CN106188311A - 一种重组肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体蛋白的制备方法与应用 - Google Patents

一种重组肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体蛋白的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组人HM‑TRAIL蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首先构建了一种包含His6‑Myc标签的人重组HM‑TRAIL蛋白表达载体，并利用其构建了一种表达人重组HM‑TRAIL蛋白的重组细菌，通过IPTG诱导重组表达重组人HM‑TRAIL蛋白，然后经提取、纯化，获得了高纯度的HM‑TRAIL蛋白。该重组人HM‑TRAIL蛋白在体外可选择性诱导乳腺癌细胞的凋亡，而不引起乳腺正常细胞的凋亡。本发明制备的重组人HM‑TRAIL蛋白具有稳定性好、溶解度高的特点，可明显诱导肿瘤细胞的凋亡，应用前景良好。

Description

一种重组肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体蛋白的制备方 法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体蛋白的制备方法与应用。
背景技术
肿瘤已成为人类生命健康的严重威胁之一，以手术为主的综合治疗虽然取得了很好的疗效，但术后复发转移仍是影响生存率和死亡率的主要因素。近年来，生物技术给肿瘤的治疗开辟了新的途径。
肿瘤坏死因子(TNF)相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)是TNF超家族的一个成员，可以通过激活外源性凋亡通路诱导凋亡。TRAIL可与两个包含死亡结构域的受体(TRAILR1/DR4和TRAILR2/DR5)结合，从而引发细胞死亡，此外TRAIL也可与两个诱骗受体(TRAILR3/DcR1和TRAILR4/DcR2)结合，起到保护作用。近来，由于TRAIL显著的选择性诱导肿瘤细胞凋亡的特性(不杀伤正常细胞)而被认为是一种潜在的肿瘤治疗药物。TRAIL可以有效的诱导多种肿瘤细胞的凋亡，目前正在进行和已完成的I期和II期临床试验表明TRAIL是一种安全有效的药物。
但单体结构的TRAIL不能诱导细胞凋亡，为实现TRAIL诱导细胞凋亡的目的，现有技术中通过重组TRAIL形成二聚体或多聚体后，与死亡受体相结合而发挥细胞凋亡的作用。但目前已报道的重组TRAIL蛋白的制备过程均存在稳定性差、包涵体复性率不高、易沉淀等问题。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种重组肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体蛋白及其制备方法。本发明将带有His6-Myc标签的氨基酸序列***到位于人TRAIL蛋白的95-281个氨基酸序列之后，得到的重组蛋白称为His6-Myc-TRAIL，简称HM-TRAIL。制备得到的重组人HM-TRAIL蛋白具有显著的诱导细胞凋亡的作用；而且制备过程稳定性好，包涵体复性率高，不易沉淀。
本发明的另一个目的是提供上述重组人HM-TRAIL蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明的第一方面，提供一种重组人HM-TRAIL蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二方面，提供一种编码上述重组人HM-TRAIL蛋白的序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三方面，提供一种重组表达载体，其是由上述核苷酸序列经双酶切***到pQE16表达载体的多克隆位点中制备而成。
本发明的第四方面，提供一种重组细菌，其是由上述重组表达载体转化至E.coliTOP10感受态细菌中制备而成。
本发明的第五方面，提供一种重组人HM-TRAIL蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)将上述重组细菌接种于LB培养基上，进行过夜培养；
