CN106190969A

CN106190969A - 一种蜕膜间充质干细胞的制备方法

Info

Publication number: CN106190969A
Application number: CN201610742838.7A
Authority: CN
Inventors: 全丽丽
Original assignee: HANGZHOU S-EVANS BIOSCIENCES Co Ltd
Current assignee: HANGZHOU S-EVANS BIOSCIENCES Co Ltd
Priority date: 2016-08-26
Filing date: 2016-08-26
Publication date: 2016-12-07

Abstract

本发明公开了一种蜕膜间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：1)取样及前处理；2)细胞分离；3)细胞传代培养；4)冻存。该方法是从蜕膜组织中制备得到蜕膜间充质干细胞的方法，在建立成熟且安全可靠的分离技术基础上，获得高纯度、高活率、无污染干细胞，并将其长期储存于液氮中，可经复苏做干细胞移植用，并有望逐渐代替价格昂贵的、难以寻找匹配相合的骨髓干细胞。

Description

一种蜕膜间充质干细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及一种蜕膜间充质干细胞的制备方法。

背景技术

干细胞技术及其应用被认为是21世纪的人类工程健康工程，其研究内容几乎涉及所有生命科学的生物医学领域，除了在细胞治疗、组织/器官移植和基因治疗中发挥重要作用外，还在发现新基因、基因功能分析、发育生物学模型及新药开发等方面产生重要影响。干细胞技术对难治性疾病在临床上的应用研究将在医学领域引发革命性进步。目前全球正在开发的干细胞主要是间充质干细胞。

间充质干细胞是来源于成熟组织中的多能干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下可分化为成骨细胞、软骨细胞、肝细胞、胰岛细胞等多种细胞。此外，间充质干细胞具有非常低的免疫原性，因而成为细胞移植和组织工程的新型种子细胞，临床研究证明，间充质干细胞移植已成功应用在移植物抗宿主病、脑卒中、心肌梗死、特发性再生障碍性贫血、成骨不全症等疾病治疗中，具有广阔的应用前景。间充质干细胞来源非常广泛，从骨髓、脂肪、滑膜、肌肉等组织以及羊水、脐带血、胎盘中都可分离和制备间充质干细胞，但是各自都存在一定的问题，作为应用最多的骨髓间充质干细胞受年龄影响分化能力，取材不易，异体移植亦引起免疫反应等缺点；胚胎干细胞存在一定的伦理问题；脂肪、脐带、胎盘样本采集均受到来源、时间、采集技术等多方面因素限制等。因此，探索一种增殖能力强、免疫原性低、无道德伦理问题的限制的间充质干细胞迫在眉睫。

子宫内膜间充质干细胞作为一种特殊的间充质干细胞，来源于子宫内膜组织，可从女性月经血和子宫内膜组织中分离获得，其数量为骨髓来源的30倍，具有更强的自我更新能力和增殖能力，分化潜能更接近胚胎干细胞。有研究发现子宫内膜的再生细胞(ERC)不仅具有几乎每24小时复制一次的速率，而且它们产生独特生长因子的速率比来自脐带血的干细胞要快上10万倍。现已公布的子宫内膜间充质干细胞基本分离自女性月经血，其具有采集方便、不受次数限制等优点，但也存在非无菌环境下体外个人操作导致的易受污染的缺陷，故此，能够分离到高质量且保证无菌安全的子宫内膜间充质干细胞的来源和方法是非常有意义的。

***术获得的材料里面中含有蜕膜组织(即子宫内膜组织)，可由此进一步获取子宫内膜干细胞。***术是刮取子宫内膜或宫腔内容物的手术，属于妇产科常规小手术。人流***术属于一种分段诊刮，主要适用于妊娠早期人工流产及不全流产、胎盘滞留等需排空宫腔者。人流***术所获得的主要包括绒毛、蜕膜、子宫内膜组织碎片、胚胎组织和一定的体液(血液)等，其中蜕膜组织是子宫内膜间质受蜕膜化诱导因子刺激而增殖和再分化形成的一种特殊组织。蜕膜可分为底蜕膜、包蜕膜、壁蜕膜，底蜕膜将来可形成胎盘母体部，包蜕膜覆盖在胚泡外面，壁蜕膜紧贴在子宫腔表面，无论是何种蜕膜，无论是后期发育到哪个阶段，均与胚胎组织是完全不同的组织，临床上亦容易区分。本专利的***样本即为人流***术所获得的蜕膜组织，是经过专业临床医生挑选后获得的蜕膜组织，不含绒毛等与胚胎组织相关的任何组织，且是在无菌环境下所得，具有很好的安全性，其符合伦理道德，属于一种“废物”重利用，可作为获取子宫内膜干细胞的一种来源。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种安全可靠的蜕膜间充质干细胞的制备方法。

