CN106198995A - 一种同型半胱氨酸诊断试剂盒和同型半胱氨酸浓度的测定方法 - Google Patents

一种同型半胱氨酸诊断试剂盒和同型半胱氨酸浓度的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种同型半胱氨酸浓度的测定方法，氧化型同型半胱氨酸生成α‑丁酮酸、氨和硫化氢，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使NADH转化为NAD+，通过测定NADH在340nm处的吸光度率来定量；一种同型半胱氨酸诊断试剂盒，包括试剂Ⅰ和试剂Ⅱ，试剂Ⅰ含有还原型辅酶Ⅰ、谷氨酸脱氢酶、三(2‑羧乙基)膦盐酸盐、α‑酮戊二酸、表面活性剂、缓冲液、稳定剂，试剂Ⅱ含有HCYase、磷酸吡哆醛、缓冲液、稳定剂。本发明的有益效果是：建立了液体双试剂检测人血清中同型半胱氨酸的试剂盒，无需另外配置荧光检测仪，便于大量样本的检测；检测方法不会受到样本中的丙酮酸、甲硫氨酸和半胱氨酸的干扰，价格更低廉。

Description

一种同型半胱氨酸诊断试剂盒和同型半胱氨酸浓度的测定 方法
技术领域
本发明涉及一种同型半胱氨酸诊断试剂盒和同型半胱氨酸浓度的测定方法。
背景技术
同型半胱氨酸α,γ-裂解酶(homocysteineα,γ-lyases,HCYase,EC4.4.1.11)是一种磷酸吡哆醛(PLP)依赖酶，又称L-蛋氨酸γ-裂解酶，属于γ蛋白家族。能催化L-蛋氨酸及同型半胱氨酸的α,γ-消除反应及γ-取代反应，催化L-半胱氨酸及其衍生物的α,β消除反应及β-取代反应。催化此类反应的酶最早在大肠杆菌中发现，命名为蛋氨酸裂解酶(Methioninelyase)，如今将它命名为蛋氨酸γ-裂解酶并在多种生物中发现，如恶臭假单抱杆菌、***毛滴虫、气单抱菌属、拟南芥等。虽然来源不同，HCYase的分子量大都在170kDa左右，由四个分子量大小在40-48KD的同型亚基组成；具有磷酸吡哆醛依赖性，蛋白的紫外吸收除了在280nm有吸收峰外还会在420nm处出现一个与磷酸吡哆醛结合的特征峰。
HCYase在生物体内含硫氨基酸的代谢中发挥重要作用，并被开发成为新型抗肿瘤药物及同型半胱氨酸血症的诊断试剂，其作用机理及在治疗上的潜在应用价值引起了人们的极大关注。另外它在原虫体内含硫氨基酸的代谢中发挥重要作用，可以其为靶位开发抗寄生虫药物。
蛋氨酸是一种必需氨基酸，是机体主要的甲基提供者。蛋氨酸依赖是肿瘤细胞特有的，表现在肿瘤细胞无法在去除蛋氨酸的环境中生长。蛋氨酸依赖在人肿瘤患者中广泛存在，几乎所有人类肿瘤细胞的蛋氨酸代谢都有改变：正常 细胞、非蛋氨酸依赖的肿瘤细胞、蛋氨酸依赖的肿瘤细胞内的蛋氨酸浓度依次降低，而蛋氨酸浓度保持恒定是肿瘤细胞生长所必需的。HCYase可以催化L-蛋氨酸的α,γ-裂解反应，生成α-丁酮酸，甲硫酸和氨，能有效降低蛋氨酸浓度。与传统化疗方法相比，HCYase作为新型抗肿瘤药物具有肿瘤特异性高，毒副作用小等特点，显示出巨大的临床应用潜力。
自McCully于1969年提出高同型半胱氨酸与动脉粥样硬化有关的观点以来，国内外学者围绕这一问题展开了大量的研究。近年来研究确认，高同型半胱氨酸血症与作为人类第一杀手的动脉粥样硬化、高血压、心肌梗死等多种心血管疾病的发生有密切的联系，是心血管疾病的一个独立危险因素。血浆中Hcy浓度每减少3μmol/L，缺血性心脏病发生率减少11％，卒中发生率减少19％。同型半胱氨酸在临床上可作为心血管疾病，尤其是冠状动脉粥样硬化症和心肌梗死的重要危险指标，其浓度的升高程度与疾病的危险性成正比。因此，研究一种简单、快速、灵敏的检测方法具有重要意义。
