CN106188244B - 抑制癌细胞活性的短肽治疗剂及含有它的医药组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种短肽治疗剂及含有它的医药组合物，其中短肽治疗剂包括如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的至少一短肽，且此短肽中任一个包括不超过40个氨基酸残基，以抑制癌细胞的增生、癌干原细胞性、移行、侵袭、转移或抗药性等活动。
Description
技术领域
本发明涉及一种肽及其应用，特别是涉及一种抑制癌细胞活性的短肽治疗剂及含有它的医药组合物，以抑制癌细胞的活动。
背景技术
针对已转移或是无法手术根除的恶性肿瘤的癌症患者，在手术切除肿瘤原发部位后，会进一步接受化疗，以抑制潜在癌细胞的增生及转移。然而，即使是宣称化疗成功的癌症患者，仍无法排除癌症复发甚或发展成抗药性癌症的可能性。癌症复发的患者，尤其是化疗过程中产生抗药性的癌症患者，往往因为复发的癌细胞转移更快速，使得危险性剧增。
以肿瘤(carcinoma)为例，目前已知癌细胞会刺激肿瘤周边微环境产生各种发炎因子、白血球、血管过度增生及蛋白酶等，而癌症的慢性发炎反应也与癌细胞的生长、转移与侵袭有关，然而其形成原因及详细机制，仍有诸多未明之处。
肿瘤微环境除了与发炎反应有关之外，其它研究也指出，肿瘤微环境与肿瘤转移及化疗抗药性亦息息相关。肿瘤微环境是由多种基质细胞及其它不同型态的细胞所构成，不仅可保护肿瘤，使肿瘤细胞得以逃脱和抵抗免疫细胞，而造成肿瘤细胞的抗药性。
此外，本发明人过去研究显示，当癌细胞的一种转录因子CCAAT/增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein delta；CEBPD)减少时，也有助于推动其进一步癌化，显示CEBPD表达的再活化，有可能抑制癌细胞的生长。
在肿瘤周边基质组织中的纤维母细胞及巨噬细胞受到CEBPD活化后，会诱导产生分泌型因子-正五聚蛋白相关蛋白(pentraxin-related protein； PTX3)，其具有促进血管新生的活性，且可增加乳癌细胞、肺癌细胞及鼻咽癌细胞的移行及侵入组织(或称侵袭)的能力。另外，本发明人亦已证实，癌周边组织细胞中CEBPD受到活化，亦可能促使癌转移，甚至促使在化疗过程中产生抗药性癌细胞，这些抗药性癌细胞会生长得更快并且更容易转移。
目前市面上虽有一些小分子抗癌药物，例如顺-双氨双氯铂(cis- diamminedichloroplatinum(II)；CDDP；商品名顺铂(Cisplatin))、太平洋紫杉醇(paclitaxel；商品名Taxol)以及5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil；5-FU)等，然而最近的研究发现，上述小分子抗癌药物不仅活化癌细胞中的CEBPD表达，还可活化巨噬细胞及纤维母细胞内CEBPD的表达，反而促使癌细胞产生抗药性并快速转移，导致癌症治疗效果不佳。
有鉴于此，亟需开发一种小分子抗癌药物，以克服已知的小分子抗癌药物会产生肿瘤细胞的抗药性及快速转移等问题。
发明内容
本发明的一个方面是提供一种短肽治疗剂，其包括至少一短肽，且短肽中任一个包括不超过40个氨基酸残基。
本发明的另一方面是提供一种医药组合物，其包含短肽治疗剂及医药学上可接受的载剂，其中短肽治疗剂为活性成分，且包含至少一短肽。
本发明的又一方面是提供一种短肽治疗剂用于制备抑制癌细胞活性的医药组合物的应用，其中医药组合物包含短肽治疗剂及医药学上可接受的载剂，短肽治疗剂为活性成分且包含至少一短肽，以抑制癌细胞的活动。
根据本发明的上述方面，提出一种短肽治疗剂。在一实施例中，此短肽治疗剂可包含如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的至少一短肽，且短肽中任一个包括不超过40个氨基酸残基。
根据本发明的另一方面，提出一种医药组合物。在一实施例中，此医药组合物包含短肽治疗剂及医药学上可接受的载剂，其中短肽治疗剂为活性成分，且包含如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中至少之一，且该短肽治疗剂的任一短肽包括不超过40个氨基酸残基。
根据本发明的又一方面，提出一种短肽治疗剂用于制备抑制癌细胞活性的医药组合物的应用，其中医药组合物包含短肽治疗剂及医药学上可接受的载剂，短肽治疗剂为活性成分。在一实施例中，前述短肽治疗剂包含如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中至少一短肽，且短肽中任一个包括不超过40个氨基酸残基，以于体外专一性抑制癌细胞的活动。
依据本发明一实施例，上述医药组合物可经由皮下注射、肿瘤内注射、静脉注射或口服途径给予。
依据本发明一实施例，上述癌细胞可包括但不限于乳癌、肺癌、鼻咽癌、上皮癌及其任意组合。
