CN106222117A - 一种茶树专用解磷解钾类复合菌剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种茶树专用复合菌剂及其制备方法；本发明先分离得到阿氏芽孢杆菌WP2、恶臭假单胞菌YP8和解钾细菌K2，再将阿氏芽孢杆菌WP2、恶臭假单胞菌YP8、解钾细菌K2接种到LB液体培养基中，得到三种菌株液体种子；将上述得到的三种菌株液体种子按体积比1：1：1充分混合，接种到固体复合载体中，35℃恒温培养24‑48小时，至固体复合载体中的活菌数达到4.0×1010cfu/g。将达到活菌数要求的菌剂在40℃下干燥至含水量≤5％，即可得到茶树专用复合菌剂。本发明具有解磷、解钾的作用。将菌种制备成固体菌剂后，每亩茶园沟施2公斤，可以有效地提高土壤速效磷和速效钾含量，同时还能提高茶叶百芽重、提升茶叶品质。

Description

一种茶树专用解磷解钾类复合菌剂及其制备方法
一、技术领域
本发明涉及一种茶树专用解磷解钾类复合菌剂及其制备方法，属于微生物技术领域。
二、背景技术
近几十年来，化学肥料的大量施用使茶叶的产量大幅度提高，但是长期以来，茶园单一施用氮肥，土壤日趋恶化，茶树树体衰弱，病虫害严重，萌发的叶芽瘦黄而弱小，所制干茶味淡涩苦、不耐冲泡、质量低下，同时化肥的大量使用造成环境及农产品污染。因此，人们开始重视微生物肥料的生产。微生物肥料是一种含有活性微生物，通过其生命活动增加植物营养元素的供应量(包含土壤和生产环境中植物元素的供应量和植物营养元素的有效供应量)，能产生植物生长激素或抑制有害微生物活动的活体制品。微生物肥料能够活化并促进植物对营养元素的吸收，改善土壤理化性质，提高土壤肥力，提高作物产量，增强作物的抗病能力。同时其产品无毒、无害、无污染，增产效果明显，具有减少温室气体排放，重构健康土壤结构等优点。
我国茶树生物菌肥的研究虽然取得了一定的进展，但是产品还存在许多不足之处。例如产品中所使用的功能菌种对环境适应性单一，更换接种地区后其有效成分降低，微生物种群不稳定，品种容易退化，繁衍系数还不高，颗粒强度较低，长期保存和运输容易破碎等。因此，筛选适应山东茶园土壤环境的菌株成为研制山东茶树专用微生物肥料的关键。此外，山东茶区属于新兴茶区，茶树专用肥料产品较少，特别是茶树微生物菌肥市场几乎空白，出售的也大多是南方产品，效果欠佳，不能够满足北方茶树生长的需求。因此，亟需开发北方茶树专用生物有机肥。这不仅可以填补其市场空白，还带动生物肥料行业整体技术进步，提升其行业竞争力，具有较为广阔的市场需求，能够产生显著的经济效益。
三、发明内容
本发明提供了一种茶树专用解磷解钾类复合菌剂及其制备方法，是一种能够在茶园土壤环境中发挥高活性的茶树专用解磷解钾类复合菌剂及其应用。
发明人从山东茶园土壤中分离得到一株解钾细菌K2，根据其形态学和分子生物特征，将其命名为枯草芽孢杆菌K2(Bacillus subtilis K2)；已于2016年6月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO:60052；其16S rDNA序列如SEQ.ID.NO.3所示。
发明人还从山东茶园土壤中分离得到一株无机磷分解细菌，根据其形态学和分子生物特征，将其命名为阿氏芽孢杆菌WP2(Bacillus aryabhattai WP2)；已于2016年6月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO:60051；其16S rDNA序列如SEQ.ID.NO.4所示；
发明人还从山东茶园土壤中分离得到一株有机磷分解细菌，根据其形态学和分子生物特征，将其命名为恶臭假单胞菌YP8(Pseudomonas putida YP8)；已于2016年6月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO:60053；其16S rDNA序列如SEQ.ID.NO.5所示；
一种茶树专用解磷解钾类复合菌剂的制备步骤如下：
(1)固体复合载体的制备：将麦麸、草炭、硅藻土按质量百分比70％：20％：10％混匀，然后加入麦麸、草炭和硅藻土总体积1.5倍的蒸馏水(蒸馏水pH＝7)，高温灭菌后得到固体复合载体；
