CN106188055B - 利用酶辅助络合萃取法从长春花中提取分离长春质碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用酶辅助络合萃取法从长春花中提取分离长春质碱的方法，包括以下步骤：(1)酶辅助超声提取长春花中的长春质碱，将提取液减压浓缩；(2)以D2EHPA作为络合剂，石油醚作为稀释剂，组成萃取体系，对浓缩液进行络合萃取，得到富含长春质碱的萃取液；(3)利用稀盐酸反萃，得到长春质碱粗品；(4)纯化。本发明根据长春质碱包含胺基，显示碱性的结构特点，利用酸性的络合剂D2EHPA，对其进行络合萃取，使长春质碱和络合剂反应形成络合物，并转移至萃取相内，再利用稀盐酸进行反萃，使长春质碱得以回收。本发明的提取方法有效提高了长春质碱的回收率，且络合萃取的萃取剂能够循环利用，不会造成环境的污染。
Description
技术领域
本发明涉及一种从长春花中高效提取长春质碱的方法，具体涉及一种利用酶辅助络合萃取法从长春花中提取分离长春质碱的方法。
背景技术
长春花(Catharanthus roseus)是夹竹桃科长春花属一种重要的药用植物，原产南亚、非洲东部及美洲热带。在我国主要分布于江苏、浙江、福建、江西、四川及河南等地。长春花全草均可入药，含有长春碱、文多灵、长春质碱、阿玛碱、蛇根碱、长春新碱等多种萜类吲哚生物碱，具有很高的药用价值。其中，长春质碱不仅具有抗肿瘤活性，还具有降血糖、血压、镇痛等作用，同时，长春质碱还是合成长春瑞滨、长春氟宁等长春碱类抗肿瘤药物的中间体。
国内外对提取分离长春花生物碱的研究由来已久，但是由于长春花中吲哚生物碱种类较多，且在植物中的含量很低，一般都在万分之几，因此长春花中吲哚生物碱的提取分离成为制约长春碱类药物工业化发展的瓶颈。目前，我国相关企业的提取技术得率低、资源浪费大，且产品质量达不到国际标准(纯度>98％)，只能生产纯度较低的粗提物或原料药，很难满足国际市场的需求。少数企业产品质量虽能达到要求，但得率低，造成了大量的资源浪费和严重的环境污染。此外，由于我国野生长春花的过度采收，长春花的资源储量大量锐减，已经处于濒危的边缘，长春花生物原料的匮乏也严重制约长春碱类药物产业的发展。因此如何提高长春花生物资源的利用率，开发高效分离纯化长春花类生物碱的方法，已经成为当务之急。
在植物活性成分提取过程中，由于植物细胞外存在较厚细胞壁，细胞内部的目标产物不容易释放到溶剂中，阻碍了有效成分的提取率。利用生物酶等可以破坏植物细胞外结构，提升目标成分的溶出率。
萃取分离法以其分离效率高、生产能力大，便于快速连续和安全操作以及能耗低等优点被广泛研究。根据萃取原理，在萃取操作中，萃取剂与溶质之间不发生化学反应的萃取称为物理萃取；萃取剂和溶质之间发生化学反应的萃取成为化学萃取。根据溶质与萃取剂之间发生的化学反应机理，化学萃取还可大致分为五类：络合反应、阳离子交换反应、离子缔合反应、加和反应和带同萃取反应等。络合萃取是基于可逆络合反应的原理，溶液中待分离溶质与含有络合剂的萃取剂接触，络合剂与待分离溶质发生反应形成络合物，并使其转移至萃取相内。然后，根据溶剂摆动效应，进行反萃，溶质得以回收，萃取剂循环使用。因此，络合萃取法具有高效性、高选择性和成本低的优点，可以用于长春花中长春碱类生物碱的分离纯化。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种简单、高效的利用酶辅助络合萃取法从长春花中提取分离长春质碱的方法。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