依据本发明一实施例，上述活动包括增生(proliferation)、癌干原细胞性(cancer stemness)、移行(migration)、侵袭(invasion)、转移(metastasis)或抗药性(drug resistance)。
应用本发明的抑制癌细胞的短肽治疗剂及含有它的医药组合物，其包括至少一短肽，且此短肽中任一个包括不超过40个氨基酸残基，以抑制 PTX3的活性，进而专一性抑制癌细胞的增生、癌干原细胞性、移行、侵袭、转移或抗药性等活动。
附图说明
为了使本发明的上述和其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，提供附图，其详细说明如下：
图1A绘示根据本发明数个实施例的短肽的氨基酸序列设计图。
图1B绘示于体外利用本发明实施例一的数个短肽与乳癌细胞MB231 共同培养24小时(上图)或48小时(下图)后的细胞存活率(％)柱形图。
图1C示出于体外利用本发明实施例一的数个短肽培养乳癌细胞MB231 达2周后形成细胞球团的影像(左图)及细胞球团数柱形图(右图)(放大倍率为 100倍)。
图1D绘示实施例二的乳癌细胞MB231利用本发明实施例一的数个短肽培养一周后，对CDDP(左图)或5-FU(右图)的抗药性的细胞存活率(％)柱形图。
图1E绘示实施例二的抗药性乳癌细胞MB231R(MBR)利用本发明实施例一的数个短肽培养后的移行细胞数柱形图(左图)或侵袭细胞数柱形图(右图)。
图2A示出于体外利用本发明实施例一的数个短肽培养肺癌细胞A549 达2周后形成细胞球团的影像(左图)及细胞球团数柱形图(右图)(放大倍率为100倍)。
图2B绘示实施例二的肺癌细胞A549利用本发明实施例一的数个短肽培养一周后，对CDDP(左图)或5-FU(右图)的抗药性的细胞存活率(％)柱形图。
图2C绘示实施例二的肺癌细胞A549利用本发明实施例一的数个短肽培养后的移行细胞数柱形图(左图)或侵袭细胞数柱形图(右图)。
图3A示出于体外利用本发明实施例一的数个短肽培养鼻咽癌细胞 HONE1达2周后形成细胞球团的影像(左图)及细胞球团数柱形图(右图)(放大倍率为100倍)。
图3B绘示绘示实施例二的鼻咽癌HONE1细胞利用本发明实施例一的数个短肽培养一周后，对CDDP(左图)或5-FU(右图)的抗药性的细胞存活率 (％)柱形图。
图3C绘示实施例二的鼻咽癌HONE1细胞利用本发明实施例一的数个短肽培养后的移行细胞数柱形图(左图)或侵袭细胞数柱形图(右图)。
图4A绘示于活体内利用本发明实施例一的数个短肽(左图)或并用 CDDP(右图)减缓抗药性乳癌细胞4T1R产生的肿瘤大小的曲线图。
图4B绘示图4A的活体内每个肺中转移性结节数(左图)以及肿瘤重(右图)的柱形图。
图4C示出图4A的活体内不同器官的肿瘤影像及其落射荧光辐射效率。
图4D绘示于活体内利用本发明实施例一的数个短肽(左图)或并用 CDDP(右图)减缓抗药性乳癌细胞MB231R(MBR)产生的肿瘤大小的曲线图。
图4E绘示图4D的活体内每个肺中转移性结节数(左图)以及肿瘤重(右图)的柱形图。
图4F显示图4D的活体内不同器官的肿瘤影像及其落射荧光辐射效率。
图5A绘示根据数个实施例的短肽的氨基酸序列设计图。
图5B绘示于体外利用本发明数个实施例的短肽与多肽减缓euPTX3诱发乳癌细胞MB231的移行细胞数(左图)或侵袭细胞数(右图)的细胞数柱形图。
具体实施方式
承前所述，本发明提供一种短肽治疗剂，其包括至少一短肽，且短肽中任一个包括不超过40个氨基酸残基，以专一性抑制正五聚蛋白相关蛋白 (pentraxin-relatedprotein；PTX3)的活性。
本发明此处所称的「短肽」是指氨基酸残基总数不超过40个的短链多肽。在一实施例中，此短肽治疗剂可包含如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中至少一短肽，其中如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列参见Genbank编号NP_002843.2的序列，在此一并列为本申请的参考文献。在另一实施例中，此短肽治疗剂可同时并用如SEQID NO:1及 SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的二短肽。在此说明的是，倘若多肽的氨基酸残基总数超过40个(例如同时包含SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的多肽)，则由此所得的多肽因分子量较大而难以提高有效剂量，而且也因含有无效的肽片段，而有碍于后续应用至短肽治疗剂。
在一实施例中，如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的短肽可以利用任何已知方式，例如人工合成肽、或利用重组基因于表达***中表达而得的重组蛋白。有关人工合成肽或重组蛋白的制造方法，应为本发明所属技术领域中任何普通技术人员所熟知，在此不另赘述。