(2)首先分别挑取阿氏芽孢杆菌WP2、恶臭假单胞菌YP8、解钾细菌K2接种到100mLLB液体培养基中，于30℃下震荡培养，培养至每种菌液OD值＝0.5。然后将达到OD值＝0.5的三种培养液分别和LB液体培养基(胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g)按照体积比1:25的比例混匀，于30℃下震荡培养24小时，得到三种菌株液体种子。
(3)将上述得到的三种菌株液体种子按体积比1：1：1充分混合，接种到步骤(1)得到的固体复合载体中，接种量为12％(质量比)；35℃恒温培养24-48小时，至固体复合载体中的活菌数达到4.0×1010cfu/g。将达到活菌数要求的菌剂在40℃下干燥至含水量≤5％，即可得到茶树专用复合菌剂。
本发明中的复合微生物菌剂具有解磷、解钾的作用。将菌种制备成固体菌剂后，每亩茶园沟施2公斤，可以有效地提高土壤速效磷和速效钾含量，同时还能提高茶叶百芽重、提升茶叶品质。
四、具体实施方式
实施例1、茶树专用解钾菌K2的分离、鉴定
发明人采集山东茶园土样，放置于无菌袋中低温保存并带回实验室4℃保存。利用解钾菌培养基(酵母膏0.5g，蔗糖10g，(NH4)2SO4 1.0g，Na2HPO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO3 1.0g，钾长石粉1.0g，定容至1000mL，调pH至7.0～7.5)从土壤中筛选目标菌株。以传统的形态学、生理生化特征和PCR为基础的现代技术相结合，对培养的菌株进行分类鉴定，最后筛选得到一株解钾菌。
经菌株生理生化特征试验发现，菌株为革兰氏阳性菌，好氧，接触酶、V-P均为阳性，可利用葡萄糖、蔗糖和半乳糖作为碳源使用，能水解酪素，液化明胶，能运动。
经菌株生理生化特征试验发现，菌株为革兰氏阳性菌，好氧，接触酶、V-P均为阳性，可利用葡萄糖、蔗糖和半乳糖作为碳源使用，能水解酪素，液化明胶，能运动。
提取该菌株基因组DNA为模板进行PCR，扩增16S rDNA的序列：引物16S-8F：5ˊ-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3ˊ(SEQ ID NO.1)，和16S-1510-R：5ˊ-AGGGYTACCTTGTTACGACTT-3ˊ(SEQ ID NO.2)。
反应程序如下：①94℃预变性3min；②94℃变性1min；③46℃退火50s；④72℃延伸2min；⑤重复步骤②～④30次；⑥72℃延伸10min；⑦4℃终止反应。结束后，用1×TAE缓冲液制作1％琼脂糖凝胶检测PCR产物；用康为公司的DNA回收试剂盒回收PCR的产物并纯化扩增片段，然后将纯化的DNA片段直接由华大基因测序完成。随后在BLAST上进行检索，发现目的片段与Bacillus subtilis strain CE1的16s rRNA的DNA序列(JQ435698)相似度最高，最终确定分离物为枯草芽孢杆菌K2(Bacillus subtilis K2)，将其命名为枯草芽孢杆菌K2(Bacillus subtilis K2)，并对其进行了生物保藏，其保藏号为GDMCC NO:60052，验证为存活。其16S rDNA序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明分离得到的枯草芽孢杆菌K2(Bacillus subtilis K2)可将土壤中难溶性的钾元素转化成为可溶性养分。
实施例2、茶树专用无机磷分解菌WP2的分离、鉴定为例
本发明的发明人采集山东茶园土样，放置于无菌袋中低温保存并带回实验室4℃保存。利用无机磷培养基(葡萄糖10.0g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O0.03g，MgSO4·7H2O 0.3g，MnSO4·4H2O 0.03g，酵母膏0.4g，Ca3(PO4)2 10.0g，用去离子水定容至1000mL，调pH值至7.0～7.5)从土壤中培养筛选目标菌株。以传统的形态学、生理生化特征和PCR为基础的现代技术相结合，对培养得到的菌株进行分类鉴定，最后筛选出一株无机磷分解菌。
经形态学观察，该无机磷分解菌菌落为乳白色椭圆形，其表面光滑，边缘整齐，不透明，菌落呈凸起状。从个体形态来看，菌株为卵圆形细菌，侧生鞭毛，有荚膜。
经菌株生理生化特征试验发现，菌株为革兰氏阳性菌，好氧，接触酶、V-P均为阳性，可利用葡萄糖、蔗糖和半乳糖作为碳源使用，能水解酪素，液化明胶，能运动。