本发明的目的采用以下技术方案实现：

一种蜕膜间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)取样及前处理：取蜕膜组织，用生理盐水洗涤，加入0.8-1.1倍体积的采集液，低温贮存；

2)细胞分离：将经过步骤1)处理后的样品用消毒纱布过滤，对滤液进行病毒检测，若滤液检测结果为阴性，则对对应的过滤的蜕膜组织进行以下操作：用PBS洗涤2次，剪碎，移入离心管，加入等体积0.25％Ⅰ型胶原酶消化30分钟，后加入等体积Chang完全培养基终止消化，离心，弃上清液，用PBS洗涤，加入Chang完全培养基重悬细胞，得到单细胞悬液；

2)细胞分离：将经过步骤1)处理后的样品用消毒纱布过滤，对滤液进行病毒检测，若滤液检测结果为阴性，则对相应的过滤后得到的组织进行以下操作：用PBS洗涤2次，剪碎，移入离心管，加入等体积0.25％Ⅰ型胶原酶消化30分钟，后加入等体积Chang完全培养基终止消化，离心，弃上清液，用PBS洗涤，加入Chang完全培养基重悬细胞，得到单细胞悬液；

3)细胞传代培养：将步骤2)所得的单细胞悬液接种于Chang完全培养基中培养3-4天，更换培养基，弃除未贴壁细胞，以后每2-3天更换培养基一次，待细胞生长达到80％-90％融合时，用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化细胞，加入Chang完全培养基，并收集细胞悬液；将细胞悬液置于离心管中，离心，弃上清液，用PBS洗涤一次，用Chang完全培养基重新悬浮细胞；悬浮后的细胞以5000-6000个/cm²的密度进行接种传代培养，得到纯化的蜕膜间充质干细胞；

4)冻存：将步骤3)蜕膜间充质干细胞用PBS冲洗，加入0.25％的胰蛋白酶消化，加入Chang完全培养基重悬浮，收集悬浮细胞，加入冻存液，先置于装有异丙醇的程序降温盒降温后，转入液氮罐进行冻存。

作为优选，步骤1)中，所述采集液为包含以下组分的DMEM培养基：环丙沙星、卡那霉素和肝素。

作为优选，步骤2)中，所述环丙沙星的浓度为4mg/mL，所述卡那霉素的浓度为10mg/mL，所述肝素的浓度为800单位/L。

作为优选，步骤2)中，所述Chang完全培养基由以下成分组成：MEM alpha培养基、Chang B、Chang C、Penicillin/Streptomycin、L-glutamine和ES-FBS。

作为优选，步骤2)中，每102mL的Chang完全培养基中含有：65mL的MEM alpha培养基、18mL的Chang B、2mL的Chang C、1mL的Penicillin/Streptomycin、1mL的L-glutamine和15mL的ES-FBS，其中，所述L-glutamine的浓度为200mM。

作为优选，步骤2)中，接种的密度为1×10⁵-1×10⁶/mL。

作为优选，步骤3)中，传代培养在37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO₂培养箱中进行。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种从蜕膜组织中制备得到蜕膜间充质干细胞的方法，在建立成熟且安全可靠的分离技术基础上，将获得高纯度、高活率、无污染干细胞，并将其长期储存于液氮中，复苏后可作干细胞移植用，并具有逐渐代替价格昂贵的、难以寻找匹配相合的骨髓干细胞的前景。

附图说明

图1为实施例1培养传代过程中的细胞形态图；

图2为复苏细胞的生长曲线图；

图3为蜕膜间充质干细胞冻存前的流式检测结果图；

图4为蜕膜间充质干细胞复苏后的流式检测结果图；

图5为检测实施例动物试验结果图；

图6为对比例2的P1(A图)、P2代(B图)细胞与实施例1的P1(C图)、P2代(D图)细胞显微视野图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