利用酶辅助络合萃取法从长春花中提取分离长春质碱的方法，包括以下步骤：
(1)酶辅助超声提取
取长春花地上部分阴干并粉碎，得到长春花干粉，加入混合酶液孵化，过滤，留长春花粉末，在长春花粉末中加入乙醇，并用盐酸调节pH至5.6-6.8，超声提取；过滤，留提取液，将提取液减压浓缩，得到浓缩液；
(2)络合萃取富集
以二(2-乙基己基)磷酸作为络合剂，石油醚作为稀释剂，组成萃取体系，对浓缩液进行络合萃取，分离上层液，得到富含长春质碱的萃取液；
(3)反萃分离
将富含长春质碱的萃取液用稀盐酸反萃，稀盐酸层减压浓缩后，冷冻干燥，得到长春质碱粗品；
(4)纯化
将所得的长春质碱粗品进行重结晶，即得。
步骤(1)中的混合酶液包括：纤维素酶3-6U/ml、果胶酶4-8U/ml和半纤维素酶6-9U/ml。
步骤(1)中的混合酶液pH为4.0-7.0，混合酶液中还包括金属离子Fe2+、Co2+、Mn2+、Ca2+中的一种或多种，金属离子的总质量分数为1％。
所述孵化的温度为25-50℃，时间为4-6h。
所述乙醇的加入量为5倍过滤得到的长春花粉末的重量，乙醇的体积分数为70-80％。
步骤(1)中超声提取3-4次，每次4-6h。
步骤(1)和(3)中减压浓缩的真空度为﹣0.9MPa，转速为150-180转/秒。
步骤(2)中二(2-乙基己基)磷酸和石油醚的体积比为1:1-3，萃取体系和浓缩液的体积比为1-3:1，萃取次数为3-5次。
步骤(3)中稀盐酸的质量分数为1-3％，稀盐酸与萃取液的体积比为1-3:1，反萃次数为3-5次。
步骤(4)长春质碱粗品进行重结晶的具体方法为：将长春质碱粗品用超纯水溶解，用氨水将pH调至8-9后，在20-25℃下搅拌5-6h，然后静置12-24h，即得。
步骤(4)中长春质碱粗品用超纯水溶解至终浓度为4-6g/L。
本发明的有益效果：
1、长春质碱的结构中包含胺基，显示碱性。本发明根据长春质碱的结构特点，利用酸性的络合剂二(2-乙基己基)磷酸，对其进行络合萃取，使长春质碱和络合剂反应形成络合物，并转移至萃取相内。然后，根据摆动效应，利用稀盐酸进行反萃，使长春质碱得以回收，萃取剂循环使用。
2、由于植物细胞外存在较厚细胞壁，细胞内部的目标产物不容易释放到溶剂中，阻碍了有效成分的提取。因此本发明利用纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶等破坏植物细胞外结构，提高目标成分的溶出率。另外，本发明还在混合酶液中添加了金属离子，能够提高混合酶液中酶的活性，进一步提高目标成分的溶出率。
3、本发明能够从长春花中高效分离长春质碱，有效提高了长春花的资源利用率，且络合萃取的萃取剂能够循环利用，不会造成环境的污染。
4、本发明的方法分离纯化的长春质碱纯度能够达到99％以上，回收率可达92％以上，是长春碱类提取物分离纯化的一大创新，具有很高的研究和推广价值。
5、本发明的方法简单、操作方便、生产成本低，易于工业化推广，具有很好的社会和经济效益。
附图说明
图1为本发明的长春质碱纯化产物的紫外光谱图。
图2为长春质碱标准品的紫外光谱图。
图3为本发明的长春质碱纯化产物的质谱图。
图4为本发明的萃取液在230nm下HPLC色谱图。
