CN106220735A - 一种组织蛋白酶b激活式靶向抗肿瘤多肽的制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型的组织蛋白酶B激活式靶向抗肿瘤多肽m(KLA)‑iRGD，分子量为2570，氨基酸序列为_D(KLAKLAKKLAKLA)KGGCRGDKGPDC。该肽由KLA肽和iRGD肽通过柔性连接子Gly‑Gly构建而成，KLA肽的序列为KLAKLAKKLAKLAK，多肽N端KLAKLAKKLAKLA序列的氨基酸均为D型氨基酸；iRGD肽的序列为CRGDKGPDC。本发明的优点在于首次将肿瘤靶向肽iRGD与促细胞凋亡肽KLA连接成新的多肽m(KLA)‑iRGD。m(KLA)‑iRGD肽能特异性结合αVβ3和NRP‑1受体进入肿瘤细胞，被细胞内组织蛋白酶B(CTSB)激活后引发线粒体凋亡，选择性杀伤肿瘤细胞，显著抑制移植瘤的生长与转移。在相同浓度下，m(KLA)‑iRGD肽比对照肽具有更高的肿瘤靶向性和更强的抑制抗肿瘤生长与转移的能力。同时，m(KLA)‑iRGD肽对小鼠体重及重要脏器无明显毒性，为进一步的临床研究与应用奠定了坚实的基础。

Description

一种组织蛋白酶B激活式靶向抗肿瘤多肽的制备与应用

技术领域

本发明属于生物与医药技术领域，具体涉及一种具有抗癌活性的的多肽m(KLA)-iRGD的制备和应用。

背景技术

化学疗法是临床上***的主要途径之一，然而大多数的化疗药物因为缺少肿瘤靶向性而引起严重的毒副作用，临床应用受到限制，因此寻找对正常组织毒性低，并具有肿瘤组织选择性的药物显得十分迫切。

肿瘤靶向肽是一类能够能将药物选择性递送至肿瘤微环境的多肽，通过靶向定位到肿瘤部位的特异性受体，介导药物靶向运输，改善药物疗效同时减低对正常组织的副作用。肿瘤靶向多肽可以分为三个类型：(i)靶向肽；(ii)渗透肽；(iii)靶向渗透肽。iRGD肽属于上述第3类多肽，它是一个环状9肽，氨基酸序列为CRGDKGPDC，其中的RGD序列具有αVβ3整合素靶向的功能，能够靶向定位到整合素表达较高的肿瘤部位，经过肿瘤附近特定酶切割之后的R残基片段则能够与肿瘤细胞表面的NRP-1(神经菌毛素)相互作用，介导发生细胞膜穿透效应。最新研究表明直链状的iRGD肽同样具有生物活性。

前体药物(prodrug)，也称药物前体、前驱药物等，是指药物经过化学结构修饰后得到的在体外无活性或活性较小、在体内经酶或非酶的转化释放出活性药物而发挥药效的化合物。前体药物本身没有生物活性或活性很低，经过体内代谢后变为有活性的物质，这一过程的目的在于增加药物的生物利用度，加强靶向性，降低药物的毒性和副作用。目前，多肽修饰技术已成为前药设计领域的重要趋势，这是由于由多肽修饰的药物在血液循环中十分稳定，前体药物在血液循环中的滞留时间延长，到达靶部位的可能性大大增加，被靶部位细胞上的酶水解后释放原型药物发挥药理作用。

组织蛋白酶B(Cathepsin B，CTSB)，是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，由一条25kD的重链和一条5kD的轻链组成，研究发现CTSB是一种重要的胞内水解酶并且在多种肿瘤中高表达，与肿瘤的发生发展及转移侵袭有密切的关系。目前利用CTSB的酶切活性，已有多种抗肿瘤前体药物被设计合成。常用的CTSB特异性酶切底物主要包括Z-Phe-Lys-、Z-Ala-Lys-和Z-Val-Cit-。

KLA肽((KLAKLAK)₂)是一个人工合成的促细胞线粒体凋亡肽，本身不具有细胞膜渗透性，要与药物递送载体融合后才能进入真核细胞细胞。KLA肽被Pasqualini等第一次使用于引发哺乳动物细胞凋亡。

目前尚未见到利用链状iRGD肽导向技术和肽修饰技术合成携带有在肿瘤细胞内选择性水解的酶激活式靶向抗肿瘤多肽的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种组织蛋白酶B激活式靶向抗肿瘤多肽的制备及其应用。