本发明此处所称的「专一性抑制PTX3受体与PTX3结合」是指短肽治疗剂利用消耗性抑制或竞争性抑制的方式，进而专一性抑制PTX3受体与内生性PTX3结合。
在一例示中，前述PTX3是作为可溶性受体，而短肽治疗剂可例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，利用「竞争式抑制」的方式，由此降低内生性(或全长)PTX3被活化或与内生性PTX3竞争与其受体结合的机会，进而抑制癌细胞的活动。
在又一例示中，短肽治疗剂可并用SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的二种短肽，以进一步抑制癌细胞的活动。在此说明的是，SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的短肽必需是未经糖化的。倘若短肽预先被糖化，其本身就相当于具有与内生性PTX3相当或相仿的生物活性，则无法通过消耗性抑制或竞争性抑制的方式抑制内生性PTX3的活性。
本发明此处所称的「癌细胞」可包括但不限于乳癌、肺癌、鼻咽癌、上皮癌或上述的任意组合。本发明此处所称的抑制癌细胞的「活动」是指使用本发明的短肽治疗剂处理癌细胞后，可以显著地抑制癌细胞的细胞增生、癌干原细胞性、细胞移行、细胞侵袭、转移或抗药性等。
本发明另提供一种医药组合物，其包含短肽治疗剂及医药学上可接受的载剂，其中短肽治疗剂如上所述，以作为活性成分。
在应用时，本发明的短肽治疗剂是以一有效剂量以及医药学上可接受的载剂合并给予。此处所称的「有效剂量」是指以例如5mg/mL至20mg/mL的剂量一周三次给予。在另一例示中，前述有效剂量为5mg/mL至15mg/mL。在此说明的是，倘若短肽的有效剂量低于5mg/mL，则无法于预设时间内有效减少或抑制PTX3受体与PTX3结合。
本发明此处所称的「医药学上可接受的载剂」是指本身非活性成分，而是用以将活性成分传递至个体的载剂、稀释剂、佐剂及/或媒剂，或添加至上述组合物中以改善组合物的处理或储存性质，或允许或有助于组合物的剂量单位形成适于医药组合物并方便给予的赋形剂或任何物质。前述医药学上可接受的载剂不应破坏活性成分的药理学活性，且在传递足够治疗剂量的活性成分时应无毒性。
前述适用的医药学上可接受的载剂可为一般熟悉制造医药组合物的普通技术人员所熟知，且包括但不限于缓冲剂、稀释剂、崩解剂、黏合剂、黏着剂、湿润剂、聚合物、润滑剂、滑动剂、为遮蔽或抵消不良味道或气味而添加的物质、染料、芳香剂及为改善组合物的外观而添加的物质。前述医药学上可接受的载剂的体例可包括但不限于柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、碳酸氢盐缓冲剂、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸及硫酸的钠盐及钙盐、碳酸镁、滑石、明胶、***胶、海藻酸钠、果胶、糊精、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、蔗糖、淀粉、明胶、纤维素物质(诸如烷酸的纤维素酯及纤维素烷基酯)、低熔点蜡、可可脂、氨基酸、尿素、醇类、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如血清白蛋白)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二甲亚砜 (DMSO)、氯化钠或其它盐、脂质体、甘油或粉末、聚合物(诸如聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯醇及聚乙二醇)及其它医药学上可接受的物质。
在应用时，上述短肽治疗剂及含有它的医药组合物可经由皮下注射、肿瘤内注射、静脉注射或口服途径给予，由此专一性抑制PTX3活性，以抑制癌细胞的活动。具体而言，经体外细胞实验与活体内动物试验证实，本发明的短肽治疗剂及含有它的医药组合物经使用达预设时间，例如4周至10周后，即可抑制癌细胞的活动，例如抑制癌细胞的增生、癌干原细胞性、移行、侵袭或抗药性。
由于本发明的短肽治疗剂，其包括至少一短肽，且此短肽中任一个包括不超过40个氨基酸残基，不仅可抑制PTX3的活性，又可专一性抑制癌细胞的增生、癌干原细胞性、移行、侵袭、转移或抗药性等活动，因此短肽治疗剂可应用于制备专一性抑制PTX3活性的医药组合物。
以下利用数个实施例以说明本发明的应用，然而其并非用以限定本发明，本发明技术领域中普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可作各种修饰与改变。
实施例一：制备短肽治疗剂