图5为本发明的长春质碱纯化产物在230nm下HPLC色谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
本发明减压浓缩所用的设备为旋转蒸发器。
实施例1
利用酶辅助络合萃取法从长春花中提取分离长春质碱的方法，包括以下步骤：
(1)酶辅助超声提取
取100g长春花地上部分阴干并粉碎成粉末，得到长春花干粉，加入400ml混合酶液孵化，孵化的温度为25℃，时间为6h；孵化结束后，过滤，留长春花粉末，加入长春花粉末5倍重量的体积分数70％乙醇，并用盐酸调节pH至5.6，超声提取3次，每次6h；过滤，留提取液，将提取液减压浓缩，得到浓缩液；
所述的混合酶液包括：纤维素酶3U/ml，果胶酶4U/ml，半纤维素酶6U/ml；混合酶液的pH为4.0，混合酶液中还包括金属离子Ca2+，Ca2+的质量分数为1％；
减压浓缩的真空度为﹣0.9MPa，转速为150转/秒；
(2)络合萃取富集
以二(2-乙基己基)磷酸(D2EHPA)作为络合剂，石油醚作为稀释剂，组成萃取体系，对浓缩液进行络合萃取，D2EHPA和石油醚的体积比为1:1，分离上层液，得到富含长春质碱的萃取液；萃取体系和浓缩液的体积比为1:1，萃取次数为3次；
(3)反萃分离
将富含长春质碱的萃取液用质量分数为3％稀盐酸反萃，稀盐酸与萃取液的体积比为1:1，反萃次数为4次，稀盐酸层减压浓缩后，冷冻干燥，得到长春质碱粗品；
减压浓缩的真空度为﹣0.9MPa，转速为150转/秒；
(4)纯化
将所得的长春质碱粗品进行重结晶，具体方法为：将长春质碱粗品用超纯水溶解至终浓度为4g/l，用氨水将pH调至9后，在25℃下搅拌6h，然后静置24h，即得。
实施例2
利用酶辅助络合萃取法从长春花中提取分离长春质碱的方法，包括以下步骤：
(1)酶辅助超声提取
取100g长春花地上部分阴干并粉碎成粉末，得到长春花干粉，加入400ml混合酶液孵化，孵化的温度为30℃，时间为6h；孵化结束后，过滤，留长春花粉末，加入长春花粉末5倍重量的体积分数70％乙醇，并用盐酸调节pH至5.8，超声提取4次，每次5h；过滤，留提取液，将提取液减压浓缩，得到浓缩液；
所述的混合酶液包括：纤维素酶4U/ml，果胶酶5U/ml，半纤维素酶7U/ml；混合酶液的pH为5.0；
减压浓缩的真空度为﹣0.9MPa，转速为180转/秒；
(2)络合萃取富集
以D2EHPA作为络合剂，石油醚作为稀释剂，组成萃取体系，对浓缩液进行络合萃取，D2EHPA和石油醚的体积比为1:2，分离上层液，得到富含长春质碱的萃取液；萃取体系和浓缩液的体积比为2:1，萃取次数为4次；
(3)反萃分离
将富含长春质碱的萃取液用质量分数为3％稀盐酸反萃，稀盐酸与萃取液的体积比为2:1，反萃次数为3次，稀盐酸层减压浓缩后，冷冻干燥，得到长春质碱粗品；
减压浓缩的真空度为﹣0.9MPa，转速为180转/秒；
(4)纯化
将所得的长春质碱粗品进行重结晶，具体方法为：将长春质碱粗品用超纯水溶解至终浓度为5g/l，用氨水将pH调至8后，在20℃下搅拌6h，然后静置20h，即得。
实施例3
利用酶辅助络合萃取法从长春花中提取分离长春质碱的方法，包括以下步骤：
(1)酶辅助超声提取
取100g长春花地上部分阴干并粉碎成粉末，得到长春花干粉，加入400ml混合酶液孵化，孵化的温度为40℃，时间为5h；孵化结束后，过滤，留长春花粉末，加入长春花粉末5倍重量的体积分数80％乙醇，并用盐酸调节pH至6.2，超声提取3次，每次5h；过滤，留提取液，将提取液减压浓缩，得到浓缩液；