本发明采取的技术方案是：提供一种酶激活式靶向抗肿瘤多肽，其结构式如(I)所示：X-GG-Y(I)，其中：X代表KLA肽(KLAKLAKKLAKLAK)，是一种促细胞凋亡肽；Y代表与肿瘤血管上皮细胞有较高亲和力的多肽，直连状的iRGD肽，作为一种导向载体。GG代表甘氨酰甘氨酰连接子，减少X和Y的相互干扰。

作为本发明的进一步改进，KLA肽的基序N端的KLAKLAKKLAKLA氨基酸均为D型氨基酸，在体内可以更为稳定的存在，末端K为L型氨基酸，是CTSB特异性酶切位点。

本发明以将其游离氨基与iRGD多肽的羧基相连，成功合成携带有在肿瘤***周围选择性水解的多肽结构和对肿瘤血管上皮细胞有高亲和力的靶向抗肿瘤多肽，达到加快该类抗肿瘤药物主动向特定肿瘤组织的富集并增加药物渗透，在肿瘤组织周围水解释放出细胞毒性药物的靶向性的目的。

本发明多肽的制备方法采用固相多肽合成法。

本发明的有益效果是：体内实验证明，该酶激活式靶向抗肿瘤多肽能够选择性地富集到肿瘤组织，增加对肿瘤血管的渗透性，并且能够选择性杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长与转移，而对正常组织无毒无害。

同时本发明研究的制备方法方便易行，具有良好的医药领域应用推广价值。

附图说明

图1是m(KLA)-iRGD的构建示意图；

图2是m(KLA)-iRGD的MS与HPLC分析图；

图3是细胞株分子标志物表达水平；

图4是体外肿瘤细胞毒性实验结果；

图5是流式及Western-blot分析体外细胞毒性实验结果；

图6是体外肿瘤靶向性实验结果；

图7是体内肿瘤靶向性实验结果；

图8是体内抗肿瘤实验结果；

图9是体内肿瘤转移抑制实验结果；

图10是m(KLA)-iRGD对小鼠主要脏器及体重的影响。

具体实施方式

下述实验中所使用的多肽序列如下：

_D(KLAKLAKKLAKLAK)GGCRGDKGPDC；

_D(KLAKLAKKLAKLAK)；

CRGDKGPDC；

_D(KLAKLAKKLAKLA)KGGCRGDKGPDC；

FITC-_D(KLAKLAKKLAKLA)KGGCRGDKGPDC。

数据分析：计数结果应用统计软件SPSS16.0进行分析，采用Levene法对各组计数结果进行方差齐性检验。如果各组方差齐性(P＞0.05时，方差齐性)，然后采用独立样本t检验，分析组间是否有显著差异(P＜0.05时，有显著差异)

实施案例1：m(KLA)-iRGD及对照肽的合成与纯化

1.将2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂放入反应管中，加DCM(15ml/g)，振荡30min；

2.通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入DMF溶解，振荡30min，甲醇封头，30min；

3.去掉溶剂，加20％哌啶/DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶/DMF溶液(15ml/g)，15min；

4.抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应；

5.DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次；

6.护氨基酸Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量，反应30min；

7.抽掉溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃-110℃加热5min，无色为阴性反应，说明反应完全；

8.DMF(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次；

9.重复三至八步操作，依次连接序列中剩余氨基酸，直至最后一个，脱除最后一个氨基酸的Fmoc保护基；

10.DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)三次，DCM(10ml/g)三次，抽干树脂；

11.配制切割液(10/g)TFA 94.5％；水1％；EDT 2.5％；TIS 2.5％，切割时间：120min；

12.将裂解液用氮气尽量吹干，用***洗六次，然后常温挥干；

13.用HPLC纯化多肽，将纯化后的溶液冻干，既得到成品；

14.分别取少量的成品多肽，做MS的分子量鉴定，和HPLC分析的纯度鉴定(图2)；

15.将白色粉末状的多肽，密封包装，-20度保存；

其余多肽的合成同上述方法。

FITC-m(KLA)-iRGD的合成与纯化

1.将2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂放入反应管中，加DCM(15ml/g)，振荡30min；

2.通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入DMF溶解，振荡30min。甲醇封头，30min；

3.去掉溶剂，加20％哌啶/DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶/DMF溶液(15ml/g)，15min；

4.抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应；

5.DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次

6.保护氨基酸Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量.反应30min；

7.抽掉溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃-110℃加热5min，无色为阴性反应，说明反应完全；

