％Ca2+浓度，如按照上清液的干重计算的。分离沉淀物后，测定的干物质含量如表2和3中所示。
在再另一组实验中，首先如上所述用阳离子淀粉处理具有初始2.8％干物质含量的碱上清液，并且在除去沉淀物后，也如上所述，用钙盐处理上清液。结果显示于表2和3。
表2.通过醋酸钙和通过首先用阳离子淀粉接着用醋酸钙的连续处理从碱上清液沉淀木质素
Figure BDA0001012262140000401
表3.通过醋酸钙和通过首先用阳离子淀粉和然后用醋酸钙的连续处理从碱上清液沉淀木质素
Figure BDA0001012262140000402
该实施例表明了通过沉淀可以从碱溶液除去木质素，能够使用脱木质化上清液作为木质纤维素处理中的碱源。
关于自水解和/或脱木质化禾秆的酶促水解的实施例
实施例13
在三个不同的酶促水解过程中进行了NaOH-脱木质化禾秆(来自实施例6的材料)和自水解禾秆(来自实施例1的材料)的比较，所述酶促水解过程包括分批水解、按序水解和恒定过程给料下的固体再循环。使用了包括85％纤维素酶(Econase CE，Roal Oy)、10％纤维二糖酶(Novozyme 188，Sigma/Novozymes)和5％木聚糖酶(GC140，Genencor)的酶混合物。在pH5和50℃的温度下在200rpm振荡器中进行反应。
分批水解
对10％稠度和8％稠度(其中“稠度”是反应浆液中不溶性固体的比例，w/w)的NaOH脱木质化禾秆和自水解禾秆进行分批水解。使用含有9FPU/g预处理禾秆DM的酶活性的酶剂量。糖产率(作为材料中总的聚合碳水化合物的百分比的释放的无水糖)显示于图10中。24h、48h和72h水解后，来自8％和10％稠度的NaOH-脱木质化禾秆的糖产率平均为50％、65％和74％，而使用自水解禾秆，8％和10％稠度的产率分别平均为49％、56％和59％，表明使用相同的酶量，与自水解禾秆相比，从NaOH-脱木质化禾秆可以获得更高的糖产率。在较低稠度下，产率通常略高。
NaOH-脱木质化禾秆的48h和72h分批水解的图12中显示的测定容积效率分别为1.32g/l/h(糖克数/升反应浆液/小时)和0.82g/l/h，这与从自水解禾秆分别获得的0.74g/l/h和0.42g/l/h的测定容积效率相比，是相当地高。
图11中显示了反应的酶生产力(用一升酶获得的糖kg数)。NaOH脱木质化禾秆的72h分批水解中的酶生产力为4.2kg/l酶，其与自水解禾秆的2.2kg/l酶生产力相比，几乎是两倍。
这个实施例表明了在分批酶促水解中，与自水解禾秆相比，从脱木质化禾秆获得了较高的糖产率、酶生产力和测定容积效率。
按序水解
通过由三个按序24h反应组成的三步水解来水解NaOH脱木质化禾秆和自水解禾秆。在反应之间，将液体与固体分离，并将固体残余物与新鲜液体和酶混合。总的过程中的固体比例(“总稠度”或“给料稠度”)在头两个反应中为10％，在第三个反应中为8％。因为在反应之间分开总液体量液体，第一、第二和第三个反应的实际稠度，使用NaOH脱木质化禾秆分别为14.3％、12.5％和10.6％，使用自水解禾秆分别为14.4％、12.9％和12.8％。使用了“NaOH-脱木质化禾秆的分批水解”中描述的相似酶混合物和用量。在第一个反应中，使用了总酶用量的三分之二(66.6％)，在第二个反应中，使用了三分之一(33.3％)。
在第一个、第二个和第三个反应后的糖产率(作为材料中的总聚合碳水化合物的百分比释放的无水糖，图10)，从NaOH脱木质化禾秆的分别为35％、57％和70％，从自水解禾秆的分别为36％、55％和65％。尽管在第一个反应后，来自自水解禾秆的产率略高，但在第二个和第三个反应后，明显来自NaOH脱木质化禾秆的产率更高。两个和三个按序24h反应后，与来自自水解禾秆的分别为1.10g/l/h和0.94g/l/h的生产力相比，使用NaOH脱木质化禾秆的总测定容积效率(图12)分别为1.74g/l/h和1.61g/l/h。使用NaOH-脱木质化禾秆的三个24h反应后的酶生产力为4.4kg/l酶，与使用自水解禾秆的2.4kg/l的酶生产力相比，明显高得多(图11)。
这个实施例表明了在按序酶促水解中，与自水解禾秆相比，从脱木质化禾秆获得了更高的糖产率、酶生产力和测定容积效率。