在此实施例中，分别使用人工合成的短肽RI37(具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列)、短肽GI40(具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列)以及短肽 KT44(具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列)作为短肽治疗剂，并以多肽 pPTX3/C(具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列)作为对照组。有关短肽 RI37、短肽GI40以及短肽KT44、多肽euPTX3的序列设计如图1A所示，而短肽RI37、短肽GI40、多肽pPTX3/C以及多肽euPTX3的序列设计则如图5A所示。
上述短肽RI37、短肽GI40以及短肽KT44可委托例如科罗耐国际科技有限公司(台北，中国 台湾)进行合成。上述pPTX3/C则为本发明人自行利用已知的原核表达***(大肠杆菌)表达并纯化的重组蛋白。上述多肽euPTX3可例如纯化自小鼠骨髓瘤细胞的PTX3市售商品(R&D system Inc.)。
实施例二：建立细胞试验模式
此实施例利用人类乳癌细胞株(MDA-MB231，其保藏于中国 台湾新竹食品工业发展研究所(FIRDI，中国 台湾300新竹市食品路331号)的生物资源保存及研究中心(BCRC)，保藏编号：BCRC 60425，此细胞株也保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC，P.O.Box1549，Manassas，VA 20108，USA)，保藏编号：ATCC HTB-26；以下简称MB231)或对顺铂具抗药性乳癌细胞株(CDDP- resistant MDA-MB231，MDA-MB231R；以下简称MBR)、人类肺癌细胞株A549(保藏编号：BCRC 60074；ATCC CCL-185)、人类鼻咽癌细胞株 HONE1(Int.J.Cancer.1990 Jan 15；45(1):83-9；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol. 86,pp.9524-9528,December 1989)等，评估实施例一的短肽治疗剂对于癌细胞活动的抑制效果。
上述细胞可使用其专用的细胞培养与继代方式进行培养，举例而言， MDA-MB231细胞、MBR细胞、4T1细胞、4T1R细胞及A549细胞是于含10％胎牛血清蛋白(Fetal BovineSerum；FBS)以及抗生素(50-100μg/mL链霉素及 50-100U/mL的青霉素)的杜贝可氏改良的伊格氏培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM；Gibco Co.)细胞培养液进行培养，HONE1细胞是于含10％FBS以及抗生素的RPMI-1640细胞培养液进行培养，在37℃保持湿度的5％二氧化碳浓度下培养，此为本发明所属技术领域中任何普通技术人员所知，故不另赘述。
实施例三：短肽治疗剂对癌细胞活动的抑制
以下将实施例一的短肽治疗剂分别添加至实施例二的细胞进行共同培养后，根据下述方式进行相关评估。
1.评估短肽对癌细胞存活率的影响
将实施例一的短肽RI37、短肽GI40以及短肽KT44，与实施例二的乳癌细胞MB231共同培养24小时或48小时后，利用MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenoltetrazolium bomide](Sigma)，进行细胞毒性的测试。MTT为四唑盐(tetrazolium salt)，经活细胞内线粒体去氢酶分解后，由透明无色产生蓝色甲臜(formazan)晶体，以未添加实施例一的短肽的细胞存活率作为 100％，由此判断实施例一的短肽对实施例二的乳癌细胞MB231增生的影响。
参阅图1B，其中图1B绘示于体外利用本发明实施例一的数个短肽与乳癌细胞MB231共同培养24小时(图1B上图)或48小时(图1B下图)后的细胞存活率(％)柱形图，其中横轴下方的图号「－」代表细胞培养时未添加特定的短肽，三角形则代表特定的短肽的添加量递增。由图1B的结果可知，本发明实施例一的短肽RI37、短肽GI40以及短肽KT44，分别与乳癌细胞MB231共同培养24小时或48小时后，对于细胞存活率并无显著性的影响。
2.评估短肽对癌细胞的癌干原细胞性的影响
乳癌细胞MB231、肺癌细胞A549及鼻咽癌细胞HONE1具有癌干原细胞性，添加多肽euPTX3可引起前述癌细胞形成细胞球团(sphere)。以下利用实施例一的短肽RI37、短肽GI40、短肽KT44以及多肽euPTX3，与前述癌细胞共同培养，以评估实施例一的数个短肽对癌细胞的癌干原细胞性的影响。