2000年，Tan报导了一种用酶生化反应测定同型半胱氨酸的方法。HCYase催化同型半胱氨酸分解为α-丁酮酸，硫化氢和氨，分解产物硫化氢与荧光素N,N-二丁基亚苯基二胺(DBPDA)在FeCl3的酸性环境下形成色素酚噻嗪氯化物类化合物，后者在660nm处定量测定并且其吸光率和样本中HCY的含量成正比。但是此法需要在微量荧光检测仪上检测，不适合临床诊断检测的应用和推广。而且此法由于在FeCl3的酸性条件下显色，考虑到HCYase和荧光素显色剂DBPDA不能稳定保存在酸性环境中，因此使用此方法的试剂盒大多是三试剂，操作繁琐。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：基于上述问题，本发明提供一种同型半胱氨酸诊断试剂盒和同型半胱氨酸浓度的测定方法。
本发明解决其技术问题所采用的一个技术方案是：一种同型半胱氨酸浓度的测定方法，在(2-羧乙基)膦盐酸盐作用下，氧化型同型半胱氨酸转化为游离型同型半胱氨酸，在同型半胱氨酸α,γ-裂解酶的作用下，生成α-丁酮酸、氨和硫化氢；氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使NADH转化为NAD+，通过测定NADH在340nm处的吸光率来定量同型半胱氨酸的浓度。
一种同型半胱氨酸诊断试剂盒，包括试剂Ⅰ和试剂Ⅱ两部分，其中试剂Ⅰ含有还原型辅酶Ⅰ(NADH)、谷氨酸脱氢酶(GLDH)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、α-酮戊二酸、表面活性剂、缓冲液、稳定剂；试剂Ⅱ含有HCYase、磷酸吡哆醛(PLP)、缓冲液、稳定剂。
进一步地，每升试剂Ⅰ溶液中各组分的含量为：
每升试剂Ⅱ溶液中各组分的含量为：
进一步地，每升试剂Ⅰ溶液中各组分的含量为：
每升试剂Ⅱ溶液中各组分的含量为：
进一步地，表面活性剂为曲拉通X-100、B66、吐温20、十二烷基苯磺酸钠、甜菜碱、十六烷基三甲基溴化铵中的一种或几种。
进一步地，稳定剂为叠氮钠、叠氮锂、PC300、苯甲酸钠、山梨酸钾、对羟基苯甲酸丙酯、聚乙二醇、聚乙烯醇、乙二胺四乙酸二钠中的一种或几种。
本发明的有益效果是：(1)建立了液体双试剂检测人血清中同型半胱氨酸的试剂盒，可以在全自动或半自动生化分析仪上操作，无需另外配置荧光检测仪，便于大量样本的检测；
(2)HCYase法检测人血清中同型半胱氨酸的方法不会受到样本中的丙酮酸、甲硫氨酸和半胱氨酸的干扰，此法的价格比其他检测同型半胱氨酸的方法 的价格更低廉，利于同型半胱氨酸检测项目的推广。
附图说明
下面结合附图对本发明进一步说明。
图1是本发明制备的试剂盒的线性范围图；
图2是本发明制备的试剂盒与同型半胱氨酸循环酶法检测临床样本的相关性图。
具体实施方式
现在结合具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
1.制备检测人血清中HCY含量的试剂盒
R1试剂：在1L 100mM Tris-HCl缓冲液中，添加10KU/L GLDH、5mM TCEP、0.5mMNADH、15mMα-酮戊二酸、0.01％曲拉通X-100、0.05％叠氮钠，搅拌均匀即为R1试剂。
R2试剂：在1L 100mM Tris-HCl缓冲液中，添加20KU/L HCYase、0.05mM PLP、0.05％叠氮钠，搅拌均匀即为R2试剂。
同型半胱氨酸校准品：在3mM HCl溶液中，加入28μM HCY
检测方法：
以日立7080生化分析仪为例：测定波长是340nm，测定方法是动力学法。样品量20uL，R1试剂220uL，R2试剂30ul，校准方式是线性测定，反应方向是向上。校准品与R1混合后，在反应第16点读取吸光度值A1，加入R2，在31点读取吸光度值A2，计算吸光度差值δA＝A2-A1。取待测样本，同法测定样本的吸光度差值，将其代入公式HCY含量(μmmol/L)＝(测定管吸光度差值/校准管吸光度差值)×校准品中HCY的含量，即可计算得出待测样本中的HCY的含 量。
