CN106232127A - 眼疾病治疗剂、其筛选方法或伴随视网膜色素上皮细胞移植的排斥反应的预测方法 - Google Patents

眼疾病治疗剂、其筛选方法或伴随视网膜色素上皮细胞移植的排斥反应的预测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供眼疾病治疗剂、及眼疾病治疗剂的筛选方法等。另外，本发明提供针对眼疾病患者的视网膜色素上皮细胞移植伴随的免疫排斥反应的预测方法。

Description

眼疾病治疗剂、其筛选方法或伴随视网膜色素上皮细胞移植 的排斥反应的预测方法
技术领域
本发明涉及眼疾病治疗剂、其筛选方法及伴随视网膜色素上皮细胞移植的排斥反应的预测方法。
背景技术
已知主要组织相容性抗原(MHC)在人类中作为HLA(Human leukocyte antigen：人类白细胞抗原)在大部分的细胞、组织中表达。HLA主要包括A、B、C、DR、DQ、DP 6个基因座抗原，进一步分别由数十种不同类型(等位基因)的复杂组合构成，其组合存在数万种。HLA在人的体内作为重要的免疫机构，其主要功能为用于进行自他识别的抗原提呈。如果向他人移植了自己以外的细胞/组织的情况下(异体移植)，该HLA作为最重要的抗原(异物)被T细胞等免疫相关细胞所识别，排斥成立而使移植物不能植活。
在通常的脏器移植，特别是骨髓移植中，原则上认为需要使作为HLA的各抗原的A、B、C、DR、DQ、DP 6个基因座抗原全部一致，据说在不能一致时存在产生严重的排斥反应的风险，另外，移植后的预后也较差。
已知视网膜色素上皮细胞会表达、产生抑制向眼内浸润的炎症细胞(Th1细胞、CD8阳性细胞、巨噬细胞、B细胞等)的分子，相对于同种的自体炎症性细胞提供抑制信号(例如：非专利文献1、2)。已知一方面，在相同的条件下，视网膜色素上皮细胞对调节性T细胞提供促进的信号(非专利文献3，4)。另一方面，已知视网膜色素上皮细胞也抑制异种T细胞(Th22细胞)(非专利文献5)，视网膜色素上皮细胞自体存在免疫抑制功能，由此，视网膜色素上皮细胞周边的环境存在免疫反应受到抑制的趋势。另外，已知将利用IFN-γ或巨噬细胞进行了前处理的人视网膜色素上皮细胞与同种异体T细胞进行共培养时，由IL-2等的产生升高导致T细胞的活化(非专利文献6)。另外，已知IFN-γ在MHC类II分子的表达中实现重要的功能(非专利文献7)。然而，目前为止尚无在使用视网膜色素上皮细胞(以下记为“RPE细胞”)的针对视网膜疾病患者的移植中考虑了HLA匹配的同种异体移植策略。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Sugita S et al,J Immunol.2004,172:4184-4194.
非专利文献2：Sugita S et al,J Immunol.2006,176:118-127.
非专利文献3：Sugita S et al,J Immunol,2008,181:7525-7536.
非专利文献4：Sugita S et al,J Immunol,2009,183:5013-5022.
非专利文献5：Sugita S et al,IOVS,2013,vol.54,No.10:6926-6933.
非专利文献6：Enzmann V et al.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol.2001Jul；239(6):445-51
非专利文献7：Enzmann V.Transplant Immunology 7:9-14,1999
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供眼疾病治疗剂及眼疾病治疗剂的筛选方法等。进一步本发明的其他目的在于，提供针对眼疾病患者的视网膜色素上皮细胞移植伴随的免疫排斥反应的预测方法。
解决问题的方法
本发明人等得到了如下见解：通过获得从多名受试者得到的T细胞、源自iPS细胞的视网膜色素上皮(RPE)细胞，进行了HLA分型的基础上，将上述T细胞与RPE细胞进行接触培养，从而测定了从T细胞产生的细胞因子浓度，结果在上述T细胞的HLA-A、HLA-B、HLA-DR的3个基因座的等位基因，与HLA-A、HLA-B、HLA-DR的3个基因座的基因型分别为纯合的基因型的视网膜色素上皮细胞的各基因座中的等位基因一致的情况下，细胞因子浓度与T细胞单独的情况相同，或比其降低。
本发明人基于这些见解进一步反复研究，结果完成了本发明。
即，本发明涉及以下内容。
[1]眼疾病治疗剂，所述眼疾病治疗剂含有视网膜色素上皮细胞并用于眼疾病患者，其中，所述视网膜色素上皮细胞在HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座的基因型分别为纯合的基因型，所述眼疾病患者具有在相应的基因座中至少一个等位基因与所述视网膜色素上皮细胞的所述基因座中的等位基因一致的组合。
[2]根据[1]所述的药剂，其抑制移植后的免疫排斥反应。
[3]根据[1]或[2]所述的药剂，其中，所述视网膜色素上皮细胞源自多功能性干细胞。
[4]根据[3]所述的药剂，其中，所述多功能性干细胞为iPS细胞。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的药剂，其中，所述眼疾病为视网膜变性或伴随视网膜变性的疾病。
[6]选择相对于眼疾病患者的眼疾病治疗剂的方法，其包括以下工序：
(i)检查源自患者的T细胞的HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座的基因型的工序，
(ii)选择具有与工序(i)中判明的各基因座中的等位基因一致的等位基因的视网膜色素上皮细胞的工序。
[7]根据[6]所述的方法，其中，工序(ii)中，所述视网膜色素上皮细胞具有的HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座的基因型分别为纯合的基因型。
[8]选择针对眼疾病患者的眼疾病治疗剂的方法，其包括以下工序：
(1)将源自患者的T细胞，与视网膜色素上皮细胞进行接触培养的工序，
(2)测定工序(1)的培养上清液中分泌的炎性细胞因子浓度的工序，及
(3)在工序(2)中的炎性细胞因子浓度与单独培养源自患者的T细胞的培养上清液中的炎性细胞因子浓度为同水平、或者其以下的情况下，判定该视网膜色素上皮细胞可用作针对该患者的眼疾病治疗剂的有效成分的工序。
[9]根据[8]所述的方法，其中，所述视网膜色素上皮细胞具有的HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座的基因型分别为纯合的基因型。
[10]根据[8]或[9]所述的方法，其包括用抗CD3抗体使工序(1)中源自患者的T细胞活化。
[11]根据[8]～[10]中任一项所述的方法，其中，工序(1)中源自患者的T细胞为CD4阳性，工序(2)中测定的炎性细胞因子为IFN-γ。