(2)将过夜培养的菌种用含氨苄霉素和卡那霉素的LB培养基进行稀释，继续培养至菌液的OD值在600nm处为0.6-0.8；
(3)加入IPTG作为诱导剂，使其终浓度为40μg/ml，诱导培养，使重组细菌表达重组人HM-TRAIL蛋白。
上述方法中：
步骤(1)中，过夜培养的条件为：37℃摇床培养，摇床转速为225-250rpm。
步骤(2)中，所述稀释操作具体为：将过夜培养的菌种用含1：1000氨苄霉素和卡那霉素的LB培养基进行200倍稀释。
步骤(3)中，所述诱导培养的条件为：20-22℃、225-250rpm，培养16-20h。若遇到溶解等问题，可以在18℃环境中进行培养，以提高蛋白的表达量。
上述方法还包括表达产物的分离及纯化的步骤；
所述分离步骤为：将诱导培养后的细菌6000rpm离心15min，收集细菌沉淀；向细菌沉淀中加入细菌裂解液，混匀，得细胞悬液；将得到的细菌悬液进行超声裂解，室温14,000rpm离心15min，分离含有可溶性蛋白的上清，通过用缓冲液进行稀释，或通过截留值为10KD的微孔离心管进行交换，上清用0.22μm的滤器过滤。
所述纯化的步骤为：采用GE HiTrap层析螯合柱，将分离出的含有可溶性蛋白的上清上样，用2-5倍于螯合柱体积的洗脱缓冲液洗脱目标蛋白；
所述洗脱缓冲液的组成为：1MTris-HCl(pH＝7.4)10ml，氯化钠8.19g，β-巯基乙醇0.39065g，咪唑34.0385g，ddH2O至1L。
上述纯化步骤中，在用洗脱缓冲液洗脱目标蛋白之前，还包括：用5倍于螯合柱体积的蒸馏水润洗柱子和用至少5倍于螯合柱体积的结合缓冲液平衡柱子的步骤；
所述结合缓冲液的组成为：1MTris-HCl(pH＝7.4)10ml，氯化钠29.25g，β-巯基乙醇0.39065g，ddH2O至1L。
上述纯化步骤中，在用洗脱缓冲液洗脱目标蛋白之后，还包括：用5倍于螯合柱体积的再生缓冲液重新平衡柱子，然后用5-10倍于螯合柱体积的蒸馏水润洗柱子的步骤；
所述再生缓冲液的组成为：1MTris-HCl(pH＝7.4)10ml，氯化钠29.25g，EDTA14.612g，ddH2O至100ml。
上述重组人HM-TRAIL蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用也是本发明的保护范围；优选的，上述重组人HM-TRAIL蛋白在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
本发明的第六方面，提供一种抗肿瘤药物，其含有上述重组人HM-TRAIL蛋白。
本发明的有益效果：
(1)本发明制备的重组人HM-TRAIL蛋白具有稳定性好、溶解度高的特点，可明显诱导肿瘤细胞的凋亡，应用前景良好。
(2)本申请在制备重组人HM-TRAIL蛋白时所***的His6-Myc标签位于人HM-TRAIL蛋白的95-281个氨基酸序列之后，既能提高重组人HM-TRAIL蛋白的稳定性及可复性，又能为后续的实验同时提供两种蛋白标签，便于纯化及检测，应用前景良好。
(3)大肠杆菌表达***是目前较为常用的外源蛋白表达***，但大肠杆菌的不同菌株在相同的条件下，表现出的特性却迥然不同，因此，为使外源基因得到最佳的表达，需要对大肠杆菌表达***中的宿主菌和表达载体进行筛选和优化。本发明以重组人HM-TRAIL蛋白的表达量为考察指标，对大肠杆菌表达***中的多种表达载体和宿主菌进行了筛选，结果发现，本发明所选用的表达载体pQE16，其分子量相对较小，在细胞内进行扩增时对细胞造成的负荷会小一些，进而载体上所连接的外源基因的拷贝数也相对多，因此，重组蛋白的表达量也会相对增多；另外，菌株与菌株之间重组人HM-TRAIL蛋白的表达量也差异显著，与大肠杆菌表达***中的其他宿主菌相比，本发明所采用的宿主菌E.coli TOP10感受态细菌，其重组人HM-TRAIL蛋白的表达量明显增加。
(4)诱导方式对重组人HM-TRAIL蛋白的表达也有影响，IPTG的加入量、诱导培养的温度和时间是影响重组人HM-TRAIL蛋白表达的关键工艺参数。其中，IPTG在一定浓度范围内能够促进基因的表达，但是，IPTG具有潜在的毒性，且价格较高，IPTG的加入量也不宜过多；本发明对IPTG的加入量进行了优化，结果发现，IPTG的终浓度为40μg/ml时，重组人HM-TRAIL蛋白的表达量最高，而且工艺成本和IPTG潜在的毒性也得到了较好的控制。