以下具体实施方式中，如未特殊说明，所采用的供试样品、仪器、试剂等均可通过市售途径获得。

以下具体实施方式中，所采用的蜕膜组织取自宫腔组织，即***术的***样品中所得蜕膜组织，所有***样品收集和使用前均与患者签署知情同意书。

本发明提供的蜕膜间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：

2)细胞分离：将经过步骤1)处理后的样品用消毒纱布过滤，对滤液进行病毒检测，若滤液检测结果为阴性，则对其相应的滤渣进行以下操作：用PBS洗涤2次，剪碎，移入离心管，加入等体积0.25％Ⅰ型胶原酶消化30分钟，后加入等体积Chang完全培养基终止消化，离心，弃上清液，用PBS洗涤，加入Chang完全培养基重悬细胞，得到单细胞悬液；

4)冻存：待步骤3)的细胞，即为蜕膜间充质干细胞，用PBS冲洗，加入0.25％的胰蛋白酶消化，加入Chang完全培养基重悬浮，收集悬浮细胞，加入冻存液，先置于装有异丙醇的程序降温盒降温后，转入液氮罐进行冻存。

上述方法在建立成熟且安全可靠的分离技术基础上，所获得的蜕膜间充质干细胞其纯度可达到95％以上，其高活率、无污染干细胞，并将其长期储存于液氮中，可经复苏做干细胞移植用，并逐渐代替价格昂贵的、难以寻找匹配相合的骨髓干细胞。

以下具体实施例中，所采用的采集液为包含以下组分的DMEM培养基：环丙沙星、卡那霉素和肝素，其配制示例如下：向300mL的DMEM基础培养基加入2000mg的环丙沙星、500mg的卡那霉素和400单位肝素，加DMEM基础培养基定容至500mL，得采集液。该采集液于2-4℃环境下存放。

以下具体实施例中，所采用Chang完全培养基由以下成分组成：MEM alpha培养基、Chang B、Chang C、Penicillin/Streptomycin、L-glutamine和ES-FBS，其配制示例如下：在无菌条件下，在无菌容器中加入65mL的MEM alpha(MEM-alpha培养基，购买自Invitrogen公司)、18mL的Chang B基液(购买自Irvine Scientific公司)、2mL的Chang C基液(购买自Irvine Scientific公司)、1mL的Penicillin/Streptomycin(青霉素/链霉素硫酸盐，购买自Invitrogen公司)、1mL的L-glutamine(L-谷氨酰胺，购买自Invitrogen公司，15mL浓度为200mM的ES-FBS(胎牛血清，购买自Invitrogen公司)，充分混匀。该Chang完全培养基使用前置4℃冰箱待用。

实施例1

一种蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取样及前处理：取蜕膜组织，用生理盐水洗涤3次，加入等体倍体积的采集液，4-10℃贮存；

2)细胞分离：将经过步骤1)处理后的样品用消毒纱布过滤，对滤液进行病毒检测，若滤液检测结果为阴性，则对其相应的过滤后得到的组织进行以下操作：用PBS洗涤2次，用剪刀将滤渣中的组织剪至2mm³大小左右，移入离心管，加入等体积0.25％Ⅰ型胶原酶于37℃消化30分钟，后加入等体积Chang完全培养基终止消化，1200rpm/min离心10min，弃上清液，用PBS洗涤1次，加入Chang完全培养基重悬细胞，得到单细胞悬液；

本步骤中，所述的病毒检测方法包括但不限于通过Elisa进行病毒检测，检测项目包括但不限于HBsAg、HCVAb、HIV-A、TP-PA、CMV-IgM，若为阳性结果，则结束整个储存蜕膜间充质干细胞的程序，蜕膜组织样品不适于进行后续的蜕膜间充质干细胞的制备；

3)细胞传代培养：将步骤2)所得的单细胞悬液接种于含有10mL Chang完全培养基的75cm²的培养瓶中，混合均匀，用台盼蓝染色，数活细胞；根据细胞计数结果，调整细胞密度至1×10⁶/mL；于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO₂培养箱中进行培养3天；在无菌条件下更换培养基，弃除未贴壁细胞，以后每2天更换培养基一次，待细胞生长达到80％-90％融合时，用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化细胞，水平方向轻轻摇晃，使胰酶铺满瓶底，作用1分钟后，倒置显微镜下观察消化效果，待大部分细胞(约80％-90％)缩至圆形后，再加入10ml Chang完全培养基终止消化，并收集细胞悬液；