将实施例一的短肽RI37、短肽GI40、短肽KT44(短肽皆为10μg/mL， 225nM)以及多肽euPTX3(2.5μg/mL)，分别与细胞密度5×103细胞/孔的乳癌细胞MB231、肺癌细胞A549及鼻咽癌细胞HONE1，于超低吸附表面多孔培养皿(multi-well plate with ultra-lowattachment surface；Corning Inc.)中，以不含血清(serum-free)的细胞培养基DMEM/F12(Gibco)[含B27(Invitrogen)、20 ng/mL的表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF；Abcam)以及10ng/mL 的碱性纤维母细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF； Peprotech)]，进行共同培养。经培养2周后，以光学显微镜观察细胞球团数。
参阅图1C、图2A及图3A。图1C示出于体外利用本发明实施例一的数个短肽培养乳癌细胞MB231达2周后形成细胞球团的影像(左图)及细胞球团数柱形图(右图)。图2A示出于体外利用本发明实施例一的数个短肽培养肺癌细胞A549达2周后形成细胞球团的影像(左图)及细胞球团数柱形图(右图)。图 3A示出于体外利用本发明实施例一的数个短肽培养鼻咽癌细胞HONE1达2周后形成细胞球团的影像(左图)及细胞球团数柱形图(右图)。图1C、图2A及图 3A的放大倍率皆为100倍，其横轴下方的图号「－」代表细胞培养时未添加特定的短肽。
由图1C、图2A及图3A的结果可知，相较于只添加多肽euPTX3的组别，本发明实施例一的短肽RI37、短肽GI40与多肽euPTX3与乳癌细胞MB231、肺癌细胞A549及鼻咽癌细胞HONE1共同培养后，添加短肽RI37、短肽GI40 的组别确实可抑制多肽euPTX3引起的细胞球团数，且此项差异具有统计显著性。然而，添加短肽KT44并不能抑制多肽euPTX3引起的细胞球团数。
3.评估短肽对癌细胞的抗药性的影响
乳癌细胞MB231、肺癌细胞A549及鼻咽癌细胞HONE1具有抗药性，添加多肽euPTX3可促使前述癌细胞产生抗药性。以下利用实施例一的短肽 RI37、短肽GI40、短肽KT44以及多肽euPTX3，与前述癌细胞共同培养，以评估实施例一的数个短肽对癌细胞的抗药性的影响。
将实施例一的短肽RI37、短肽GI40以及短肽KT44(皆为10μg/mL， 225nM)，分别与1×104个细胞数的乳癌细胞MB231、肺癌细胞A549及鼻咽癌细胞HONE1进行共同培养。经培养1周后，分别添加40μM的顺铂(CDDP)或 100μM的5-氟尿嘧啶(5-FU)后，再培养48小时。以只添加实施例一的多肽 euPTX3(2.5μg/mL)的细胞存活率作为100％，利用前述MTT分析法，评估实施例一的短肽对实施例二的癌细胞抗药性的影响。
参阅图1D、图2B及图3B。图1D绘示实施例二的乳癌细胞MB231利用本发明实施例一的数个短肽培养一周后，对CDDP(左图)或5-FU(右图)的抗药性的细胞存活率(％)柱形图。图2B显示实施例二的肺癌细胞A549利用本发明实施例一的数个短肽培养一周后，对CDDP(左图)或5-FU(右图)的抗药性的细胞存活率(％)柱形图。图3B是实施例二的鼻咽癌HONE1细胞利用本发明实施例一的数个短肽培养一周后，对CDDP(左图)或5-FU(右图)的抗药性的细胞存活率(％)柱形图。图1D、图2B及图3B的横轴下方的图号「－」代表细胞培养时未添加特定的短肽。
由图1D、图2B及图3B的结果可知，相较于未添加多肽euPTX3的组别，只添加多肽euPTX3的组别可以增加乳癌细胞MB231、肺癌细胞A549及鼻咽癌细胞HONE1对CDDP或5-FU的抗药性，提高癌细胞存活率(％)。
然而，添加短肽RI37及短肽GI40的组别确实可抑制多肽euPTX3引起的抗药性，且此项差异具有统计显著性，其中又以短肽RI37的抑制效果较佳，短肽GI40次之，而添加短肽KT44并不能抑制多肽euPTX3引起的抗药性。
4.评估短肽对癌细胞移行的影响
乳癌细胞MB231、肺癌细胞A549及鼻咽癌细胞HONE1可以移行(migration)，添加多肽euPTX3可促进前述癌细胞移行。以下利用实施例一的短肽RI37、短肽GI40、短肽KT44、多肽euPTX3以及多肽pPTX3/C，与前述癌细胞共同培养，以评估实施例一的数个短肽对癌细胞的移行的影响。
将实施例一的短肽RI37、短肽GI40以及短肽KT44，分别将乳癌细胞 MB231、肺癌细胞A549及鼻咽癌细胞HONE1，以5×104细胞/孔的细胞密度接种于24孔细胞培养皿的上层(含有孔径8μm的微孔)中达19个小时，由此判断实施例一的数个短肽对实施例二的癌细胞移行的影响。
将5×104细胞/孔的细胞密度的乳癌细胞MB231、肺癌细胞A549或鼻咽癌细胞HONE1，以5×104细胞/孔的细胞密度接种于博登细胞移行器(Boyden chamber)的上层，并培养3小时。