诱导培养的温度也是一个关键参数，其对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译分子水平和细胞水平。温度较低的条件下进行目标蛋白的诱导将有利于可溶性蛋白的生产，但蛋白的合成速度比较慢；温度较高则加快蛋白的合成速度，但若蛋白折叠速度跟不上蛋白合成速度，则将导致大量包涵体蛋白的形成。本发明对诱导培养的温度进行了考察，综合平衡刻蛋白的合成速度和可溶性蛋白的含量，最终确定的诱导培养的温度为20-22℃。
诱导培养时间的长短一方面影响外源蛋白的产量，另一方面也会影响发酵周期；本发明考察了不同的诱导时间对表达重组人HM-TRAIL蛋白的变化规律，从而确定了最佳的诱导培养时间为16-20h。
(5)本发明通过对表达载体、宿主菌以及蛋白诱导表达条件的优化，先提高了总的重组人HM-TRAIL蛋白(包括包涵体及可溶性形式的重组人HM-TRAIL蛋白)的表达量，在此基础上再提高可溶性HM-TRAIL蛋白的表达量，从而达到提高单位细胞中重组可溶性HM-TRAIL蛋白产量的目的。采用本发明的方法，总的重组人HM-TRAIL蛋白的表达量最高可达32.6％，可溶性HM-TRAIL蛋白的表达量可达21.4％(本发明中的表达量是指表达的重组人HM-TRAIL蛋白占菌体总蛋白的质量百分数)。
(6)重组蛋白的纯化一直是重组蛋白制备的难点所在，本发明采用GE HiTrap层析螯合柱对制备的重组人HM-TRAIL蛋白进行了纯化，通过对纯化步骤，以及洗脱缓冲液、结合缓冲液和再生缓冲液的优化，提高了制备的重组蛋白的纯度。
附图说明
图1：重组人HM-TRAIL蛋白的SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色的结果；其中，WCL：全细胞裂解产物；FL：未结合流出产物；W：10mM咪唑洗涤液；E1：咪唑洗脱液第一遍；E2：咪唑洗脱液第二遍；
图2：MTT法检测重组人HM-TRAIL诱导各种乳腺细胞系凋亡的作用。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
本发明实施例中所用到的试剂、酶、表达载体等均为现有技术中的常规产品。
实施例1：重组人源HM-TRAIL蛋白的制备
1.pQE16-HM-TRAIL表达载体的构建
将带有His6-Myc标签的氨基酸序列(MRGSHHHHHHGSEQKLISEEDLNLQ)***到位于人TRAIL蛋白的95-281个氨基酸序列后(序列如SEQ ID NO.1)，PCR扩增编码上述重组人HM-TRAIL蛋白的核苷酸序列(序列如SEQ ID NO.2)，并双酶切连接***到pQE16表达载体的多克隆位点中，并测序验证序列。
2.pQE16-HM-TRAIL表达载体的转化(重组细菌的构建)
(1)将保存于-80℃的E.coli TOP10感受态细菌(100ul)取出置于冰上融化。
(2)将连接产物(约20ul)加入感受态细菌中，轻弹EP管底部，混匀后冰浴30min。
(3)将EP管放于42℃水浴中热休克90s，***冰上速冷2-3min。
(4)每管中加900ul不含抗生素的LB培养基，37℃，220rpm振荡1h。
(5)1h后，室温3,000rpm离心5min，弃去950ul上清后，用剩余的50ulLB培养基重悬细菌涂于含抗生素的平板上。
(7)将LB琼脂平板正置于37℃培养箱中，至表面液体被吸收，约0.5-1h。
(8)将平板倒置于37℃培养箱，过夜培养，次日观察平板上菌落的生长情况，能够在平板上生长的细菌克隆为转化子，即转化成功的细菌。
3.菌液扩增及保存
向摇菌管中每管加入约5～8ml的含抗生素(1/1000的氨苄霉素和卡那霉素)的LB培养基，用20ul灭菌枪头尖端挑取LB平板上的单克隆于试管中，37℃，220rpm振荡12～16h，直至菌液OD值为0.4-0.6。得到的菌液可分装至1.5ml EP管中-80℃长期保存。
4.菌种的复苏
为了复苏菌种，用灭菌的接种环轻轻刮取稍微融化的冻存菌株的上表面，然后立即将接种环上蘸取的细菌在含有抗生素的LB平板上划线，将平板放在37℃过夜培养。
5.细菌培养和蛋白诱导
(1)从第4步培养的细菌平板上用灭菌枪头挑取一个单克隆，打入5ml含有LB培养基的试管中进行培养，培养基中加入合适的抗生素，本实验中加入1/1000的氨苄霉素和卡那霉素，过夜培养于37℃摇床(225-250rpm)。