[12]根据[8]～[10]中任一项所述的方法，其中，工序(1)中源自患者的T细胞为CD8阳性，工序(2)中测定的炎性细胞因子为粒酶B。
[13]试验方法，其用于预测移植移植用视网膜色素上皮细胞的眼疾病患者的排斥反应，其包括以下工序：
(A)将源自患者的T细胞与该视网膜色素上皮细胞进行接触培养的工序，
(B)测定工序(A)的培养上清液中分泌的炎性细胞因子浓度的工序，及
(C)在工序(B)中的炎性细胞因子浓度显著高于单独培养的源自患者的T细胞的培养上清液中炎性细胞因子浓度的情况下，判定相对于该视网膜色素上皮细胞产生排斥反应的工序。
[14]根据[13]所述的方法，该移植用视网膜色素上皮细胞具有的HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座的基因型分别为纯合的基因型。
[15]根据[13]或[14]所述的方法，其包括用抗CD3抗体使工序(A)中的源自患者的T细胞活化。
[16]根据[13]～[15]中任一项所述的方法，其中，工序(A)中源自患者的T细胞为CD4阳性，工序(B)中测定的炎性细胞因子为IFN-γ。
[17]根据[13]～[15]中任一项所述的方法，其中，工序(A)中源自患者的T细胞为CD8阳性，工序(B)中测定的炎性细胞因子为粒酶B。
[18]眼疾病的治疗方法，其包括将HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座的基因型分别为纯合的基因型的视网膜色素上皮细胞制成片状(sheet)，移植至眼疾病患者，所述眼疾病患者具有在相应的基因座中至少一个等位基因与该视网膜色素上皮细胞的该基因座中的等位基因一致的组合。
[19]根据[18]所述的方法，其中，所述视网膜色素上皮细胞源自多功能性干细胞。
[20]根据[19]所述的方法，其中，所述多功能性干细胞为iPS细胞。
[21]根据[18]～[20]中任一项所述的方法，其中，所述眼疾病为视网膜变性或伴随视网膜变性的疾病。
[22]视网膜色素上皮细胞，其用于治疗眼疾病患者的眼疾病，其中，所述视网膜色素上皮细胞在HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座的基因型分别为纯合的基因型，所述眼疾病患者具有在相应的基因座中至少一个等位基因与所述视网膜色素上皮细胞的所述基因座中的等位基因一致的组合。
[23]根据[22]所述的视网膜色素上皮细胞，其中，所述视网膜色素上皮细胞源自多功能性干细胞。
[24]根据[23]所述的视网膜色素上皮细胞，其中，所述多功能性干细胞为iPS细胞。
[25]根据[22]～[24]中任一项所述的视网膜色素上皮细胞，其中，所述眼疾病为视网膜变性或伴随视网膜变性的疾病。
[26]视网膜色素上皮细胞，其用于制造眼疾病患者的眼疾病的治疗剂，其中，所述视网膜色素上皮细胞在HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座的基因型分别为纯合的基因型，所述眼疾病患者具有在相应的基因座中至少一个等位基因与所述视网膜色素上皮细胞的所述基因座中的等位基因一致的组合。
[27]根据[26]所述的视网膜色素上皮细胞，其中，所述视网膜色素上皮细胞源自多功能性干细胞。
[28]根据[27]所述的视网膜色素上皮细胞，其中，所述多功能性干细胞为iPS细胞。
[29]根据[26]～[28]中任一项所述的视网膜色素上皮细胞，其中，所述眼疾病为视网膜变性或伴随视网膜变性的疾病。
发明的效果
在传统的异体移植中，要求供体和接受者的HLA型尽可能地一致。特别是在骨髓移植中，认为必须使已知作为HLA型的6个基因座抗原的等位基因全部匹配。然而，根据本发明，在RPE细胞移植中，供体侧的HLA-A、HLA-B及HLA-DR的3个基因座的基因型为纯合的基因型的情况下，仅将接受者的HLA基因座的其中一个为匹配即能够抑制排斥反应。因此，可以通过事前从患者采血来辨别、选择免疫学上不适合的移植细胞，因此，可以通过避免不适合的细胞的移植来减轻患者的负担。能够将通过该方法选择的RPE细胞用于移植。
另外，通过将本发明用于判定免疫抑制剂的需要与否，有助于治疗方针的选择。因而本发明有助于显著提高基于异体移植的治疗效率，而且也发挥削减不适合移植的细胞的制备成本等效果。
或者可以将HLA-A、HLA-B及HLA-DR的3个基因座的基因型为纯合的基因型的RPE细胞，用作具有在这3个基因座中至少一个等位基因与该视网膜色素上皮细胞的等位基因一致的组合的患者用的眼疾病治疗剂。
附图说明
[图1]显示在将CD4阳性T细胞悬浮液(TLHD-1、TLHD-2)与源自454E2-iPS的RPE细胞进行共培养的情况下，培养上清液中的IFN-γ的浓度。
[图2]显示将CD4阳性T细胞悬浮液(TLHD-2、TLHD-3、TLHD-4、TLHD-6、TLHD-7、TLHD-8、TLHD-9)与源自454E2-iPS的RPE细胞进行共培养的情况下，以及将源自TLHD-1的T细胞悬浮液及源自TLHD-1的iPS细胞的RPE细胞进行共培养的情况下，培养上清液中的IFN-γ的浓度。
[图3]显示将CD4阳性T细胞悬浮液(TLHD-1)与各种RPE细胞(表2中No.1～3、6～10)或小鼠成纤维细胞(mouse fibroblast)进行共培养的情况下，培养上清液中的IFN-γ的浓度。
[图4]显示将CD4阳性T细胞悬浮液(TLHD-1、TLHD-8、TLHD-14、TLHD-21)与源自453F2-iPS的RPE细胞进行共培养的情况下，培养上清液中的IFN-γ的浓度。
[图5]显示将CD8阳性T细胞悬浮液(TLHD-1、TLHD-8、TLHD-14、TLHD-22)与源自453F2-iPS的RPE细胞进行共培养的情况下，培养上清液中的粒酶-B的浓度。
[图6]利用FACS显示将CD4阳性T细胞悬浮液(TLHD-1)与源自454E2-iPS的RPE细胞进行共培养的情况下，产生IL-2、IFN-γ、IL-17、TNF-α、IL-22的CD4阳性T细胞的比例。
[图7]显示将CD4阳性T细胞悬浮液(TLHD-1、TLHD-10)与源自454E2-iPS的RPE细胞进行共培养的情况下，各种细胞因子的产生量。
[图8]利用FACS显示将CD8阳性T细胞悬浮液(TLHD-1)与源自454E2-iPS的RPE细胞进行共培养的情况下，产生粒酶B(Granzyme B)、穿孔素(Perforin)、TNF-α的CD8阳性T细胞的比例。
[图9]显示了在将CD8阳性T细胞悬浮液(TLHD-1、TLHD-3)与源自454E2-iPS的RPE细胞进行共培养的情况下，培养上清液中的粒酶B的浓度。
[图10]显示了将CD8阳性T细胞悬浮液(TLHD-2、4、5、8、10、12、13、14、16、17、18、19、20)与源自454E2-iPS的RPE细胞进行共培养的情况下，培养上清液中的粒酶B的浓度。
具体实施方式