本步骤中，允许的接种密度为1×10⁵-1×10⁶/mL；本步骤中，在培养过程中，应该保证培养瓶内空气与培养箱内空气相通；

将得到的细胞悬液，置于离心管中，1000rpm离心6min，弃上清液，用PBS洗涤一次，用Chang完全培养基重新悬浮细胞；将重悬浮得到的细胞，以5000-6000个/cm²的密度进行传代接种，在37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO₂培养箱中进行传代培养，记为P1；根据细胞生长情况，每2-3天进行全量或半量换液，直至细胞再次达到80％～90％融合时，细胞铺满瓶底，重复以上操作进行传代，记为P2，依此操作进行传代，即为蜕膜间充质干细胞；

细胞原代培养2-3天全量换液后，去除未贴壁细胞，镜下观察，可见较多几个细胞聚集在一起的克隆，细胞增殖迅速，其倍增时间大约为24-36小时，2天后细胞形态呈均匀长梭形，培养3-4天后细胞可得到80％-90％融合，细胞呈漩涡状分布。传代后细胞24小时内完全贴壁，3-4天可铺满瓶底，继续传代。

图1显示了培养传代过程中的细胞形态图：A是原代培养3天，换液后2天的细胞形态图；B是P1代细胞传代后4天的图，细胞形态基本一致；C是P2代细胞传代后3天的图，D是P7代细胞传代后3天的图，细胞呈漩涡状排列，此时细胞纯度非常高。

以上结果说明，从细胞形态看，本发明分离培养的细胞符合干细胞的特点，细胞的增殖能力较强。

4)冻存：待步骤3)的P1代细胞铺满瓶底后，除去培养液，用PBS冲洗，加入0.25％的胰蛋白酶，保持培养瓶平放使细胞消化，加入Chang完全培养基制成细胞悬液，经1000rpm离心6min，弃上清液，收集悬浮细胞，台盼蓝染色，计算细胞数量和细胞活率，确定细胞活率在80％以上，加入含有等体积冻存液的冻存管，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，密封，放置于已复温好的内部装有异丙醇的程序降盒内，4℃冰箱内放置2h后，再然后转放入-80℃冰箱内实现缓慢降温过程，再放入液氮储存器内保存；

本步骤中，冻存液为20％DMSO与Chang完全培养基按照1:9的体积比混合而得。选择P1代细胞进行冻存，既保证了冻存时细胞的原始状态，也能够使细胞扩增到足够数量级。每个试管内装含有密度为1-2×10⁶/mL的P1代细胞1mL。

检测实施例

1、复苏试验

将实施例1步骤4)冻存后的P1代细胞，从液氮储存罐中取出，立即放入37℃水浴中，轻摇冻存管使其在1分钟内全部融化。

在无菌条件下，将冻存管中样本轻柔吸出，加入含有10ml的Chang完全培养基的50ml无菌离心管中，充分混匀，在4℃、1000rpm的条件下离心6分钟，离心洗涤2-3次，去除管中上清液。重复操作一次。用台盼蓝进行细胞计数及活率分析。按照10000个/cm²的密度(利用Chang完全培养基)将细胞接种到75cm²培养瓶中，放入37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO₂培养箱培养。根据细胞生长情况，每3～4天全量换液一次，代细胞达到80-90％融合时，用浓度为0.25％的胰蛋白酶消化，以5000-6000个/cm²密度传代，复苏后细胞形态正常，增殖速度没有改变，传代至30代左右，细胞出现老化现象，从图2复苏细胞的生长曲线看出，细胞的倍增时间保持在24-26小时。

2、流式检测

选择实施例1中步骤3)得到的P5代的蜕膜间充质干细胞，进行流式检测。每个试管内装有浓度为5×10⁶/mL的P5代细胞2mL。

1)细胞悬液制备

用1ml的0.25％质量浓度胰蛋白酶将细胞消化，500rpm，5min离心，弃上清液。加PBS洗2遍，然后2ml PBS重悬细胞，调节细胞浓度为5×10⁶/mL；

2)4％多聚甲醛(PBS配制)固定15min，然后PBS洗2遍(500rpm，离心5min)；

3)5％的BSA固定40min。

4)根据流式抗体(直标)稀释度要求每10⁶个细胞/200μL分别加入20μL抗体(CD29、CD45、CD105、CD117、CD90、CD34、CD73、CD44、HLA-DR)，避光，37℃孵育30min；