接着，将上层的细胞培养液更换为不含血清的细胞培养液，并于下层的不含血清的细胞培养基中添加实施例一的短肽RI37、短肽GI40、短肽 KT44、多肽euPTX3以及多肽pPTX3/C。在培养16小时后，以棉棒刮除上层内侧的细胞，利用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole， DAPI；Invitrogen)进行染色，并于荧光显微镜的放大倍率200倍的视野下，计算移动至上层底部外侧的细胞数。
参阅图1E左图、图2C左图、图3C左图以及图5B左图。图1E左图绘示实施例二的抗药性乳癌细胞MB231R(MBR)利用本发明实施例一的数个短肽培养后的移行细胞数柱形图。图2C左图绘示实施例二的肺癌细胞A549利用本发明实施例一的数个短肽培养后的移行细胞数柱形图。图3C左图绘示实施例二的鼻咽癌HONE1细胞利用本发明实施例一的数个短肽培养后的移行细胞数柱形图。其中，图1E左图、图2C左图、图3C左图的多肽euPTX3的添加量为2.5μg/mL，短肽RI37、短肽GI40及KT44的添加量为10μg/mL。
图5B左图绘示实施例二的乳癌细胞MB231利用本发明实施例一的数个短肽与多肽培养后的移行细胞数柱形图，其中多肽euPTX3的添加量为2.5 μg/mL，短肽RI37的添加量3.7μg/mL，短肽GI40的添加量4μg/ml)，多肽 pPTX3/C的添加量10μg/mL，使多肽euPTX3、短肽RI37、短肽GI40以及多肽pPTX3/C的分子数相同。前述图1E左图、图2C左图、图3C左图以及图5B 左图的横轴下方的图号「－」代表细胞培养时未添加特定的短肽。
由图1E左图、图2C左图、图3C左图以及图5B左图的结果可知，相较于未添加多肽euPTX3的组别，只添加多肽euPTX3的组别可以增加抗药性乳癌细胞MB231R、肺癌细胞A549及鼻咽癌细胞HONE1的移行细胞数。然而，添加短肽RI37及短肽GI40的组别确实可抑制多肽euPTX3引起的移行细胞数，且此项差异具有统计显著性，但添加短肽KT44则不能显著抑制多肽 euPTX3引起的移行细胞数。
补充说明的是，图5B左图进一步证实，相较于只添加短肽RI37或短肽 GI40的组别，同时添加短肽RI37及短肽GI40的组别更进一步抑制多肽 euPTX3引起的移行细胞数。虽然添加多肽pPTX3/C可以进一步抑制多肽 euPTX3引起的移行细胞数，但是多肽pPTX3/C分子较大，又同时含有短肽 RI37、短肽KT44及短肽GI40的片段，有碍于后续应用至短肽治疗剂，而且也因分子量较大而难以提高有效剂量。其次，利用E.coli制备的pPTX3/C虽无活化糖基的引入，但考虑由E.coli产生的多肽容易有内毒素(例如LPS)污染的问题，直接使用于治疗时会有较大的风险，故以人工的方式直接化学合成短肽RI37、短肽KT44及短肽GI40，其优势除了分子量较小，也解决了内毒素污染的问题。
5.评估短肽对癌细胞的侵袭能力的影响
乳癌细胞MB231、肺癌细胞A549及鼻咽癌细胞HONE1可以侵袭，添加多肽euPTX3可促进前述癌细胞侵袭。以下利用实施例一的短肽RI37、短肽 GI40、短肽KT44、多肽euPTX3以及多肽pPTX3/C，与前述癌细胞共同培养，以评估实施例一的数个短肽对癌细胞的侵袭的影响。
将5×104细胞/孔的细胞密度的乳癌细胞MB231、肺癌细胞A549或鼻咽癌细胞HONE1，以5×104细胞/孔的细胞密度接种于博登细胞移行器(Boyden chamber)的上层，而上层与下层之间预先以基底膜基质(matrigel，购自BD Bioscience)涂覆的聚对苯二甲酸乙二酯膜(polyethelene terephthalate membrane)分隔，并培养3小时。
接着，将上层的细胞培养液更换为不含血清的细胞培养液，并于下层的不含血清的细胞培养基中添加实施例一的短肽RI37、短肽GI40、短肽KT44、多肽euPTX3以及多肽pPTX3/C。在培养16小时后，以棉棒刮除上层内侧的细胞，利用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；Invitrogen)进行染色，并于荧光显微镜的放大倍率200倍的视野下，计算移动至上层底部外侧的细胞数。
参阅图1E右图、图2C右图、图3C右图以及图5B右图。图1E右图绘示实施例二的抗药性乳癌细胞MB231R(MBR)利用本发明实施例一的数个短肽培养后的侵袭细胞数柱形图。图2C右图绘示实施例二的肺癌细胞A549利用本发明实施例一的数个短肽培养后的侵袭细胞数柱形图。图3C右图绘示实施例二的鼻咽癌HONE1细胞利用本发明实施例一的数个短肽培养后的侵袭细胞数柱形图。其中，图1E右图、图2C右图及图3C右图的多肽euPTX3的添加量为2.5μg/mL，短肽RI37、短肽GI40及KT44的添加量为10μg/mL。