本发明提供一种眼疾病治疗剂，该眼疾病治疗剂(以下，称为“本发明的治疗剂”)含有视网膜色素上皮细胞并用于眼疾病患者，所述视网膜色素上皮细胞在HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座的基因型分别为纯合的基因型，所述眼疾病患者具有在相应的基因座中至少一个等位基因与该视网膜色素上皮细胞的该基因座中的等位基因一致的组合。
本发明的治疗剂含有视网膜色素上皮细胞。在本发明中，“视网膜色素上皮细胞”是指构成视网膜色素上皮的上皮细胞、及其前体细胞。是否为视网膜色素上皮细胞，可以根据例如：细胞标记(RPE65、CRALBP、MERTK、BEST1等)的表达、细胞的形态(细胞内的黑色素沉积、多边形而扁平状的细胞形态、多边形的肌动蛋白束的形成等)等进行确认。另外，视网膜色素上皮细胞的前体细胞是指，定向于向视网膜色素上皮细胞的诱导分化的细胞，对于是否为该前体细胞，可以根据细胞标记(Mitf、Pax6、Rx、Crx等)的表达等进行确认。另外，视网膜色素上皮细胞的功能评价，可以通过例如细胞因子(VEGF、PEDF等)的分泌能力、吞噬能力等指标进行确认。对这些功能评价及确认操作而言，如果是本领域技术人员，可以设定适当条件进行实施。
另外，就本发明中的视网膜色素上皮细胞而言，可以使用例如源自哺乳动物的视网膜色素上皮细胞。作为哺乳动物，可列举例如：小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、犬、绵羊、猪、牛、马、山羊、猴、人。在以向人的移植等作为目的而制造视网膜色素上皮细胞的情况等下，优选使用人视网膜色素上皮细胞。
对上述“视网膜色素上皮细胞”而言，可以为直接提取的原代细胞，或者，为将它们进行几代传代所得的细胞。原代视网膜色素上皮细胞可以通过公知的方法进行分离，例如：对于视网膜色素上皮细胞而言，可以将尸体眼球摘出之后，迅速地在赤道部分割眼球，除去晶状体和视网膜之后，根据需要而利用胶原酶、透明质酸酶等进行处理，利用细胞刮刀进行摩擦或通过胰蛋白酶、EDTA溶液使细胞从Bruch膜游离并回收，之后通过在培养液中静置而诱导粘附于培养皿、增殖，从而增殖必要量的细胞，利用胰蛋白酶处理等进行适当传代，确保细胞数量。
进一步，上述“视网膜色素上皮细胞”也可以为通过对包括多功能性干细胞、神经干细胞等体干细胞的干细胞，或者包括神经前体细胞、视网膜前体细胞的前体细胞进行诱导分化而得到的细胞，优选为对多功能性干细胞进行诱导分化而得到的细胞。
就本发明中的“多功能性干细胞”而言，是指具有自我复制能力和分化多能性的干细胞，没有特别的限定，广泛利用例如：胚胎干细胞(ES细胞)、iPS细胞(人工多功能性干细胞)等。优选为利用人ES细胞或人iPS细胞，更优选为利用人iPS细胞。
本发明中的“iPS细胞”是指，通过使核重编程因子与体细胞(例如成纤维细胞、皮肤细胞、淋巴细胞等)进行接触，人为地获得了自我复制能力及分化多能性的细胞。对iPS细胞而言，最初为通过向体细胞(例如成纤维细胞、皮肤细胞等)导入包括Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc的核重编程因子的方法发现的(Cell,126:p.663-676,2006)。随后，通过众多研究者针对重编程因子的组合、因子的导入法发展了各种改良，报告了多种诱导多功能性干细胞的制造法，但对本发明中的iPS细胞的制造法，没有特别的限定。
本发明中的“视网膜色素上皮细胞”，优选HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座的基因型分别为纯合的基因型。基因型为纯合的基因型是指，2个等位基因彼此为具有同一碱基序列的基因。在后述实施例中，对从受试者提取的T细胞及iPS细胞进行诱导分化而得到的视网膜色素上皮细胞进行共培养，结果发现，相对于HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座的基因型分别为纯合的基因型的视网膜色素上皮细胞，具有在相应的基因座中至少一个等位基因与该视网膜色素上皮细胞的该基因座中的等位基因一致的组合的T细胞，细胞因子的产生与对照(只有T细胞的情况)为相同水平，或者令人吃惊地进行抑制。
目前，已知视网膜色素上皮细胞表达对以T细胞为首的炎症性细胞进行抑制的分子，且对于调节性T细胞提供促进的信号。然而，这些大多是相对于同种的自体细胞的结果(例如：背景技术的非专利文献1～4)。一方面，虽然发明人们也报告了视网膜色素上皮细胞可抑制异种T细胞(例如：背景技术的非专利文献5)，但这只不过仅仅是视网膜色素上皮细胞本身的功能而已。实际上，在异种移植中急性排斥反应成为了较大的问题，由于视网膜色素上皮细胞不进行抗原提呈，因此，这些来自发明人们的报告对本发明不存在任何提示。
综上所述，在视网膜色素上皮细胞移植中供体侧的HLA-A、HLA-B及HLA-DR的3个基因座的基因型为纯合的基因型的情况下，可以实现能够仅接受者的HLA基因座的其中一个等位基因的匹配而抑制排斥反应，对需要移植视网膜色素上皮的眼疾病患者迅速地供给移植用细胞。本发明发现：在同种异体(allogeneic，アロ)的视网膜色素上皮细胞移植中，供体侧的HLA-A、HLA-B及HLA-DR的3个基因座的基因型为纯合的基因型的情况下，可以仅接受者的HLA基因座的其中一个为匹配而抑制排斥反应，并因此而完成了本发明，该发现具有较大的意义。另外，本发明的最终目的为尽可能地抑制在视网膜色素上皮细胞的异体移植中产生的免疫排斥反应。从此观点考虑，对作为本发明中的给予眼疾病患者的眼疾病治疗剂的有效成分的视网膜色素上皮细胞而言，所述视网膜色素上皮细胞HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座的基因型分别为纯合的基因型，并为同种异体细胞，从在该基因座的基因型为纯合的基因型的各种视网膜色素上皮细胞中，选择适于该患者的视网膜色素上皮细胞。
对从眼疾病患者获得的T细胞的HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座的基因型而言，可以通过公知的方法进行检查，例如，可以如后述实施例那样，通过实施HLA分型而容易地确定。另外，本发明的药剂所使用的视网膜色素上皮细胞的各基因座的基因型，可以利用同样的方法进行检查，但优选为以下使用法：预先储备各基因座的基因型为纯合的基因型、且具体的等位基因也判明了的各种视网膜色素上皮细胞，并从其中选择对于眼疾病患者适当的细胞。
作为可以适用本发明的治疗剂的眼疾病，可列举视网膜变性或伴随视网膜变性的疾病。作为视网膜变性或伴随视网膜变性的疾病，可列举例如：年龄相关性黄斑变性疾病、视网膜色素变性症、糖尿病性视网膜症、及视网膜脱落等视网膜变性疾病。
可以适用本发明的治疗剂的眼疾病患者，优选为相对于本发明的治疗剂中包含的视网膜色素上皮细胞在HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座中作为纯合的基因型保持的等位基因，具有在相应的基因座中至少一个等位基因一致的组合的眼疾病患者。