5)用PBS洗一遍，1500rpm，离心5min，弃上清，再加入500μL PBS重悬，准备上机检测。

6)流式细胞仪为美国BD FAC。所用抗体来自贝克顿迪肯森公司(Becton,Dickinson&Company,富兰克林户，NJ)。根据检测的干细胞大小特点利用前向散射光(FS)、侧向散射光(SS)找到目标细胞群。

流式检测的结果如图3和4，图3和4表明，蜕膜间充质干细胞冻存前后表达CD73，CD90，CD105百分比分别为99.7％、98％、99.3％，复苏后细胞CD73，CD90，CD105百分比分别为：98.62％、99.51％、92.68％。

3、致瘤分析

选择实施例1步骤3)所得培养P5代的蜕膜间充质干细胞按如下步骤进行致瘤分析。因胚胎干细胞通常具有致瘤性，在动物试验时动物会长瘤，本实施例进行致瘤分析，以确定该蜕膜间充质干细胞的安全性。1)双层软琼脂集落形成实验

配制双层半固体琼脂培养基，于12孔培养板加入底层琼脂(1.2％)和上层琼脂(0.7％)。

接种200个/mL单位蜕膜间充质干细胞；37℃、饱和湿度、5％CO₂培养箱培养14天，观察克隆总数。

对照组以胃癌细胞株BGC 823代替蜕膜间充质干细胞，接种细胞密度一致。

图4中在体外同等条件下培养14天后细胞生长情况，蜕膜间充质干细胞组不能在软琼脂上增殖、生长，未形成集落，箭头所指为单个悬浮细胞，而实验组肿瘤细胞能无限增殖繁殖，形成肉眼可见的较大集落群。

2)动物实验

将30只，Balb/C裸鼠随机分为3组：A组(n＝10)、B组(n＝10)、C组(n＝10)；进行裸鼠肩胛皮下注射，A组注射3×10⁶/200ul PBS剂量的蜕膜间充质干细胞，B组注射3×10⁶/200ul PBS剂量的胃癌BGC823细胞株，C组注射200ul PBS。正常饲养，于移植后2个月行解剖，观察有无肿瘤形成。

从图5中看出，对照组裸鼠肿瘤生长明显，至60天肿瘤基本上破溃，消瘦死亡，解剖见脾肿大；而蜕膜间充质干细胞组未见肿瘤结节产生，解剖无明显病变，由此可见蜕膜间充质干细胞无致瘤性。这与胚胎干细胞的潜在致瘤性相反，该蜕膜间充质干细胞的蜕膜组织来源不存在伦理问题。

对比例1

与实施例1不同的是，对比例1步骤3)的冻存管利用程序降温仪进行以下降温程序：

第一步、4℃，等待(即温度降至4℃后，进入第二步)；

第二步、1.0℃/每分钟降至-3.0℃(箱体)；

第三步、10.0℃/分钟降至-20.0℃(箱体)；

第四步、1.0℃/分钟降至-40.0℃(箱体)；

第五步、10.0℃/分钟降至-90.0℃(箱体)。

取对比例1获得的P1代细胞，冻存管内为细胞密度是1.5×10⁶/mL的P1代细胞1mL，记为T1；取实施例1步骤3)得到的P2代细胞，冻存管内为细胞密度是1.5×10⁶/mL的P1代细胞1mL，记作T2；按以下步骤进行细胞计数和活率分析：

1)配置4％质量分数的台盼蓝母液存于4℃条件下，使用时用PBS稀释至0.4％。

2)将冻存的样本从液氮储存罐中取出，按照实施例2中的复苏方法进行复苏，离心洗涤后得到细胞悬液。

3)染色：细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9:1混合均匀。

4)计数：染色结束后，立即置于细胞计数仪中，分别计数活细胞和死细胞。

5)统计细胞活力：活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％。

细胞计数和活率分析如表1所示：

表1

冻存降温速度影响冻存后细胞存活率，T2是利用程序降温盒冻存干细胞后再转入液氮，复苏后细胞活率平均为94.30％以上，T1利用程序降温仪程序设置的冻存方法，复苏后细胞活率平均为94.11％。虽然两种方法所获得的干细胞活率相差无几，但程序降温仪仪器本身价格昂贵，冻存成本高，且操作技术要求高，而程序降温盒夹层内装有异丙醇，降温速率1℃/min，复苏后细胞存活率高，接种培养能快速长满，操作简便，采用此种方法冻存间充质干细胞，既节约成本又可保证稳定的冻存效果。