使用固体再循环的水解
在固体再循环过程中水解NaOH脱木质化禾秆和自水解禾秆。进行了多个按序反应，其中以10％稠度混合新鲜预处理的禾秆、酶和液体。向新鲜反应组分的混合物中，混入50％从之前反应分离的固体残余物。固体残余物的再循环导致实际反应稠度的提高，使用NaOH-脱木质化禾秆，提高至12.3％，使用自水解禾秆，提高至13.2％。进行了六个按序再循环反应，以达到稳态，其中反应体积、稠度和水解产率在随后的反应中保持恒定。达到稳态时，将没有再循环的固体残余物的部分与恒定含量的新鲜液体混合，并进行另外24h反应，用NaOH脱木质化禾秆在10.5％稠度下进行，用自水解禾秆在13.1％稠度下进行。在单独的再循环反应中，总的固体比例(或“总稠度”或“给料稠度”)为10％，在包括再循环反应和另外反应的过程中，为8％。
在不含任何再循环材料的初始反应中作为总聚合碳水化合物百分比释放的无水糖的糖含量(图10)，对于NaOH脱木质化禾秆和自水解禾秆分别为51％和50％。使用50％再循环固体残余物的六个随后的反应后，使用NaOH-脱木质化禾秆和自水解禾秆的水解产率分别提高至57％和55％。在其他反应后，使用NaOH-脱木质化禾秆和自水解禾秆的总糖产率分别为69％和65％，因此对于NaOH脱木质化禾秆通常显示出更高的产卵量。使用NaOH-脱木质化禾秆和自水解禾秆的单独再循环反应的测定容积效率分别为1.99g/l/h和1.17g/l/h，而在包括另外的反应时，分别为1.77g/l/h和0.99g/l/h，表明使用NaOH-脱木质化禾秆明显更高的测定容积效率。使用NaOH-脱木质化禾秆和自水解禾秆的单独再循环反应的酶生产力分别为3.2kg/l和2.0kg/l，并且包括另外的反应时，分别为3.8kg/l和2.4kg/l，表明与自水解禾秆相比，NaOH脱木质化禾秆明显更高的酶生产力。
图13a中呈现了随后反应中的水解进展。反应体积的进展呈现于图13b中。反应稠度的进展呈现于图13c。
这个实施例表明了在使用固体再循环的酶促水解过程中，与自水解禾秆相比，从脱木质化禾秆获得了更高的糖产率、酶生产力和体积测定生产力。
实施例13的结论
1.在不同方法中，与自水解禾秆相比，NaOH-脱木质化禾秆的整体糖产率通常更高。
2.由于在不同方法中，与自水解禾秆相比，NaOH-脱木质化禾秆的测定容积效率较高，因此与自水解禾秆相比，在NaOH-脱木质化禾秆的水解中对于给定的糖生产速率需要较小的反应器和分离器。
3.由于在不同方法中，与自水解禾秆相比，NaOH-脱木质化禾秆的酶生产力较高，因此使用NaOH脱木质化禾秆，获得每kg糖的酶成本比使用自水解禾秆低。
4.在这个实施例中对每种预处理的禾秆使用了等量的水。可以推断与分批水解相比，固体再循环和按序水解导致相等的水解产率，但提高了测定容积效率。
实施例14
水解产物的制备
自水解液体C
进行麦秆的自水解反应和随后的半纤维素寡糖的分离，以产生用于发酵的液体级分，和易于酶促水解的固体级分。为此，将35.7kg禾秆(89.8％干物质含量)与240kg水混合，在500dm3搅拌罐反应器中获得11.6％稠度的悬浮液。将悬浮液加热至180℃，接着冷却至低于100℃。从反应器中放出水热处理过的悬浮液，并使用沉降式离心机，将第一液体级分与固体级分分离。将固体级分在用磷酸调节至pH4的酸性水中悬浮液洗涤。在沉降式离心机中，将固体级分与第二个液体级分分离。将第一个和第二个液体级分合并并在降膜蒸发器中浓缩，以获得18.3kg浓缩的自水解液体，形成含有部分寡聚形式的半纤维素糖以及具有42％干物质含量和38°Bx折射干物质的自水解液体C。将洗过的固体级分(96.7kg，具有23.0％干物质含量)用作用于酶促水解的给料材料，以产生用于培养的纤维素水解产物。
通过加入40g/l活性炭，在4℃下温和混合20小时，并且最终使用400um滤布滤掉活性炭，来除去自水解液体浓缩物中含有的部分酚化合物。