8.DMF(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次；

9.重复三至八步操作，依次连接序列中剩余氨基酸(其中小写字母为D型氨基酸)，直至最后一个，脱除Fmoc保护基；

10. 5-FITC三倍过量，用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量，避光反应2h；

11.抽掉溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃-110℃加热5min，树脂红色而无蓝色为阴性反应，说明反应完全；

12.DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)三次，DCM(10ml/g)三次。抽干树脂；

13.配制切割液(10/g)TFA 94.5％；水1％；EDT 2.5％；TIS 2.5％，切割时间：120min；

14.将裂解液用氮气尽量吹干，用***洗六次，然后常温挥干。

15.用HPLC法纯化多肽，将纯化后的溶液避光冻干，既得到成品。

16.分别取少量的成品多肽，做MS的分子量鉴定，和HPLC分析的纯度鉴定；

17.将红色粉末状的多肽，密封包装，-20度保存。

实施案例2：m(KLA)-iRGD的抗肿瘤作用研究

体外肿瘤细胞毒性试验：

根据目地多肽对表达不同分子标志物的细胞生长的抑制作用，能够直接反应m(KLA)的体外靶向抗肿瘤活性。因此，我们首先通过检测不同细胞株的分子标志物的表达量来选择合适的细胞株，然后通过细胞毒性实验来检测m(KLA)-iRGD对肿瘤细胞的选择性毒性作用。具体操作如下：

肿瘤细胞株的筛选：

我们用RT-PCR检测多种肿瘤细胞株的CTSB表达量，然后用Western-bolt检测CTSB阳性4T1、231、B16细胞株，CTSB阴性细胞株SKBR3的NRP-1、CTSB、αVβ3的表达量(图3)。

荧光定量PCR：

1、细胞以2×10⁵个/ml的密度接种至6孔培养板中，待次日细胞汇合度到达70％～80％时，吸去培养上清，用PBS洗去残留的死细胞及培养基，向每孔加入500μl Buffer-R-I裂解细胞，轻轻吹打至液体清亮后收集裂解液，置-80℃冰箱备用；

2、试剂盒提取细胞总RNA(所有耗材、试剂均为RNase free)：向上一步收集的细胞裂解液中加入110μl Buffer R-II，漩涡震荡15～30s，4℃中12000rpm离心10min；转移上清至1.5ml EP管中，加入200μl异丙醇，轻轻颠倒混和均匀；将制备柱置于一2ml EP管中，把上一步的混合液转移到制备管中，4℃，6000rpm离心1min后，弃去滤液，向制备柱中加入500μlBuffer W1，4℃，12000rpm离心1min；弃去滤液，向制备柱中加入700μl Buffer W2，4℃，12000rpm离心1min，重复改步骤洗涤一次；弃滤液，12000rpm离心2min甩干；将制备柱置于一洁净的1.5ml EP管中，开口静置2min，挥发残余酒精，向制备柱中央膜上滴加70～100μlRnase-free水，室温静置2min后，12000rpm离心1min得RNA溶液。

3、逆转录

1)反应体系如下：

2)反应条件：37℃，15min(逆转录反应)

85℃，5s(逆转录失活反应)

4、荧光定量PCR扩增检测

3)反应体系如下：

4)Real Time PCR反应条件与程序如下：

Cycle 1(预变性)：95℃30s

Cycle 2(PCR反应)：95℃5s，60℃30s，40个循环数

Cycle 3(解离)：95℃15s，60℃60s

Cycle 4(溶解曲线)：65℃30s。

温度设置：起始温度为65℃，结束温度设为95℃，温度变化设为0.5℃，重复次数61。

5)结果分析

Real-time PCR反应结束后，确认Real-time PCR的融解曲线和扩增曲线，用ΔΔCt法对实验结果进行统计分析。其中Δct＝ct(目的基因)-ct(Gapdh)，ΔΔct＝Δct(对照组)-Δct(实验组)。每个实验结果至少重复三次，数值以均值(Mean)±标准差(SD)表示。

蛋白免疫印迹(Western Blot)：

1、细胞按照实验要求处理后，弃去培养基，用预冷PBS洗3次后加入三去污细胞裂解液，冰上放置20～30min。收集细胞裂解液，12000rpm离心30min得上清；

2、蛋白上清经Bradford法定量后，以每孔20～50μg总蛋白量上样。电压80V～120V进行SDS-PAGE电泳分离，再以200mA、90-120min的条件电转至甲醇预处理的PVDF膜；