对比例2

采用密度梯度离心法从***样品中制备P1代蜕膜间充质干细胞，具体包括以下步骤：

1)取***样品的滤液1500-2500g离心8-12分钟，分别得位于上层的上清和位于下层的血液；

2)取部分上清液用于病毒检测，如病毒检测为阳性，则结束整个操作；如病毒检测为阴性，则继续进行以下操作：去除其余上清后，得血液；用PBS缓冲液稀释血液，PBS缓冲液与血液和分离液的体积比为1.5-2.5：1；将稀释后的血液加至人淋巴分离液上，稀释后的血液和分离液的体积比为1.8-2.2:1600-1000g离心12-18分钟，离心完毕后，离心管内出现明显的分层；吸出位于中间的单核细胞层(白膜层)，用PBS缓冲液洗涤细胞后离心(洗涤2次，每次均是400g离心10分钟)，最后用Chang完全培养基制成单细胞悬液。

3)将步骤2)得到的单细胞悬液接种于Chang完全培养基中，细胞接种密度为1×10⁵-1×10⁶/mL，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO₂培养箱中进行培养；培养时间为4-5天；4-5天的培养结束后，更换培养基，弃除未贴壁细胞；根据细胞生长状况，每3-4天全量换液一次，待细胞生长达到80％-90％融合时，用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞，然后按5000-6000个/cm²密度传代接种培养，并记为P1代；按此方法传代1次，得P2代。上述过程在37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO₂培养箱中进行。

用显微镜观察对比例2获得的P1及P2代细胞，将其与实施例1获得的P1及P2代细胞进行比较，两种方法所得的细胞显微观察图如图6所示，其中A为对比例2的P1代；B为对比例2的P2代；C为实施例1的P1代；D为实施例1的P2代。对比发现，本申请方法中提到的***组织中分离培养到的干细胞无论是P1代还是P2代其纯度更高，而对比文件方法中的***滤液中所分离培养得到的干细胞在相同代数的时候其含有的杂质细胞更多。平均而言，***组织培养而得的P1代细胞纯度为95％，而***滤液培养而得的P1代细胞纯度为90％左右。

综上所述，本发明方法可以成功从蜕膜组织中分离获得蜕膜间充质干细胞，细胞经过扩增和纯化培养可培养多代；细胞经过冻存后能够复苏继续传代培养，保持干细胞特性。经过流式细胞检测，细胞高表达CD29、CD105、CD90、CD73、CD44，不表达HLA-DR、CD45、CD117、CD34。经过致瘤分析，蜕膜间充质干细胞无致瘤性。采用程序降温盒冻存蜕膜间充质干细胞细胞存活率高，操作简便，冻存效果稳定。以上表明本发明能够有效获得高质量蜕膜间充质干细胞，本发明的蜕膜间充质干细胞分离培养储存方法实际可行，并具有无菌、安全、纯度高、成本低等优点。

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.一种蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4)冻存：将步骤3)蜕膜间充质干细胞用PBS冲洗，加入0.25％的胰蛋白酶消化，加入Chang完全培养基重悬浮，收集悬浮细胞，加入冻存液，先置于装有异丙醇的程序降温盒降温后，再转入液氮罐进行冻存。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述采集液为包含以下组分的DMEM培养基：环丙沙星、卡那霉素和肝素。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述环丙沙星的浓度为4mg/mL，所述卡那霉素的浓度为10mg/mL，所述肝素的浓度为800单位/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述Chang完全培养基由以下成分组成：MEM alpha培养基、Chang B、Chang C、Penicillin/Streptomycin、L-glutamine和ES-FBS。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中，每102mL的Chang完全培养基中含有：65mL的MEM alpha培养基、18mL的Chang B、2mL的Chang C、1mL的Penicillin/Streptomycin、1mL的L-glutamine和15mL的ES-FBS，其中，所述L-glutamine的浓度为200mM。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，接种的密度为1×10⁵-1×10⁶/mL。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中，传代培养在37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO₂培养箱中进行。