从含有来自其中制备自水解液体C的自水解实验的纤维素(洗涤后)的固体级分制备来自麦秆纤维素级分的酶促水解产物。将来自形成自水解液体C的自水解处理的洗过的固体级分(17.3kg，具有23.1％干物质含量)称重至40dm3搅拌罐反应器并与14.7kg水和10mL 50％NaOH(w/w)混合，获得12.5％稠度和pH5的悬浮液。将反应器加热并维持在50℃，加入216ml包括82％纤维素酶(Econase CE，Roal Oy)、10％纤维二糖酶(Novozyme 188，Sigma/Novozymes)和7％木聚糖酶(GC140，Genencor)的酶混合物。在酶处理过程中，每小时周期性地将悬浮液搅拌三次，持续5分钟。48h停留时间后，给悬浮液补充占据10％初始酶用量并且具有相似比例的单独酶的新鲜酶混合物。在50℃下72h停留时间后，使用水压机通过过滤，将液体级分与固体级分分离。用水洗涤固体级分一次并且再次将液体级分与固体级分分离。将液体级分分离并通过在减压下蒸发来浓缩。纤维素水解产物浓缩物(1.57kg)含有220g/l总糖。
将含有单体糖的纤维素水解产物按原样用于培养中。
单细胞油生产
使用脂质生产真菌株米曲霉进行实验。通过加入12ml无菌水并用接种环将孢子刮入液体中，从而从PDA平板上生长的形成孢子的真菌制得孢子悬浮液。将24ml孢子悬浮液直接用于发酵罐接种。培养基组成呈现于表4中。将来自同一实验的纯化的自水解液体C(半纤维素溶液，半纤维素糖)和纤维素水解产物用于培养中。培养在Biostat B plus 5l发酵罐中的3l体积中进行，并且在此期间，将搅拌设定为500rpm，用3M NaOH将pH保持在5,5，生长过程中的通风是1vvm并且温度是35℃，在脂质生产中，降至28℃。
表4：生长培养基的组成
培养基组分 浓度(g/l)
半纤维素糖 20
酵母提取物 2
(NH4)2SO4 1,5
MgCl*6H2O 1,5
K2HPO4 0,8
KH2PO4 1,5
CaCl2*2H2O 0,3
接种后，在真菌开始有活力地生长前，花费了约30h。在培养过程中，以小批量加入半纤维素溶液，并且在培养95h后，将给料变成纤维素水解产物。在培养过程中，添加了总共236g半纤维素和484g纤维素水解产物。添加的部分糖在发酵结束时保持未被利用。在167h时，结束培养时，存在16g/l生物质，其中43％是脂质(图14)。可以推断从麦秆半纤维素和纤维素糖生产微生物油是成功的。
实施例15-依靠半纤维素糖生产微生物油
水解产物，自水解液体D的制备
通过将10.5kg磨碎的麦秆(92.7％干物质含量)和54.1kg自来水在100dm3容器中混合来制得悬浮液。在室温下搅拌18h后，将64.2kg悬浮液称重至水平圆柱状250dm3搅拌的高压反应器中。关闭反应器并在75min内加热至140℃,并在140℃下维持5h，并在30min内冷却至室温。从反应器中手动放出水热处理过的悬浮液，并且通过过滤，将第一个液体级分与第一个固体分离。第一个固体级分用自来水洗涤两次并使用水压压榨，获得洗过的固体级分。洗过的固体级分(20.9kg)具有42.7％干物质含量。将第一个液体级分与洗涤水混合，并在降膜蒸发器中浓缩至11.5％(w/w)干物质含量。浓缩的液体，自水解液体D，含有来自浓缩液体的总干物质的49.3％总糖，如稀酸水解(4％w/w硫酸，121℃，1h)后通过高性能液相色谱(HPLC)测定的。总糖含硫量的无水木糖、无水***糖、无水葡萄糖和无水半乳糖的相对比例分别为57％、19％、13％和11％。
此后，将含有部分寡聚形式的半纤维素糖的自水解液体D按原样用于培养实验中，没有纯化。
单细胞油生产
使用脂质生产真菌株米曲霉进行了实验。通过加入12ml无菌水并用接种环将孢子刮入液体中，从而从PDA平板上生长的形成孢子的真菌制得孢子悬浮液。将24ml孢子悬浮液用于6个***接种。培养基组成呈现于表5中。将接种的烧瓶在30℃下160rpm振荡温育1天，然后用于发酵罐接种。
表5：接种培养基的组成，pH设为5,5
g/l
半纤维素糖 40
酵母提取物 1
(NH4)2SO4 1
MgSO4*7H2O 1
K2HPO4 0,5
KH2PO4 1
CaCl2*2H2O 0,2
使用自水解液体D(含有部分寡聚形式的半纤维素糖)并且其含有4,2g/l酚化合物，基于使用Folin-Ciocalteu方法的分析(Waterhouse，2002)。在Biostat B plus 5l发酵罐中的3l体积中进行培养，并且在此期间，将搅拌设定为400rpm，用3M NaOH，将pH保持在5,5，通气为1vvm，而温度为30℃。培养基组成呈现于表6中。