2.线性范围检测：取临床高值混合血清(60μmol/L)用生理盐水进行倍比稀释，得到4个浓度的稀释血清，每个浓度的稀释血清重复检测3次，取其均值，将实测值与理论值进行直线回归分析。如图1统计分析显示该方法的回归方程为：y＝0.988x-0.377R2＝0.999P<0.05,该方法在3-60μmol/L内线性较好(见表1)。
表1：本发明试剂盒线性范围
3.本发明试剂盒与同型半胱氨酸测定试剂盒(酶循环酶法)检测临床样本的相关性检测
在3～60μmol/L内选择50例临床样本，分别用本法与同型半胱氨酸测定试剂盒(酶循环酶法)(绍兴美迪康公司)检测，得到本法与酶循环法的回归方程为：y＝0.913x+1.110R2＝0.996P<0.05(见图2)。
4.本发明试剂盒抗干扰性实验
取新鲜混合血清，分成7等份，然后取6等份分别添加不同的干扰物质，干扰物质的浓度如表2所示。对照组以浙江绍兴美迪康生物科技有限公司销售的同型半胱氨酸测定试剂盒(酶循环法)，实验组以本发明中实施例1制备的试剂盒为检测试剂，分别检测血清中的HCY含量。对照组与实验组检测血清中的不同干扰物质结果见表2。相对偏差(％)＝(干扰样本的测定均值-对照组无干扰样本的测定均值)/对照组无干扰样本的测定均值×100％
表2本发明试剂盒与对照组试剂盒抗干扰性能比较
由上述表2结果可见，本发明试剂盒对丙酮酸、血氨、甲硫氨酸、半胱氨酸等物质没有明显的干扰，而对照组检测结果受到丙酮酸、甲硫氨酸和半胱氨酸的干扰。这说明本发明试剂盒在抗干扰方面优于市场在售试剂盒，提高了检测结果的准确度，具有市场竞争力。
本发明利用同型半胱氨酸α,γ-裂解酶配制的同型半胱氨酸检测试剂，检测同型半胱氨酸的线性范围在3-60μmol/L。在此线性范围内，本发明试剂与同型半胱氨酸(酶循环法)试剂相关性良好。而且本发明方法有效减小了丙酮酸、甲硫氨酸、半胱氨酸等物质的干扰影响，从而提高了检测同型半胱氨酸的准确度。本发明的试剂盒可以在全自动或半自动生化仪完成检测，操作简便，价格相对其他同型半胱氨酸检测方法低廉，有利于试剂的市场推广。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (6)

1.一种同型半胱氨酸浓度的测定方法，其特征是：在三(2-羧乙基)膦盐酸盐作用下，氧化型同型半胱氨酸转化为游离型同型半胱氨酸，在同型半胱氨酸α,γ-裂解酶的作用下，生成α-丁酮酸、氨和硫化氢；氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使NADH转化为NAD+，通过测定NADH在340nm处的吸光率来定量同型半胱氨酸的浓度。
2.一种同型半胱氨酸诊断试剂盒，其特征是：包括试剂Ⅰ和试剂Ⅱ两部分，其中试剂Ⅰ含有还原型辅酶Ⅰ、谷氨酸脱氢酶、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、α-酮戊二酸、表面活性剂、缓冲液、稳定剂；试剂Ⅱ含有HCYase、磷酸吡哆醛、缓冲液、稳定剂。
3.根据权利要求2所述的一种同型半胱氨酸诊断试剂盒，其特征是：
每升试剂Ⅰ溶液中各组分的含量为：
每升试剂Ⅱ溶液中各组分的含量为：
4.根据权利要求3所述的一种同型半胱氨酸诊断试剂盒，其特征是：
每升试剂Ⅰ溶液中各组分的含量为：
每升试剂Ⅱ溶液中各组分的含量为：
5.根据权利要求2所述的一种同型半胱氨酸诊断试剂盒，其特征是：所述的表面活性剂为曲拉通X-100、B66、吐温20、十二烷基苯磺酸钠、甜菜碱、十六烷基三甲基溴化铵中的一种或几种。
6.根据权利要求2所述的一种同型半胱氨酸诊断试剂盒，其特征是：所述的稳定剂为叠氮钠、叠氮锂、PC300、苯甲酸钠、山梨酸钾、对羟基苯甲酸丙酯、聚乙二醇、聚乙烯醇、乙二胺四乙酸二钠中的一种或几种。
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