提取菌株基因组DNA为模板进行PCR，扩增其16S rDNA的序列：引物16S-8F：5ˊ-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3ˊ(SEQ ID NO.1)，和16S-1510-R：5ˊ-AGGGYTACCTTGTTACGACTT-3ˊ(SEQ ID NO.2)。
反应程序如下：①94℃预变性3min；②94℃变性1min；③46℃退火50s；④72℃延伸2min；⑤重复步骤②～④30次；⑥72℃延伸10min；⑦4℃终止反应。结束后，用1×TAE缓冲液制作1％琼脂糖凝胶检测PCR产物；用康为公司的DNA回收试剂盒回收PCR的产物并纯化扩增片段，然后将纯化的DNA片段直接由华大基因测序完成。随后在BLAST上进行检索，发现目的片段与Bacillus aryabhattai strain M2的16s rRNA的DNA序列(KC934850)相似度最高，最终确定分离物为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)，我们将这一分离物命名为阿氏芽孢杆菌WP2(Bacillus aryabhattai WP2)，发明人对其进行了生物保藏，其保藏号为GDMCC NO:60051，验证为存活，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明分离得到的阿氏芽孢杆菌WP2可将难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态。
实施例3、以茶树专用有机磷分解菌YP8的分离、鉴定为例
本发明的发明人采集山东茶园土样，放置于无菌袋中低温保存并带回实验室4℃保存。利用有机磷培养基(葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O0.03g，MgSO4·7H2O 0.3g，MnSO4·4H2O 0.03g，CaCO3 5g，卵磷脂适量，定容至1000mL，调pH至7.0-7.5)从土壤中筛选目标菌株。以传统的形态学、生理生化特征和PCR为基础的现代技术相结合，对培养得到的菌株进行分类鉴定，最后筛选出一株有机磷分解菌。
经过形态学观察，发现该有机磷分解菌菌落为淡黄色圆形，其表面光滑，边缘整齐，不透明，菌落呈凸起状。从个体形态来看，菌株为卵圆形细菌，极生鞭毛，无荚膜。
经菌株生理生化特征试验发现，菌株为革兰氏阴性菌，好氧，接触酶、氧化酶均为阳性，可利用葡萄糖、蔗糖和半乳糖作为碳源使用，能水解酪素，不能液化明胶，能运动。
提取该菌株基因组DNA为模板进行PCR，扩增16S rDNA的序列：引物16S-8F：5ˊ-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3ˊ(SEQ ID NO.1)，和16S-1510-R：5ˊ-AGGGYTACCTTGTTACGACTT-3ˊ(SEQ ID NO.2)。
反应程序如下：①94℃预变性3min；②94℃变性1min；③46℃退火50s；④72℃延伸2min；⑤重复步骤②～④30次；⑥72℃延伸10min；⑦4℃终止反应。结束后，用1×TAE缓冲液制作1％琼脂糖凝胶检测PCR产物；用康为公司的DNA回收试剂盒回收PCR 的产物并纯化扩增片段，然后将纯化的DNA片段直接由华大基因测序完成。随后在BLAST上进行检索，发现目的片段与Pseudomonas putida strain NBFPALD_RAS137的16s rRNA的DNA序列(KJ819580)相似度最高，最终确定分离物为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，将其命名为恶臭假单胞菌YP8(Pseudomonas putida YP8)，并进行了生物保藏，其保藏号为GDMCC NO:60053，其16S rDNA序列为SEQ ID NO.5。
本发明分离得到的恶臭假单胞菌YP8具有分解有机磷化物(如核酸、磷脂等)的作用。
实施例4、制备茶树专用解磷解钾类复合菌剂
(1)固体复合载体的制备：将麦麸、草炭、硅藻土按质量百分比70％：20％：10％混匀，然后加入麦麸、草炭和硅藻土总体积1.5倍的蒸馏水(蒸馏水pH＝7)，120℃高温灭菌后得到固体复合载体；