对可以适用本发明的治疗剂的眼疾病部位的范围而言，依赖于对象疾病、给予对象的动物种类、年龄、性别、体重、病情等进行适当选择。
作为本发明的治疗剂的使用方法，可以为例如制成片状进行移植。将视网膜色素上皮细胞进行片状化的方法是公知的，例如，记载于WO2012/115244中。视网膜色素上皮细胞片可以一次或者分成多次进行移植。对移植的适用次数而言，根据疾病而遵从医疗工作者、指导方针进行确定，例如在疾病为年龄相关性黄斑变性疾病的情况下，也可以根据其危重度将移植用细胞片进行2次以上移植。另外，进行多次移植的情况下，对间隔没有特别的限定，但也可以隔着数日～数周的期间。或者，本发明的治疗剂也可以以细胞被分散的状态直接移植至对象的部位。移植的适用次数与片状的情况相同，遵从指导方针等进行确定，移植期间等也与片状的情况相同地进行适当确定。
本发明另外提供，选择相对于眼疾病患者的眼疾病治疗剂的方法。
具体而言，本发明的选择眼疾病治疗剂的方法(以下，称为“本发明的方法(1)”)包括以下工序：
(i)检查源自患者的T细胞的HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座的基因型的工序，
(ii)选择具有与利用工序(i)判明的各基因座中的等位基因一致的等位基因的视网膜色素上皮细胞的工序。
本发明的方法(1)的工序(i)中，对从眼疾病患者获得的T细胞的HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座的基因型而言，可以利用公知的方法进行检查，例如，可以如后述实施例那样，通过实施HLA分型容易地确定。本发明的方法(1)中的作为T细胞的来源的患者的眼疾病，可以与作为本发明的治疗剂的适用对象的眼疾病相同。
对本发明的方法(1)的工序(ii)中选择的、具有与利用上述工序(i)判明的各基因座中的等位基因一致的等位基因的视网膜色素上皮细胞而言，作为被眼疾病患者采用时不产生排斥反应的眼疾病治疗剂有用。另外，对在本发明的方法(1)中，视网膜色素上皮细胞具有的HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座的基因型而言，优选为各自为纯合的基因型。本发明的方法(1)中的视网膜色素上皮细胞的制备，可以与本发明的治疗剂中包含的视网膜色素上皮细胞的制备相同。
本发明另外提供，其他的针对眼疾病患者而选择眼疾病治疗剂的方法。
具体而言，本发明的选择眼疾病治疗剂的方法(以下，称为“本发明的方法(2)”)包括以下工序：
(1)将源自患者的T细胞，与视网膜色素上皮细胞进行接触培养的工序，
(2)测定工序(1)的培养上清液中分泌的炎性细胞因子浓度的工序，及
(3)工序(2)中的炎性细胞因子浓度为与单独培养源自患者的T细胞的培养上清液中的炎性细胞因子浓度为同水平、或者其以下的情况下，判定该视网膜色素上皮细胞可用作针对该患者的眼疾病治疗剂的有效成分的工序。
本发明的方法(2)的工序(1)中的将源自患者的T细胞与视网膜色素上皮细胞进行的接触培养，可以按照后述实施例记载的方法进行实施。具体而言，向96孔板接种源自患者的T细胞，添加视网膜色素上皮细胞并进行培养。在本工序中，源自患者的T细胞可以预先进行活化。作为T细胞的活化方法，没有特别限定，可以通过例如添加抗CD3抗体进行实施。另外，可以预先将T细胞分离为CD4阳性细胞和CD8阳性细胞进行制备。
另外，针对本工序中使用的视网膜色素上皮细胞，为了避免在培养中视网膜色素上皮细胞发生增殖，也可以预先进行放射线处理。进一步，对培养中使用的视网膜色素上皮细胞而言，优选其HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座的基因型各自为纯合的基因型。
对培养培养基而言，只要是本技术领域通常使用的细胞培养用培养基即可，可以没有特别限制地使用。可以使用例如：F-10培养基、F12培养基、MEM、BME培养基、DMEM、αMEM、IMD培养基、ES培养基、DM-160培养基、Fisher培养基、WE培养基及RPMI 1640培养基等基础培养基。进一步，可以根据需要向基础培养基中添加血清(胎牛血清等)、各种生长因子(EGF、FGF、HGF、PDGF等)、抗生素、氨基酸等。培养基的pH优选为约6～约8。培养可以在例如：通常于约30～约40℃、约15～约60小时、优选为48小时的条件下进行。另外，培养时，源自患者的T细胞与视网膜色素上皮细胞的细胞数量的比率通常为500:1～10:1，优选为400:1～25:1，更优选为200:1～50:1。通过将源自患者的T细胞与视网膜色素上皮细胞的细胞数量的比率设定在该范围，T细胞可分泌适当的量的炎性细胞因子或者细胞毒性物质，因此，使得能够更明确地判定作为对象的视网膜色素上皮细胞是否可以适用于该患者。
在本发明的方法(2)中的作为T细胞的来源的患者的眼疾病，可以与作为本发明的治疗剂的适用对象的眼疾病相同，视网膜色素上皮细胞的制备，可以与本发明的治疗剂中包含的视网膜色素上皮细胞的制备相同。
本发明的方法(2)的工序(2)中，培养上清液中分泌的炎性细胞因子浓度的测定，可以按照后述实施例记载的方法进行实施。具体而言，可以通过ELISA、Western blot、FACS等进行测定。另外，本工序中测定的炎性细胞因子，只要是参与排斥反应的细胞因子即可，没有特别限制，例如，在工序(1)中，使用了作为源自患者的T细胞的CD4阳性细胞的情况下，可列举IFN-γ、IL-17及TNF-α，其中更优选IFN-γ。另外，在工序(1)中，使用了作为源自患者的T细胞的CD8阳性细胞的情况下，可列举粒酶B、穿孔素、TNF-α，其中更优选粒酶B。
如后述实施例那样，对从受试者提取的T细胞与诱导分化iPS细胞而得到的视网膜色素上皮细胞进行共培养，结果发现，相对于HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座的基因型分别为纯合的基因型的视网膜色素上皮细胞，具有在相应的基因座中至少一个等位基因与该视网膜色素上皮细胞的该基因座中的等位基因一致的组合的T细胞，细胞因子的产生与对照为相同水平或抑制。因此，本发明的方法(2)的工序(3)中，在利用工序(2)测定的炎性细胞因子浓度与单独培养的源自患者的T细胞的培养上清液中的炎性细胞因子浓度为相同水平，或者为其以下的情况下，可以判定：可以将该视网膜色素上皮细胞作为相对于该患者的眼疾病治疗剂的有效成分使用。
本发明另外提供，用于预测待移植所述移植用视网膜色素上皮细胞的眼疾病患者的排斥反应的试验方法。具体而言，本发明的预测排斥反应的方法(以下，称为“本发明的方法(3)”)包括以下工序：
(A)将源自患者的T细胞与该视网膜色素上皮细胞进行接触培养的工序，
(B)测定工序(A)的培养上清液中分泌的炎性细胞因子浓度的工序，及
(C)在工序(B)中的炎性细胞因子浓度，显著高于单独培养的源自患者的T细胞的培养上清液中的炎性细胞因子浓度的情况下，判定相对于该视网膜色素上皮细胞产生排斥反应的工序。