3、转膜结束后，用PBS/T在摇床上洗涤PVDF膜5min，然后用Western Blot封闭液室温封闭2h，被检测的抗体用封闭液按说明书推荐比例稀释，4℃孵育PVDF膜过夜。次日将PVDF膜移至室温复温0.5～1h，PBS/T洗涤3次，每次10min，加入HRP标记的二抗(1∶5000-8000)室温孵育1-1.5h。PBS/T洗涤10min×3次后滴加ECL发光液，于暗室中曝光、显影、定影；

4、曝光后的PVDF膜经过PBS/T洗涤10min×3次去除残留的发光液后，在50℃水浴中用stripping buffer浸泡振荡孵育30min以解离结合的抗体。继而用PBS/T洗涤10min×3次，Western Blot封闭液室温封闭2h，与以一定比例稀释的非磷酸化蛋白抗体或内参抗体于4℃孵育过夜，次日PBS/T洗涤，孵育二抗，并曝光、显影、定影。

结果显示，B16细胞是Nrp-1阴性，SKBR3细胞是CTSB阴性，而231和4T1细胞NRP-1和CTSB表达均为阳性。

m(KLA)-iRGD肽及对照肽对肿瘤细胞的毒性作用

MTT法：

使用3-(4，5-二甲基-噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴化物(Sigma公司MTT)测定细胞生长。简言之，4T1，231，SKBR3，BT549细胞铺板过夜以每孔5000个细胞在96孔板中。然后将细胞用10μM、15μM、20μM、40μM、80μM的m(KLA)-iRGD或对照肽处理24h。根据下面的公式计算细胞生长的抑制率：抑制率(％)＝(对照值A490-实验值A490)控制值A490×100％。分别用不同浓度的m(KLA)-iRGD及其对照肽孵育四种细胞株，计算细胞生长抑制率。

结果显示，m(KLA)-iRGD仅对231和4T1细胞株显示出明显毒性，同时，其对照肽对不同的细胞株均不具有明显的细胞毒性，证实了m(KLA)-iRGD对CTSB和NRP-1双阳性细胞株的选择性细胞毒作用(图4)。

流式细胞术检测：

4T1，231，SKBR3，BT549细胞培养直至80％融合，用40μM m(KLA)-iRGD孵育24h。细胞的倒置显微镜(Nikon TE 300)下观察，收集细胞到5mM EDTA的PBS中，洗涤并重悬浮在Annexin V结合缓冲液中，然后用Annexin V和碘化丙啶染色根据制造商的说明(Calbiochem公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)。用FACS软件(BD Biosciences公司)对凋亡细胞进行了分析，实验重复三次。

结果显示，m(KLA)-iRGD作用后的231和4T1细胞株凋亡比例较对照组有显著提高，证实了m(KLA)-iRGD对CTSB和NRP-1双阳性细胞株的促凋亡作用。(图5)

肿瘤体外靶向性实验：

为了检测m(KLA)-iRGD的体外肿瘤细胞靶向渗透性，我们将FITC荧光分子标记在m(KLA)-iRGD的N端，而后孵育以上四种细胞株后通过激光共聚焦实验检测其在各株细胞内的分布。

激光共聚焦实验：

细胞接种到培养皿上并培养24h直至60％汇合，将培养基更换为含有10％FBS和1μM FITC标记的多肽新鲜培养基。然后将细胞培养2h。将细胞用PBS洗涤3次，然后4％多聚甲醛固定10min。肿瘤细胞的细胞核被4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色可视化。细胞在激光共聚焦显微镜下检查。

结果显示，荧光信号选择性定位到NRP-1阳性的231/4T1和SKbr3细胞内，1-2h已有很强的荧光信号进入细胞内。证实了mKLA对NRP阳性肿瘤细胞的靶向渗透性。(图6)

肿瘤模型的建立：

4-6周的大BALB/C小鼠购自中山大学(广州，中国)动物中心，在无病原体条件下饲养。所有的动物实验均按照照顾和使用实验动物的机构准则进行。2×10⁶4T1细胞悬浮在100μl生理盐水，在小鼠的右两翼(4-6周龄)皮下注射(SC)。肿瘤生长至4-6mm的直径开始给药。50μMm(KLA)-iRGD肽或PBS静脉注射，隔日1次。肿瘤生长和体重监测每2天1次。肿瘤的生长参数用游标卡尺每周测量两次三围测量。使用下式计算肿瘤体积：长度×宽度²×0.52。给药三周后处死小鼠，取出肿瘤称重后，进行免疫组化、免疫荧光及TUNEL实验分析。