图5B右图绘示实施例二的乳癌细胞MB231利用本发明实施例一的数个短肽与多肽培养后的侵袭细胞数柱形图，其中图5B右图的多肽euPTX3的添加量为2.5μg/mL，短肽RI37的添加量3.7μg/mL，短肽GI40的添加量4 μg/ml)，多肽pPTX3/C的添加量10μg/mL，使多肽euPTX3、短肽RI37、短肽 GI40以及多肽pPTX3/C的分子数相同。前述图1E右图、图2C右图、图3C右图以及图5B右图的横轴下方的图号「－」代表细胞培养时未添加特定的短肽。
由图1E右图、图2C右图、图3C右图以及图5B右图的结果可知，相较于未添加多肽euPTX3的组别，只添加多肽euPTX3的组别可以增加抗药性乳癌细胞MB231R(MBR)、肺癌细胞A549及鼻咽癌细胞HONE1的侵袭细胞数。然而，添加短肽RI37及短肽GI40的组别确实可抑制多肽euPTX3引起的侵袭细胞数，且此项差异具有统计显著性，但添加短肽KT44则不能显著抑制多肽euPTX3引起的侵袭细胞数。
补充说明的是，图5B右图进一步证实，相较于只添加短肽RI37或短肽 GI40的组别，同时添加短肽RI37及短肽GI40的组别更进一步抑制多肽 euPTX3引起的侵袭细胞数。虽然添加多肽pPTX3/C可以进一步抑制多肽 euPTX3引起的细胞侵袭数，但是多肽pPTX3/C分子较大，又同时含有短肽 RI37、短肽KT44及短肽GI40的片段，有碍于后续应用至短肽治疗剂，而且也因分子量较大而难以提高有效剂量。其次，利用E.coli制备的pPTX3/C虽无活化糖基的引入，但考虑由E.coli产生的多肽容易有内毒素(例如LPS)污染的问题，直接使用于治疗时会有较大的风险，故以人工的方式直接化学合成短肽RI37、短肽KT44及短肽GI40，其优势除了分子量较小，也解决了内毒素污染的问题。
实施例四：利用动物试验模式评估短肽对肿瘤的影响
1.建立动物试验模式
此实施例是将1×106的mCherry红荧光蛋白标记的小鼠抗药性乳癌细胞株[mCherry fluorescent CDDP-resistant mouse 4T1(ATCC CRL-2539)，4T1R]，皮下接种至6至8周龄的BALB/c雌性小鼠(购自中国 台湾成功大学动物中心)的背部后侧。接种1周后，小鼠每周以腹腔注射1次5mg/kg的CDDP(溶于1％ (w/v)DMSO)或只有1％(w/v)DMSO，并于肿瘤内不注射或每周注射3次实施例一的短肽RI37、短肽KT44及短肽GI40(皆为50μg)，小鼠于接种癌细胞6 周后牺牲，取出脾、肾、肺及肝，测量其肿瘤重量(每组6重复)，并利用 IVIS光谱成像***(IVIS Spectrum Imaging System 200，Caliper)判断癌细胞的转移活性以及各脏器的转移结节数(number of metastatic nodules per organ)。肿瘤大小通过市售的外部测径器测量，并利用下式(I)计算肿瘤体积 (V)：
V＝(w×l2)×0.52 (I)
在式(I)中，w为肿瘤宽度，l为肿瘤长度。每一项实验条件至少重复三次。
另外，将1×106的mCherry红荧光蛋白标记的人类抗药性乳癌细胞株 (mCherryfluorescent CDDP-resistant MDA-MB-231，MB231R)，皮下接种至 6至8周龄的NOD-SCID雌性免疫缺陷小鼠(购自中国 台湾成功大学动物中心)的背部后侧。接种1周后，小鼠每周以腹腔注射1次5mg/kg的CDDP(溶于1％ (w/v)DMSO)或只有1％(w/v)DMSO，并于肿瘤内不注射或每周注射3次实施例一的短肽RI37、短肽KT44及短肽GI40(皆为50μg)，小鼠于接种癌细胞10周后处死，取出脾、肾、肺及肝，测量其肿瘤重量(每组3重复)，并利用 IVIS光谱成像***判断癌细胞的转移活性以及各脏器的转移结节数。肿瘤大小是通过市售的外部测径器量测，并利用上式(I)计算肿瘤体积(V)。每一项实验条件至少重复三次。
2.评估短肽对同种移植肿瘤的影响
参阅图4A，其绘示于活体内利用本发明实施例一的数个短肽(左图)或并用CDDP(右图)减缓4T1R抗药性乳癌肿瘤大小的曲线图。由图4A的结果可知，本发明实施例一的短肽RI37及短肽GI40皆可抑制肿瘤的成长，并降低抗药性乳癌细胞4T1R产生的肿瘤的抗药性，其中又以短肽RI37的抑制效果较佳，短肽GI40次之，而短肽KT44并无显著抑制效果。
参阅图4B，其绘示图4A的活体内每个肺中转移性结节数(左图)以及肿瘤重(右图)的柱形图。由图4B的结果可知，本发明实施例一的短肽RI37及短肽GI40皆可抑制肿瘤的转移及成长，其中又以短肽RI37的抑制效果较佳，短肽GI40次之，而短肽KT44并无显著抑制效果。
参阅图4C，其示出图4A的活体内不同器官的肿瘤影像及其落射荧光(epifluorescence)辐射效率。由图4C的结果可知，本发明实施例一的短肽 RI37及短肽GI40皆可抑制活体内肿瘤的转移及成长，而短肽KT44并无显著抑制效果，在肺脏可发现有癌细胞转移的结节。