就本发明的方法(3)的工序(A)及(B)而言，可以与本发明的方法(2)的工序(1)及(2)相同地实施。另外，如后述实施例那样，对从受试者提取的T细胞与诱导分化iPS细胞而得到的视网膜色素上皮细胞进行共培养，结果发现，相对于HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座的基因型分别为纯合的基因型的视网膜色素上皮细胞，具有在相应的基因座中至少一个等位基因与该视网膜色素上皮细胞的该基因座中的等位基因不一致的组合的T细胞，与对照相比，细胞因子的产生升高。因此，本发明的方法(3)的工序(C)中，在利用工序(B)测定的炎性细胞因子浓度显著高于单独培养的源自患者的T细胞的培养上清液中的炎性细胞因子浓度的情况下，可判定：相对于该视网膜色素上皮细胞产生排斥反应。
实施例
以下示出了实施例，并对本发明更详细地进行了说明，但这些仅为示例，本发明的范围并不限定于此。
(制备例1)源自人iPS细胞的RPE细胞的制备
使用Nature Methods 8,409-412 2011中公开的iPS细胞株454E2、或者453F2(由京都大学提供)作为iPS细胞，基于J Cell Sci(2009)122:3169-3179记载的诱导分化方法，制备了源自454E2-iPS细胞的RPE细胞、及源自453F2-iPS细胞的RPE细胞(两种细胞的HLA-A、-B、-DR 3个基因座的基因型为纯合的基因型)。
另外，使用由源自受试者名TLHD-1的人皮肤的成纤维细胞并基于Nature(2011)474:225-229记载的方法建立的iPS细胞代替454E2或者453F2作为iPS细胞株，利用同样的方法制备了源自TLHD-1-iPS细胞的RPE细胞。
(制备例2)人T细胞悬浮液的制备
使用MACS磁化分离装置从人外周血(受试者名；TLHD-1～TLHD-22)分离了CD4阳性T细胞及CD8阳性T细胞，悬浮于含有100U/ml rhIL-2的RPMI培养液(RPMI 1640 445ml、FBS50ml、青霉素-链霉素5ml)中，而制备了各细胞悬浮液。
(参考1)HLA分型
将利用常用的方法进行的实施例1～8中使用的细胞的HLA分型的结果示于以下的表中。将制备例2中得到的受试者的各T细胞的HLA分型结果示于表1-1、1-2，此外，将制备例1、从其它的iPS细胞诱导而成的源自人iPS的RPE细胞的HLA分型结果示于表2。
相对于源自454E2-iPS细胞的RPE细胞(HLA-A、HLA-B、HLA-DR的3个基因座纯合)，受试者名TLHD-10及TLHD-21在HLA-A、HLA-B、HLA-DR的3个基因座中的全部基因型的等位基因为一致，受试者名TLHD-6、18在HLA-B、HLA-DR的2个基因座的基因型上等位基因为一致，受试者名TLHD-2、5、7、9、11、12、13、14、15、17、20、22仅在HLA-A的1个基因座的基因型上等位基因为一致，受试者名TLHD-19仅在HLA-DR的1个基因座的基因型上等位基因为一致。
另外，相对于源自453F2-iPS细胞的RPE细胞(HLA-A、HLA-B、HLA-DR的3个基因座纯合)，受试者名TLHD-1、4、18在2个基因座的基因型上等位基因为一致，受试者名TLHD-6仅在HLA-A的1个基因座的基因型上等位基因为一致。
表1-1中，T cell表示T细胞；Origin表示来源；T cell response to 454E2*表示对454E2*的T细胞应答；HLA-matched to 454E2表示与454E2匹配的HLA。
[表1-1]
[表1-2]
*T细胞对454E2的反应：采用没有视网膜色素上皮细胞而培养各T细胞(CD4阳性或CD8阳性)的情况的细胞因子浓度作为对照，将高于该浓度的情况作为(+)，将与其为同浓度或低于其的情况作为(-)。nt表示未测定。
在表2中，cell表示细胞；skin fibroblasts表示皮肤成纤维细胞；dental pulpcells表示牙髓细胞；Fetal ocular cells表示胎儿眼细胞；Adult ocular cells表示成人眼细胞；Primary human CE cells表示原代人CE细胞；Skin tissues(HD表示皮肤组织(HD)；Cornea endothelial cells表示角膜内皮细胞；Fibroblast cells表示成纤维细胞；homozygous donor表示纯合供体；Autologous:表示自体。
[表2]
(制备例3)源自猴iPS细胞的RPE细胞的制备
由源自食蟹猴的皮肤的成纤维细胞，基于Nature(2011)474:225-229(使用GLIS1)记载的方法建立了iPS细胞，并基于J Cell Sci(2009)122:3169-3179记载的诱导分化方法，对于健康正常猴(A、B)及通过向单眼施加视网膜光凝术使其形成视网膜光凝斑而制作成的疾病模型猴(C)，分别制备了源自猴iPS细胞的RPE细胞。
(制备例4)猴T细胞悬浮液的制备
使用MACS磁化分离装置从疾病模型猴(C)的外周血分离了CD4阳性T细胞及CD8阳性T细胞，悬浮于含有100U/ml rhIL-2的RPMI培养液(RPMI1640 445ml、FBS 50ml、青霉素-链霉素5ml)中而制备了各T细胞悬浮液。
(参考2)MHC分型
利用常用的方法进行了实施例9、10中使用的细胞的MHC分型。相对于健康正常猴A的源自iPS细胞的RPE细胞(Mafa-A、-B、-DRA、-DRB、-DQA、-DQB、-DPA、-DPB基因座之中的3个基因座为纯合)，疾病模型猴(C)在3个基因座上等位基因为一致。源自健康正常猴B的iPS细胞的RPE细胞，与疾病模型猴(C)为MHC全部的基因型为不一致。
(实施例1)
向96孔板中，向制备例2得到的CD4阳性T细胞悬浮液(TLHD-1及TLHD-2)添加抗CD3抗体1μg/ml，并以5x105细胞/孔的浓度移液至孔中。向各孔中，以3种浓度：1x103/孔、5x103/孔、1x104/孔添加了制备例1得到的源自454E2-iPS的RPE细胞，将不添加的情况(T cellalone：仅T细胞)作为对照进行了培养。48小时培养之后，回收培养上清，用ELISA测定了培养上清液中的IFN-γ的浓度。将结果示于图1。
该结果为，TLHD-1及TLHD-2均为：相对于对照，在全部3种浓度中，IFN-γ的产生升高了。因此，可以判定：将源自454E2-iPS的RPE细胞移植至受试者TLHD-1及TLHD-2的情况下，产生排斥反应的可能性较高。
对TLHD-1及TLHD-2的HLA抗原而言，与源自454E2-iPS的RPE细胞的HLA-DR抗原(Class-II)为单元型不一致。另外，虽然TLHD-2的HLA-A的等位基因对于HLA-A抗原及HLA-B抗原(Class-I)一致、但其以外的单元型为全部不一致，而TLHD-1为全部不一致(表3)。
[表3]
CD4+细胞 iPS-RPE Class Ⅱ匹配 Class I匹配 IFN-γ
TLHD-2 454E2 不匹配 不匹配 升高
454E2 454E2 不匹配 A等位基因匹配 升高
(实施例2)