(2)过夜培养的菌种用含1：1000氨苄霉素和卡那霉素的LB培养基进行200倍稀释，将1L的灭菌烧瓶作为摇菌容器，37℃摇3h，待600nm处OD值为0.6-0.8。
(3)用IPTG诱导蛋白表达，往摇好的菌液里加入100mg/ml的IPTG，使其终浓度为40μg/ml。诱导需20-22℃培养18h(225-250rpm)。若遇到溶解等问题，可在18℃环境进行，可提高可溶性蛋白的表达量。
6.目标蛋白提取
(1)将诱导好的细菌6000rpm离心15min。此步细菌沉淀可以直接进行下步或者冻存于-80℃。
(2)准备细菌裂解液：每1ml细菌裂解液(Thermo Fisher)加入2μlDNA酶I+2μl溶菌酶，裂解液中需要加入适量的无EDTA的蛋白酶抑制剂。
(3)称取细菌沉淀，按每1mg细菌沉淀加入4ml细菌裂解液的比例裂解细菌沉淀，涡旋震荡或者用移液器混成均一的细菌悬液，混匀后继续轻柔震荡10min。
(4)将步骤(3)得到的细菌悬液进行超声裂解，以充分破坏细菌细胞壁，进一步提高可溶性蛋白的浓度。超声裂解的具体过程为：将细菌悬液置于冰上，将超声探针***悬液液面以下，以中等频率进行超声，每次持续20s，间歇10s，连续10个循环。
(5)室温14,000rpm离心15min，分离含有可溶性蛋白的上清(非可溶性蛋白在离心沉淀里)，将上清收集到新的离心管中。(注：通常情况下，一般收集大概90％的可溶性蛋白质。再次提取或许能增加产量，但一般没有必要。)
(6)为了减少溶液中的混杂成分，样品应调整缓冲液的组成。可以通过用缓冲液进行稀释，或通过截留值为10KD的微孔离心管进行交换。(注：试剂采用的是特定温和pH值为7.5的20mM TrisHCl的非离子型洗涤剂，没有酶的成分存在。根据特定的蛋白质类型，可添加如盐，溶菌酶，蛋白酶抑制剂，还原剂和螯合剂等成分。)
(7)上清用0.22μm的滤器过滤，等待纯化。
7.目标蛋白纯化(GE HiTrap层析螯合柱)
(1)在10ml注射器中装满蒸馏水，去除螯合柱的停止阀，连接好注射器和螯合柱，连接时避免产生气泡。用10倍于螯合柱体积的蒸馏水润洗柱子。
(2)将0.1M NiSO4溶液2.5ml注入蒸馏水润洗过的5ml层析柱中。
(3)用5倍于螯合柱体积的蒸馏水润洗柱子。
(4)用至少5倍于螯合柱体积的结合缓冲液平衡柱子。
(5)将需纯化的蛋白上柱，推荐的流量是5ml/min。
(6)用至少2倍于螯合柱体积的洗涤缓冲液-1润洗柱子，接着用至少2倍于螯合柱体积的润洗缓冲液-2润洗柱子，留取每步流出液跑PAGE胶。
(7)用2-5倍于螯合柱体积的洗脱缓冲液洗脱目标蛋白，从每一步骤中留取40μl跑PAGE胶。
(8)用5倍于螯合柱体积的再生缓冲液重新平衡柱子，然后用5-10倍于螯合柱体积的蒸馏水润洗柱子。螯合柱可以加20％的乙醇储存于+4～+30℃。
(9)纯化的蛋白需要在含有10mMβ-巯基乙醇的PBS中透析，选用的透析袋截留值为15kD；蛋白存储于-80℃，避免反复冻融。
8.蛋白纯化所需溶液
(1)1MTris-HCl溶液
(2)0.1M硫酸镍溶液
(3)洗涤缓冲液-1
(4)洗涤缓冲液-2
(5)洗脱缓冲液
(6)结合缓冲液
(7)再生缓冲液
重组人HM-TRAIL蛋白的SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色的结果如图1所示。
对比例：重组人源TRAIL蛋白的制备
以pQE9作为表达载体，M15pRep4感受态细菌作为宿主细菌，His6-Myc标签同实施例1，以常规方法构建重组细菌。对构建的重组细菌进行培养和蛋白诱导，以及对目标蛋白进行纯化。
采用SDS-PAGE及岛津薄层扫描仪对实施例1和对比例的重组蛋白的表达效率进行检测，结果为：采用实施例1的方法，总的重组人TRAIL蛋白的表达量为32.6％，可溶性TRAIL蛋白的表达量为21.4％。而采用对比例的方法，总的重组人TRAIL蛋白的表达量为27.1％，可溶性TRAIL蛋白的表达量为16.5％。结果表明，采用本发明的重组蛋白的制备方法，明显提高了目的蛋白和可溶性蛋白的表达量。
实施例2：体外实验
为了研究重组人HM-TRAIL蛋白的在体外对肿瘤细胞凋亡的诱导作用，我们在众多乳腺癌细胞系及正常乳腺上皮细胞系MCF-10A中利用MTT法检测了各种细胞系对HM-TRAIL的敏感性。
1.细胞培养与培养条件