表6：发酵培养基的组成
培养基组分 浓度(g/l)
半纤维素糖 60
酵母提取物 1
(NH4)2SO4 1
MgCl*6H2O 1,0
K2HPO4 0,5
KH2PO4 1,0
CaCl2*2H2O 0,2
结果：
在培养过程中，以小批量加入半纤维素溶液。总共加入150g半纤维素。在发酵结束时，部分糖保持未被利用。在142h，培养结束时，存在14g/l生物质，其中21％为脂质。可以推断从小麦半纤维素糖(部分是寡聚形式的)生产微生物油是成功的。从半纤维素糖生产微生物油是成功的，没有纯化水解产物(除了在糖浓缩中使用了蒸发)。在发酵中，酚化合物的浓度为2,8g/L。
因此，还可以声明尽管高抑制剂浓度，但真菌生长和脂质生产是可能的。

Claims (10)

1.用于木质纤维素材料分级的方法，所述方法包括:
a)在碱性脱木质化剂的存在下，使木质纤维素材料接受脱木质化处理，以产生包括第一固相和含有溶解的木质素的第一液相的混合物，其中将碱性脱木质化剂加入到木质纤维素材料中，以获得具有高于7的pH的悬浮液，
b)将第一固相与第一液相分离，
c)在引入阳离子化合物之前不改变第一液相的pH而将阳离子化合物引入第一液相中，以产生包括第二固相和第二液相的混合物，其中将第二液相与第二固相分离并将第二液相再循环至步骤a)，
d)在能够水解第一固相的半纤维素和纤维素级分的酶的存在下，使第一固相接受酶促水解处理，以产生包括酶促水解产物形式的第三液相和第三固相的混合物，
e)将第三液相与第三固相分离，
并且其中阳离子化合物是阳离子聚合物和寡聚物，
其中阳离子聚合物和寡聚物选自阳离子淀粉、阳离子葡聚糖、阳离子木质素聚合物或阳离子泥炭，或其混合物；
或者
其中阳离子化合物是选自铁(Fe)或铝(Al)的二价和三价阳离子以及碱土金属的元素阳离子的化合物，
其中阳离子离子源自选自下列的化合物：AlCl3氯化铝、Ba(C2H3O2)2醋酸钡、Ba(HCO3)2碳酸氢钡、BaBr2溴化钡、BaCl2氯化钡、Ba(HCO2)2甲酸钡、Ba(OH)2氢氧化钡、Ba(NO3)2硝酸钡、Ca(C2H3O2)2醋酸钙、Ca(HCO3)2碳酸氢钙、CaBr2溴化钙、CaCl2氯化钙、Ca(HCO2)2甲酸钙、Ca(OH)2氢氧化钙、Ca(NO3)2硝酸钙、Mg(C2H3O2)2醋酸镁、Mg(HCO3)2碳酸氢镁、MgBr2溴化镁、MgCl2氯化镁、Mg(HCO2)2甲酸镁、Mg(OH)2氢氧化镁、Mg(NO3)2硝酸镁、Fe(C2H3O2)2醋酸亚铁、FeCl3氯化铁、以及相应的水合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中阳离子聚合物和寡聚物具有0.5-5meq/g的阳离子电荷密度。
3.根据权利要求1所述的方法，其中基于第一液相的干物质含量，阳离子化合物的量为0.001-0.25g/g。
4.根据权利要求1所述的方法，其中碱性脱木质化剂选自氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸钾、氢氧化钙和碳酸钙、氢氧化锂、碳酸锂、氢氧化铵、氨、硫化钠和相应的水合物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中基于以干物质计的木质纤维素材料的量，脱木质化剂的浓度为0.1至10wt％。
6.根据权利要求5所述的方法，其中基于以干物质计的木质纤维素材料的量，脱木质化剂的浓度为0.1至4wt％。
7.根据权利要求1所述的方法，其中将碱性脱木质化剂加入到木质纤维素材料中，以获得具有在10和13之间的pH的悬浮液。
8.根据权利要求1所述的方法，其中在使木质纤维素材料接受步骤a)之前，使木质纤维素材料接受一种处理，在所述处理中作为含水半纤维素水解产物从木质纤维素材料至少部分除去半纤维素。
9.根据权利要求8所述的方法，其中通过水热处理从木质纤维素材料至少部分除去半纤维素。
10.根据权利要求1所述的方法，其中阳离子聚合物和寡聚物选自阳离子直链淀粉、阳离子支链淀粉或阳离子木质素寡聚物。
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