使用制备例2中得到的CD4阳性T细胞悬浮液(受试者名：TLHD-2、TLHD-3、TLHD-4、TLHD-6、TLHD-7、TLHD-8、TLHD-9)作为T细胞悬浮液，将制备例1中得到的源自454E2-iPS的RPE细胞以1x104/孔的浓度进行使用，除此点以外，与实施例1进行了同样的方法，测定了IFN-γ的产生量。另外，T细胞悬浮液及源自iPS细胞的RPE细胞均使用了源自TLHD-1的细胞，与实施例1进行了同样的方法，测定了IFN-γ的产生量。将结果示于图2。
该结果为，在TLHD-1的T细胞悬浮液与源自TLHD-1的iPS细胞的RPE细胞的组合，及TLHD-6的T细胞悬浮液与源自454E2-iPS的RPE细胞的组合中，相对于对照，IFN-γ的产生受到了抑制。
因此，可以判定：在自体移植、或将源自454E2-iPS的RPE细胞移植至受试者TLHD-6的情况下，产生排斥反应的可能性较低。即，该源自454E2-iPS的RPE细胞，可以用作受试者TLHD-6或具有与受试者TLHD-6相同的HLA单元型、且等位基因也一致的患者用的眼疾病治疗剂。
另一方面，在上述以外的组合中，相对于对照，IFN-γ的产生量升高了。因此，可以判定：在将源自454E2-iPS细胞的RPE细胞，移植至除具有与TLHD-6相同的HLA单元型、且等位基因也一致的眼疾病患者以外的患者的情况下，产生排斥反应的可能性较高。在这种情况下，不将源自454E2-iPS细胞的RPE细胞利用于移植，或需要对组合使用了免疫抑制剂的移植进行研究。
对抑制了细胞因子的产生的TLHD-6而言，在源自454E2-iPS细胞的RPE细胞的HLA-DR及HLA-B中的等位基因为一致。另一方面，对细胞因子产生较高的TLHD-7而言，虽然HLA-A中的等位基因为一致，但HLA-DR中的等位基因不一致。另外，对TLHD-8而言，与源自454E2-iPS细胞的RPE细胞为等位基因不一致。细胞因子产生较高的其它细胞，与源自454E2-iPS细胞的RPE细胞为单元型不一致(表4)。
[表4]
CD4+细胞 iPS-RPE Class Ⅱ匹配 Class I匹配 IFN-γ
TLHD-1 TLHD-1 全匹配 全匹配 降低
TLHD-6 454E2 DR等位基因匹配 B等位基因匹配 降低
TLHD-7 454E2 DR单元型匹配 A等位基因匹配 升高
TLHD-8 454E2 DR单元型匹配 不匹配 升高
TLHD-2 454E2 不匹配 A等位基因匹配 升高
TLHD-3 454E2 不匹配 不匹配 升高
TLHD-4 454E2 不匹配 不匹配 升高
TLHD-9 454E2 不匹配 A等位基因匹配 升高
(实施例3)
使用制备例2中得到的CD4阳性T细胞悬浮液(TLHD-1)作为T细胞悬浮液，代替制备例1中得到的源自454E2-iPS的RPE细胞，将表2示出的No.1～3、6～10及小鼠成纤维细胞以1x 104/孔的浓度进行使用，除此点以外，与实施例1进行了同样的方法，测定了IFN-γ的产生量。将结果示于图3。
该结果为，对于除了人成纤维细胞以外的全部细胞，IFN-γ的产生量升高了。因此，可以判定，在将源自454E2-iPS细胞的RPE细胞，移植至具有与上述人成纤维细胞相同的HLA单元型、且等位基因也一致的眼疾病患者以外的患者的情况下，产生排斥反应的可能性较高。在这种情况下，可以不将源自454E2-iPS细胞的RPE细胞利用于移植，或对组合使用了免疫抑制剂的移植进行研究。
相对于源自ES的RPE细胞及人成纤维细胞的HLA-DR抗原，TLHD-1为等位基因一致，而其他为单元型不一致(表5)。
[表5]
条柱 CD4+细胞 细胞 Class Ⅱ匹配 IFN-γ
2 TLHD-1 836B1 iPS-RPE 不匹配 升高
3 TLHD-1 101G26 iPS-RPE 不匹配 升高
4 TLHD-1 454E2 iPS-RPE 不匹配 升高
5 TLHD-1 ES-RPE DR等位基因匹配 升高
6 TLHD-1 胚胎RPE 不匹配 升高
7 TLHD-1 ARPE-19 不匹配 升高
8 TLHD-1 HCE 不匹配 升高
9 TLHD-1 人成纤维细胞 DR等位基因匹配 相同
10 TLHD-1 小鼠成纤维细胞 不匹配 升高
(实施例4)
使用制备例2中得到的CD4阳性T细胞悬浮液(受试者名：TLHD-1、TLHD-8、TLHD-14、TLHD-21)作为T细胞悬浮液，并使用表2所示的源自453F2-iPS的RPE细胞代替制备例1中得到的源自454E2-iPS的RPE细胞，除此以外，进行了相同的实验。将结果示于图4。
或者，使用制备例2中得到的CD8阳性T细胞悬浮液(受试者名：TLHD-1、TLHD-8、TLHD-14、TLHD-22)作为实施例1中的T细胞悬浮液，并使用表2所示的源自453F2-iPS的RPE细胞代替制备例1中得到的源自454E2-iPS的RPE细胞，除此以外，进行了相同的实验。将结果示于图5。
该结果为，在TLHD-1的CD8阳性T细胞悬浮液与源自453F2-iPS的RPE细胞的组合中，相对于对照，粒酶B的产生受到了抑制。因此，可以判定：在将源自453F2-iPS的RPE细胞移植至受试者TLHD-1的情况下，产生排斥反应的可能性较低。即，该源自453F2-iPS的RPE细胞，存在用作受试者TLHD-1或具有与受试者TLHD-1相同的HLA单元型、且等位基因也一致的患者用的眼疾病治疗剂的可能性。
(实施例5)
向96孔板中，向制备例2中得到的CD4阳性T细胞悬浮液(TLHD-1)添加抗CD3抗体1μg/ml，并以5x 105细胞/孔的浓度移液至孔中。向各孔中，以1x104/孔的浓度添加了制备例1得到的HLA的3个基因座纯合的源自454E2-iPS的RPE细胞，将不添加的情况作为对照进行了培养。48小时培养之后，回收细胞，用FACS分别测定了CD4阳性T细胞中的IL-2、IFN-γ、IL-17、TNF-α、IL-22的产生。将结果示于图6。
该结果发现，能够将IFN-γ、IL-17及TNF-α作为抗CD4阳性T细胞的细胞因子产生的指标进行利用。
另外，进一步用制备例2中得到的CD4阳性T细胞悬浮液(TLHD-1及TLHD-10)进行了相同的试验，进行了各种细胞因子产生量的比较(图7a及b)。纵坐标表示目标细胞因子的产生。
该结果为，在数量众多的细胞因子中，只有IFN-γ在相对于源自454E2-iPS细胞的RPE细胞(HLA-A、HLA-B、HLA-DR的3个基因座纯合)，使用了受试者名TLHD-10的T细胞(在HLA-A、HLA-B、HLA-DR的3个基因座中的全部基因型的等位基因为一致)的情况下表达量减少。因而可知，IFN-γ合适作为是否发生排斥反应的指标。
(实施例6)
向制备例2中得到的CD8阳性T细胞悬浮液(TLHD-1)添加抗CD3抗体1μg/ml，并以1x105细胞/孔的浓度移液至孔中。向各孔中，以1x104/孔的浓度添加了制备例1得到的HLA的3个基因座纯合的源自454E2-iPS的RPE细胞，将不添加的情况作为对照，进行了培养。48小时培养之后，回收细胞，用FACS分别测定了CD8阳性T细胞中的粒酶B、穿孔素、TNF-α的产生。将双阳性的细胞的比率示于图8。