肿瘤体内靶向性实验：

为了验证m-KLA的体内肿瘤靶向渗透性，我们建立了4T1小鼠移植瘤模型，用PBS和FITC-m(KLA)分别注射小鼠后，通过荧光显微镜和小动物成像***观测小鼠体内荧光分布状态。

荷瘤小鼠的肿瘤长到1.0-1.5cm³后开始实验，FITC-m(KLA)-iRGD(100μg溶解在100μl PBS中)尾静脉注射，并使其体内循环4h。然后将小鼠麻醉并通过左心房在指定的时间点灌注20ml PBS。取出肿瘤和对照的组织包括心，肝，脾，肺，肾，脑，冻结在OCT包埋剂(樱花公司，USA)中，制作冰冻切片，并用激光扫描共聚焦显微镜检查荧光。肿瘤细胞的细胞核用DAPI染色可观测。

结果显示，FITC-KLA能够选择性定位到肿瘤部位，并在12h内保持一定的荧光强度，证实了m(KLA)的体内肿瘤靶向性及其稳定性。(图7)

体内抗肿瘤试验：

利用4T1小鼠肿瘤模型，通过H&E染色和TUNEL染色检测m(KLA)-iRGD肽在体内对肿瘤生长的抑制作用。

H&E染色：

1、小鼠组织用10％中性缓冲***固定24h；

2、常规石蜡包埋、切片(4μm厚)；

3、二甲苯脱蜡：二甲苯(I)5min→二甲苯(II)5min

4、乙醇梯度至水洗：无水乙醇2min→95％的乙醇5min→80％乙醇5min，70％乙醇5min→蒸馏水洗5min。

5、苏木素染色10min，流水冲洗30s；

6、盐酸乙醇分化30s，流水冲洗15min，伊红染色3min；

7、梯度乙醇脱水、透明，封片：70％乙醇5min→80％乙醇5min→95％乙醇5min→无水乙醇5min→二甲苯(I)10min→二甲苯(II)10min→中性树脂封固，镜下观察，拍照

TUNEL染色：

肿瘤样品固定在10％的***缓冲液中24h后进行处理，包埋在石蜡中用于切片根据传统方法。在石蜡包埋的肿瘤切片(5mm厚)均热固定，脱蜡用二甲苯，然后再水化以梯度系列的乙醇。根据制造商的说明用原位细胞死亡检测试剂盒(Roche，印第安纳波利斯，USA)对组织切片进行TUNEL染色。

结果显示，给药三周后，与PBS对照组相比，给药组肿瘤生长速度明显减慢，实验结束时肿瘤体积与重量明显减小。HE染色和TUNEL染色实验结果显示，m(KLA)-iRGD促使大量肿瘤细胞凋亡，显著减少肿瘤组织内细胞密度。这些结果均证实了m(KLA)-iRGD的体内肿瘤生长抑制作用(图8)。

我们同时发现，m(KLA)对肿瘤转移具有一定的抑制作用，对照组的4T1荷瘤小鼠存在着且明显的肿瘤肺部转移，而给药组的小鼠肿瘤转移情况消失(图9)。最后我们对给药组小鼠的主要脏器进行了HE染色，没有观察到明显形态学变化，实验组小鼠与对照组小鼠体重变化也无明显差异，表明了m(KLA)不具有显著的体内毒副作用(图10)。

以上数据显示，m(KLA)-iRGD具有显著抑制肿瘤生长及肿瘤转移的作用，有望成为一种新型抗肿瘤药物。

Claims (5)

1.一种组织蛋白酶B激活式靶向抗肿瘤多肽，其特征在于其结构通式如(I)所示：X-GG-Y(I)其中：X代表一种促细胞凋亡多肽：KLAKLAKKLAKLAK；Y代表与肿瘤血管内皮细胞有较高亲和力的多肽：链状iRGD肽；GG代表甘氨酰甘氨酰连接子。

2.根据权利要求1所述酶激活式靶向抗肿瘤多肽，其特征在于所述结构通式中Y是直链状iRGD(序列为CRGDKGPDC)，位于多肽C端。

3.根据权利要求1所述的酶激活式靶向抗肿瘤多肽，其特征在于N端13个氨基酸KLAKLAKKLAKLA的氨基酸类型均为D型氨基酸，其余氨基酸均为L型氨基酸。

4.根据权利要求1所述的酶激活式靶向抗肿瘤多肽在靶向抗肿瘤中的应用。

5.根据权利要求1所述的酶激活式靶向抗肿瘤多肽在抑制肿瘤转移中的应用。