3.评估短肽对异种移植肿瘤的影响
参阅图4D，其绘示于活体内利用本发明实施例一的数个短肽(左图)或并用CDDP(右图)减缓MB231R(MBR)抗药性乳癌肿瘤大小的曲线图。由图4D 的结果可知，本发明实施例一的短肽RI37及短肽GI40皆可抑制肿瘤的成长，并降低抗药性乳癌细胞MB231R(MBR)产生的肿瘤的抗药性，其中又以短肽RI37的抑制效果较佳，短肽GI40次之，而短肽KT44并无显著抑制效果。
参阅图4E，其绘示图4D的活体内每个肺中转移性结节数(左图)以及肿瘤重(右图)的柱形图。由图4E的结果可知，本发明实施例一的短肽RI37及短肽 GI40皆可抑制肿瘤的转移及成长，其中又以短肽RI37的抑制效果较佳，短肽GI40次之，而短肽KT44并无显著抑制效果。
参阅图4F，其示出图4D的活体内不同器官的肿瘤影像及其落射荧光辐射效率。由图4F的结果可知，本发明实施例一的短肽RI37及短肽GI40皆可抑制活体内肿瘤的转移及成长，而短肽KT44并无显著抑制效果，在肺脏可发现有癌细胞转移的结节。
上述实施例的数据皆是将每一时间点及每一样品的三个重复实验数据，正负其平均标准差而获得，所有的值皆通过单因子变异数分析(one way ANOVA)而分析。上述实施例的图号＊代表具有统计显著性(p＜0.05)的数据，图号＊＊代表具有统计显著性(p＜0.01)的数据，图号＊＊＊代表具有统计显著性(p＜0.001)的数据。
综上所述，由上述数个实施例证实，使用本发明实施例一氨基酸残基不超过40个的短肽RI37和/或短肽GI40，可有效抑制内生性PTX3的活性，进而专一性抑制癌细胞的增生、癌干原细胞性、移行、侵袭、转移或抗药性等活动。因此，本发明实施例一的短肽可作为短肽治疗剂，应用于制备专一性抑制PTX3活性的医药组合物。
需补充的是，本发明虽以特定范围的短肽、特定的工艺、特定的分析方法或特定仪器作为例示，说明本发明抑制正五聚蛋白相关蛋白活性的短肽治疗剂及含有它的医药组合物，但本发明所属技术领域中任何普通技术人员可知，本发明并不限于此，在不脱离本发明的精神和范围内，本发明的短肽治疗剂及含有它的医药组合物亦可使用更短的短肽、其它工艺、其它分析方法或其它仪器进行。
由上述实施例可知，本发明的短肽治疗剂及含有它的医药组合物，其优点在于使用氨基酸残基不超过40个的短肽RI37和/或短肽GI40，可有效抑制内生性PTX3的活性，进而专一性抑制癌细胞的增生、癌干原细胞性、移行、侵袭、转移或抗药性等活动。
虽然本发明已以数个实施例揭露如上，然而其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中任何普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可作各种修改与改变，因此本发明的保护范围以所附权利要求书中所界定为准。
Claims (7)
1.一种短肽治疗剂，由如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的至少一短肽，且该短肽中任一个包括不超过40个氨基酸残基。
2.一种医药组合物，包含一短肽治疗剂及一医药学上可接受的载剂，其中该短肽治疗剂为活性成分，该短肽治疗剂是由如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成的至少一短肽，且该短肽中任一个包括不超过40个氨基酸残基。
3.一种短肽治疗剂用于制备抑制癌细胞活性的医药组合物的应用，其中该医药组合物包含一短肽治疗剂及一医药学上可接受的载剂，该短肽治疗剂为活性成分，该短肽治疗剂是由如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成的至少一短肽，且该短肽中任一个包括不超过40个氨基酸残基，以于体外专一性抑制癌细胞的活动。
4.根据权利要求3所述的短肽治疗剂用于制备抑制癌细胞活性的医药组合物的应用，其中该医药组合物是经由皮下注射、肿瘤内注射、静脉注射或口服途径给予。
5.根据权利要求3所述的短肽治疗剂用于制备抑制癌细胞活性的医药组合物的应用，其中该癌细胞选自由乳癌细胞、肺癌细胞、鼻咽癌细胞以及上述的任意组合所组成的族群。
6.根据权利要求3所述的短肽治疗剂用于制备抑制癌细胞活性的医药组合物的应用，其中该活动包括癌干原细胞性、移行、侵袭
7.一种短肽治疗剂用于制备抑制癌细胞活性的医药组合物的应用，其中该医药组合物包含一短肽治疗剂及一医药学上可接受的载剂，该短肽治疗剂为活性成分，该短肽治疗剂是由如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成的至少一短肽，且该短肽中任一个包括不超过40个氨基酸残基，以专一性抑制肿瘤的转移及成长。
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