人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231及MDA-MB-468细胞株培养于含10％胎牛血清、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素的DMEM(Dulbecco's改良MEM培养基)高糖培养基中。人乳腺癌细胞株SK-BR-3和ZR-75-1培养于含10％胎牛血清及抗生素的RPMI 1640培养基中。T47D乳腺癌细胞株培养于含10μg/ml牛胰岛素及10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中。所有的细胞均在37℃和5％CO2条件下常规培养。
2.MTT法检测HM-TRAIL对肿瘤细胞凋亡的影响
(1)在96孔板每孔中加100ul含1×103～3×103个靶细胞的细胞悬液，设3-5个复孔，在37℃，5％CO2的培养箱中培养过夜。
(2)培养1-5天后，每孔加20ul MTT染液(5mg/ml溶在PBS里)，在37℃、5％CO2的培养箱中培养4～6h。
(3)缓缓吸出上清培养基，尽量不要吸起紫色沉淀，吸净上清后每孔加入100ul的DMSO溶解紫色沉淀，待沉淀充分溶解后，用酶标仪检测490nm和550nm波长下每孔的吸光度值。
(4)以吸光度值对时间(天数)作图，绘制细胞增殖曲线。
重组人HM-TRAIL处理48h后用MTT法检测各种乳腺癌细胞的存活率，结果如图2所示。表明本发明合成的重组人HM-TRAIL可以显著的诱导肿瘤细胞凋亡。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种重组人HM-TRAIL蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述的重组人HM-TRAIL蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.一种重组表达载体，其是由权利要求2所述的核苷酸序列经双酶切***到pQE16表达载体的多克隆位点中制备而成。
4.一种重组细菌，其是由权利要求3所述的重组表达载体转化至E.coli TOP10感受态细菌中制备而成。
5.一种权利要求1所述的重组人HM-TRAIL蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)将上述重组细菌接种于LB培养基上，进行过夜培养；
(2)将过夜培养的菌种用含氨苄霉素和卡那霉素的LB培养基进行稀释，继续培养至菌液的OD值在600nm处为0.6-0.8；
(3)加入IPTG作为诱导剂，使其终浓度为40μg/ml，诱导培养，使重组细菌表达重组人HM-TRAIL蛋白。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述诱导培养的条件为：20-22℃、225-250rpm，培养16-20h。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括表达产物的分离的步骤；
所述分离步骤为：将诱导培养后的细菌6000rpm离心15min，收集细菌沉淀；向细菌沉淀中加入细菌裂解液，混匀，得细胞悬液；将得到的细菌悬液进行超声裂解，室温14,000rpm离心15min，分离含有可溶性蛋白的上清，通过用缓冲液进行稀释，或通过截留值为10K的微孔离心管进行交换，上清过滤。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括表达产物的纯化的步骤；
所述纯化的步骤为：采用GE HiTrap层析螯合柱，将分离出的含有可溶性蛋白的上清上样，用2-5倍于螯合柱体积的洗脱缓冲液洗脱目标蛋白；
所述洗脱缓冲液的组成为：1MTris-HCl(pH＝7.4)10ml，氯化钠8.19g，β-巯基乙醇0.39065g，咪唑34.0385g，ddH2O至1L。
9.权利要求1所述的重组人HM-TRAIL蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.一种***的药物，其特征在于，所述药物中含有有效量的权利要求1所述的重组人HM-TRAIL蛋白。
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