该结果提示，可将CD8阳性T细胞产生的细胞毒性物质用于排斥反应的筛选。
(实施例7)
使用CD8阳性T细胞的悬浮液(受试者名：TLHD-1、TLHD-3)代替CD4阳性T细胞，代替IFN-γ而测定了粒酶B的产生，除此点以外，进行了和实施例1同样的方法。将结果示于图9。
该结果为，TLHD-1及TLHD-3均为：相对于对照，在全部2种浓度中，粒酶的产生升高了。因此，可以判定：将源自454E2-iPS的RPE细胞移植至受试者TLHD-1及TLHD-3的情况下，产生排斥反应的可能性较高。
对TLHD-1及TLHD-3的HLA抗原而言，与源自454E2-iPS的RPE细胞的HLA-A抗原、HLA-B抗原均为单元型不一致。(表6)
[表6]
CD8+T细胞 iPS-RPE Class I匹配 Class Ⅱ匹配 粒酶B
TLHD-1 454E2 不匹配 不匹配 升高
TLHD-3 454E2 不匹配 不匹配 升高
(实施例8)
使用CD8阳性T细胞的悬浮液(受试者名；TLHD-2、4、5、8、10、12、13、14、16、17、18、19、20)代替CD4阳性T细胞，代替IFN-γ而测定了粒酶B的产生，除此点以外，进行了和实施例1同样的方法。将结果示于图10。
该结果为，在TLHD-10、TLHD-18、TLHD-2、TLHD-14、TLHD-12、TLHD-13、TLHD-17的T细胞悬浮液与源自454E2-iPS的RPE细胞的组合中，相对于对照，粒酶B的产生受到了抑制。因此，可以判定：在将源自454E2-iPS的RPE细胞移植至受试者TLHD-10、TLHD-18的情况下，产生排斥反应的可能性较低。另外，虽然对于TLHD-2、TLHD-14、TLHD-12、TLHD-13、TLHD-17而言，仅HLA-A的等位基因不匹配，但对于不产生排斥反应的可能性存在研究的余地。
另一方面，在除了上述以外的组合中，相对于对照，粒酶B的产生量升高了。因此，可以判定：在将源自454E2-iPS细胞的RPE细胞移植至该受试者的情况下，产生排斥反应的可能性较高。在这种情况下，可以不将源自454E2-iPS细胞的RPE细胞利用于移植，或对组合使用了免疫抑制剂的移植进行研究。
对粒酶B的产生受到抑制的TLHD-10及TLHD-18而言，在HLA-A或HLA-B、和HLA-DR中单元型和等位基因均一致。另一方面，对TLHD-2、TLHD-14、TLHD-12、TLHD-13而言，与源自454E2-iPS细胞的RPE细胞在HLA-A或HLA-B中的单元型和等位基因一致。另一方面，在粒酶B的产生升高的TLHD-5、TLHD-20中也是，与源自454E2-iPS细胞的RPE细胞在HLA-A或HLA-B中的单元型和等位基因一致，TLHD-8为仅HLA-DR单元型一致(表7)。
存在像这样即使等位基因、单元型部分一致，粒酶B的产生也升高的情况，但如果至少HLA-A、HLA-B或HLA-DR的等位基因之中的任意1个等位基因为一致，则可判断引起排斥反应的可能性较低。进一步，如果HLA-A、HLA-B或HLA-DR的等位基因之中任意2个等位基因为一致，则引起排斥反应的可能性较低，如果HLA-A、HLA-B及HLA-DR的全部等位基因为一致，可以判断为适宜移植。一方面如果不是这样则不利用于移植，或可以作为研究与免疫抑制剂组合使用的移植的指标。对粒酶B产生较高的其它细胞而言，为与源自454E2-iPS细胞的RPE细胞为单元型本身不一致。
[表7]
(实施例9)
(预测试验)
向96孔板中，向制备例4中得到的CD4阳性T细胞悬浮液(猴疾病模型C)添加抗CD3抗体1μg/ml，并以5x105细胞/孔的浓度移液至孔中。向各孔中，以1x104/孔的浓度添加了制备例3得到的源自健康正常猴B-iPS的RPE细胞、或源自疾病模型猴C-iPS的RPE细胞，将不添加的情况作为对照，进行了培养。48小时培养之后，回收培养上清液，用ELISA测定了培养上清液中的IFN-γ的浓度。
上述的方法中，使用CD8阳性T细胞的悬浮液(猴疾病模型C)代替了CD4阳性T细胞，代替IFN-γ而测定了粒酶B的产生，除此点以外，进行了与上述同样的方法。
相对于对照，源自健康正常猴B-iPS的RPE细胞的情况为IFN-γ及粒酶B的产生量均升高，与此相对，相对于对照，源自疾病模型猴C-iPS的RPE细胞为IFN-γ及粒酶B的产生量均受到抑制。
(移植试验)
将源自健康正常猴B-iPS的RPE细胞、或源自疾病模型猴C-iPS的RPE细胞，基于Invest Ophthalmol Vis Sci.1995Feb；36(2):381-90.记载的方法，移植至疾病模型猴C的单眼。移植后第28天，进行眼底影像、及用OCT(Optical coherence tomograph)光学相干断层仪将眼底的截面绘成像组织切片那样的图像，对视网膜的状态进行确认。
在实施了使用了源自健康正常猴B-iPS的RPE细胞的异体移植的情况下，可见移植物周围的纤维性变化、利用荧光眼底造影检验的荧光的泄漏、OCT中视网膜下的高亮度病变等明显的排斥反应。在实施了使用了源自疾病模型猴C-iPS的RPE细胞的自体移植的情况下，未确认到这样明显的排斥反应，没有利用荧光眼底造影检验的荧光的泄漏，移植物植活，没有发生感觉视网膜的变薄等障碍。
(实施例10)
(预测试验)
将制备例3中得到的源自健康正常猴A-iPS的RPE细胞(MHC的3个基因座纯合)、或源自疾病模型猴C-iPS的RPE细胞作为实施例8中源自iPS的RPE细胞，以1x104/孔的浓度进行使用，除此点以外，进行了与实施例8同样的方法，测定了IFN-γ的产生量。
上述的方法中，使用CD8阳性T细胞的悬浮液(猴疾病模型C)代替了CD4阳性T细胞，代替IFN-γ而测定了粒酶B的产生，除此点以外，进行了与上述同样的方法。
相对于对照，对源自健康正常猴A-iPS的RPE细胞与源自疾病模型猴C-iPS的RPE细胞而言，IFN-γ及粒酶B的产生量均受到抑制。
(移植试验)
实施例8的移植试验中，使用了源自健康正常猴A-iPS的RPE细胞(3个基因座纯合)或源自疾病模型猴C-iPS的RPE细胞作为源自iPS的RPE细胞，除此点以外，按照实施例8中记载的方法，将源自iPS的RPE细胞移植至疾病模型猴C的单眼。移植后第28天，进行眼底影像、及用OCT(Optical coherence tomograph)光学相干断层仪将眼底的截面绘成像组织切片那样的图像，对视网膜的状态进行确认。
实施了使用了源自健康正常猴A-iPS的RPE细胞(3个基因座纯合)的异体移植的情况，与实施了使用了源自疾病模型猴C-iPS的RPE细胞的自体移植的情况相同，未确认到明显的排斥反应，没有利用荧光眼底造影检验的荧光的泄漏，移植物植活，没有发生视网膜感觉层的变薄等障碍。
工业实用性