(2)首先挑取阿氏芽孢杆菌WP2、恶臭假单胞菌YP8、解钾细菌K2分别接种到100mLLB液体培养基(胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g)中，于30℃下震荡培养，培养至菌液OD值＝0.5。然后分别吸取40mL OD值＝0.5的上述三种培养液，分别注入到1000mL所述LB液体培养基中，于30℃下震荡培养24小时，得到三种菌株液体种子。
(3)将上述得到的三种菌株液体种子按体积比1：1：1充分混合，接种到步骤1)得到的固体复合载体中，接种量为12％(质量比)；35℃恒温培养24-48小时，至固体复合载体中的活菌数达到4.0×1010cfu/g。将达到活菌数要求的菌剂在40℃下干燥至含水量≤5％，即可得到茶树专用复合菌剂。
验证例1、以茶树专用解磷解钾类复合菌剂对茶树产量的影响为例
采用小区实验方式，设置4个处理，分别为“爱地斯”微生物菌剂(市购)+普通有机肥(处理一)、本发明制备的茶树专用复合菌剂+普通有机肥(处理二)、普通有机肥(处理三)、不施肥(处理四)。每个处理设2个小区，每个小区面积为60m2。施用菌剂量均为2公斤/亩，普通有机肥均为400公斤/亩。施肥方法采用常规的开沟方式(开沟深度为20cm左右)。各小区水分管理、病虫害防治等均相同。结果证明：处理二施用本发明制备的茶树专用菌剂的小区茶叶产量比不施肥增加63.8％，比施用普通有机肥增加51.4％，比施用处理一普通商品菌剂增加37.8％，表明本发明得到的茶树专用菌剂具有良好的增产作用。
验证例2、以茶树专用解磷解钾类复合菌剂对茶叶品质的影响为例
采用小区实验方式，设置4个处理，分别为“爱地斯”微生物菌剂(市购)+普通 有机肥(处理一)、本发明制备的茶树专用复合菌剂+普通有机肥(处理二)、普通有机肥(处理三)、不施肥(处理四)。每个处理设2个小区，每个小区面积为60m2。施用菌剂量均为2公斤/亩，普通有机肥均为400公斤/亩。施肥方法采用常规的开沟方式(开沟深度为20cm左右)。各小区水分管理、病虫害防治等均相同。结果证明：施用本发明制备的茶树专用菌剂后，水浸出物、咖啡碱、茶多酚、氨基酸比处理四不施肥分别增加2.2％、1.6％、4.7％、5.3％；水浸出物、茶多酚、氨基酸比处理二施用普通有机肥的增加0.8％、4.6％、15.8％，咖啡碱降低0.6％；水浸出物、咖啡碱、茶多酚、氨基酸比处理一施用普通商品菌剂的分别增加2.2％、1.6％、4.7％、5.3％，表明本发明得到的茶树专用菌剂能够很好的提升茶叶品质。

Claims (2)

1.一种茶树专用解磷解钾类复合菌剂，其特征在于通过以下制备方法得到：
1)固体复合载体的制备：将麦麸、草炭、硅藻土按质量百分比70％：20％：10％混匀，然后加入麦麸、草炭和硅藻土总体积1.5倍的pH＝7的蒸馏水，高温灭菌后得到固体复合载体；
2)首先分别挑取阿氏芽孢杆菌WP2、恶臭假单胞菌YP8、解钾细菌K2接种到100mL LB液体培养基中，于30℃下震荡培养，培养至每种菌液OD值＝0.5；然后将OD值＝0.5的三种培养液分别和LB液体培养基按照体积比1:25的比例混匀，于30℃下震荡培养24小时，得到三种菌株液体种子；
3)将上述得到的三种菌株液体种子按体积比1：1：1充分混合，接种到步骤1)得到的固体复合载体中，接种量为质量比12％；35℃恒温培养24-48小时，至固体复合载体中的活菌数达到4.0×1010cfu/g；将达到活菌数要求的菌剂在40℃下干燥至含水量≤5％，即可得到茶树专用复合菌剂；
所述解钾菌枯草芽孢杆菌K2保藏号为GDMCC NO:60052；已于2016年6月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心；其16S rDNA序列如SEQ.ID.NO.3所示；
所述阿氏芽孢杆菌WP2保藏号为GDMCC NO:60051；已于2016年6月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心；其16S rDNA序列如SEQ.ID.NO.6所示；
所述恶臭假单胞菌YP8保藏号为GDMCC NO:60053；已于2016年6月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心；其16S rDNA序列如SEQ.ID.NO.9所示。
2.权利要求1所述的一种茶树专用解磷解钾类复合菌剂在提高土壤速效磷和速效钾含量及提高茶叶百芽重和提升茶叶品质中的应用。
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