根据本发明，使得能够在RPE细胞移植中，供体侧的HLA-A、HLA-B及HLA-DR的三个基因座的基因型为纯合的基因型的情况下，仅通过对接受者的HLA基因座的其中一个为匹配来抑制排斥反应。因此，可以通过事前采血来辨别、选择免疫学上不适合的细胞，因此，可以通过避免不适合的细胞的移植来减轻患者的负担。能够将通过该方法选择的細胞用于RPE细胞移植。另外通过将本发明用于判定免疫抑制剂的需要与否，有助于治疗方针的选择。因而，本发明有利于显著提高基于异体移植的治疗效率，而且也发挥削减不适合移植的细胞的制备成本等效果。
本申请以在日本申请的日本特愿2014-032325(申请日：日本平成26年(2014年)2月21日)为基础，并将其内容全部并入本说明书。

Claims (29)

1.眼疾病治疗剂，所述眼疾病治疗剂含有视网膜色素上皮细胞并用于眼疾病患者，其中，所述视网膜色素上皮细胞在HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座的基因型分别为纯合的基因型，所述眼疾病患者具有在相应的基因座中至少一个等位基因与所述视网膜色素上皮细胞的所述基因座中的等位基因一致的组合。
2.根据权利要求1所述的药剂，其抑制移植后的免疫排斥反应。
3.根据权利要求1或2所述的药剂，其中，所述视网膜色素上皮细胞源自多功能性干细胞。
4.根据权利要求3所述的药剂，其中，所述多功能性干细胞为iPS细胞。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的药剂，其中，所述眼疾病为视网膜变性或伴随视网膜变性的疾病。
6.选择针对眼疾病患者的眼疾病治疗剂的方法，其包括以下工序：
(i)检查源自患者的T细胞的HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座的基因型的工序，
(ii)选择具有与工序(i)中判明的各基因座中的等位基因一致的等位基因的视网膜色素上皮细胞的工序。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，工序(ii)中的视网膜色素上皮细胞具有的HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座中的基因型分别为纯合的基因型。
8.选择针对眼疾病患者的眼疾病治疗剂的方法，其包括以下工序：
(1)将源自患者的T细胞与视网膜色素上皮细胞进行接触培养的工序，
(2)测定工序(1)的培养上清液中分泌的炎性细胞因子浓度的工序，及
(3)在工序(2)中的炎性细胞因子浓度与单独培养源自患者的T细胞的培养上清液中的炎性细胞因子浓度为同水平、或者其以下的情况下，判定所述视网膜色素上皮细胞可用作针对所述患者的眼疾病治疗剂的有效成分的工序。
9.权利要求8所述的方法,其中，所述视网膜色素上皮细胞具有的HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座中的基因型分别为纯合的基因型。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，用抗CD3抗体使工序(1)中的源自患者的T细胞活化。
11.根据权利要求8～10中任一项所述的方法，其中，工序(1)中源自患者的T细胞为CD4阳性，工序(2)中测定的炎性细胞因子为IFN-γ。
12.根据权利要求8～10中任一项所述的方法，其中，工序(1)中源自患者的T细胞为CD8阳性，工序(2)中测定的炎性细胞因子为粒酶B。
13.试验方法，其用于预测移植移植用视网膜色素上皮细胞的眼疾病患者的排斥反应，其包括以下工序：
(A)将源自患者的T细胞与所述视网膜色素上皮细胞进行接触培养的工序，
(B)测定工序(A)的培养上清液中分泌的炎性细胞因子浓度的工序，及
(C)在工序(B)中的炎性细胞因子浓度显著高于单独培养的源自患者的T细胞的培养上清液中的炎性细胞因子浓度的情况下，判定相对于所述视网膜色素上皮细胞产生排斥反应的工序。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述移植用视网膜色素上皮细胞具有的HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座中的基因型分别为纯合的基因型。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其包括用抗CD3抗体使工序(A)中源自患者的T细胞活化。
16.根据权利要求13～15中任一项所述的方法，其中，工序(A)中源自患者的T细胞为CD4阳性，工序(B)中测定的炎性细胞因子为IFN-γ。
17.根据权利要求13～15中任一项所述的方法，其中，工序(A)中源自患者的T细胞为CD8阳性，工序(B)中测定的炎性细胞因子为粒酶B。
18.眼疾病的治疗方法，其包括将HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座中的基因型分别为纯合的基因型的视网膜色素上皮细胞制成片状，移植至眼疾病患者，所述眼疾病患者具有在相应的基因座中至少一个等位基因与所述视网膜色素上皮细胞的所述基因座中的等位基因一致的组合。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述视网膜色素上皮细胞源自多功能性干细胞。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述多功能性干细胞为iPS细胞。
21.根据权利要求18～20中任一项所述的方法，其中，所述眼疾病为视网膜变性或伴随视网膜变性的疾病。
22.视网膜色素上皮细胞，其用于治疗眼疾病患者的眼疾病，其中，所述视网膜色素上皮细胞在HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座中的基因型分别为纯合的基因型，所述眼疾病患者具有在相应的基因座中至少一个等位基因与所述视网膜色素上皮细胞的所述基因座中的等位基因一致的组合。
23.根据权利要求22所述的视网膜色素上皮细胞，其中，所述视网膜色素上皮细胞源自多功能性干细胞。
24.根据权利要求23所述的视网膜色素上皮细胞，其中，所述多功能性干细胞为iPS细胞。
25.根据权利要求22～24中任一项所述的视网膜色素上皮细胞，其中，所述眼疾病为视网膜变性或伴随视网膜变性的疾病。
26.视网膜色素上皮细胞，其用于制造眼疾病患者的眼疾病的治疗剂，其中，所述视网膜色素上皮细胞在HLA-A基因座、HLA-B基因座及HLA-DR基因座中的基因型分别为纯合的基因型，所述眼疾病患者具有在相应的基因座中至少一个等位基因与所述视网膜色素上皮细胞的所述基因座中的等位基因一致的组合。
27.根据权利要求26所述的视网膜色素上皮细胞，其中，所述视网膜色素上皮细胞源自多功能性干细胞。
28.根据权利要求27所述的视网膜色素上皮细胞，其中，所述多功能性干细胞为iPS细胞。
29.根据权利要求26～28中任一项所述的视网膜色素上皮细胞，其中，所述眼疾病为视网膜变性或伴随视网膜变性的疾病。
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