所述的混合酶液包括：纤维素酶5U/ml，果胶酶8U/ml，半纤维素酶9U/ml；混合酶液的pH为6.0，混合酶液中还包括金属离子Mn2+，Mn2+的质量分数为1％；
减压浓缩的真空度为﹣0.9MPa，转速为160转/秒；
(2)络合萃取富集
以D2EHPA作为络合剂，石油醚作为稀释剂，组成萃取体系，对浓缩液进行络合萃取，D2EHPA和石油醚的体积比为1:2，分离上层液，得到富含长春质碱的萃取液；萃取体系和浓缩液的体积比为3:1，萃取次数为4次；
(3)反萃分离
将富含长春质碱的萃取液用质量分数为1％稀盐酸反萃，稀盐酸与萃取液的体积比为2:1，反萃次数为5次，稀盐酸层减压浓缩后，冷冻干燥，得到长春质碱粗品；
减压浓缩的真空度为﹣0.9MPa，转速为160转/秒；
(4)纯化
将所得的长春质碱粗品进行重结晶，具体方法为：将长春质碱粗品用超纯水溶解至终浓度为6g/l，用氨水将pH调至9后，在25℃下搅拌5h，然后静置12h，即得。
实施例4
利用酶辅助络合萃取法从长春花中提取分离长春质碱的方法，包括以下步骤：
(1)酶辅助超声提取
取100g长春花地上部分阴干并粉碎成粉末，得到长春花干粉，加入400ml混合酶液孵化，孵化的温度为50℃，时间为4h；孵化结束后，过滤，留长春花粉末，加入长春花粉末5倍重量的体积分数80％乙醇，并用盐酸调节pH至6.8，超声提取4次，每次4h；过滤，留提取液，将提取液减压浓缩，得到浓缩液；
所述的混合酶液包括：纤维素酶6U/ml，果胶酶7U/ml，半纤维素酶8U/ml；混合酶液的pH为7.0，混合酶液中还包括金属离子Fe2+，Fe2+的质量分数为1％；
减压浓缩的真空度为﹣0.9MPa，转速为150转/秒；
(2)络合萃取富集
以D2EHPA作为络合剂，石油醚作为稀释剂，组成萃取体系，对浓缩液进行络合萃取，D2EHPA和石油醚的体积比为1:3，分离上层液，得到富含长春质碱的萃取液；萃取体系和浓缩液的体积比为3:1，萃取次数为5次；
(3)反萃分离
将富含长春质碱的萃取液用质量分数为2％稀盐酸反萃，稀盐酸与萃取液的体积比为3:1，反萃次数为3次，稀盐酸层减压浓缩后，冷冻干燥，得到长春质碱粗品；
减压浓缩的真空度为﹣0.9MPa，转速为150转/秒；
(4)纯化
将所得的长春质碱粗品进行重结晶，具体方法为：将长春质碱粗品用超纯水溶解至终浓度为4g/l，用氨水将pH调至9后，在25℃下搅拌6h，然后静置24h，即得。
对照例1
从长春花中提取分离长春质碱的方法，包括以下步骤：
(1)无酶辅助超声提取
取100g长春花地上部分阴干并粉碎成粉末，得到长春花干粉，加入长春花干粉5倍重量的体积分数80％乙醇，并用盐酸调节pH至6.8，超声提取4次，每次6h；过滤，留提取液，将提取液减压浓缩，得到浓缩液；
减压浓缩的真空度为﹣0.9MPa，转速为150转/秒；
(2)络合萃取富集
以D2EHPA作为络合剂，石油醚作为稀释剂，组成萃取体系，对浓缩液进行络合萃取，D2EHPA和石油醚的体积比为1:1，分离上层液，得到富含长春质碱的萃取液；萃取体系和浓缩液的体积比为2:1，萃取次数为4次；
(3)反萃分离
将富含长春质碱的萃取液用质量分数为3％稀盐酸反萃，稀盐酸与萃取液的体积比为2:1，反萃次数为4次，稀盐酸层减压浓缩后，冷冻干燥，得到长春质碱粗品；
减压浓缩的真空度为﹣0.9MPa，转速为150转/秒；
(4)纯化
将所得的长春质碱粗品进行重结晶，具体方法为：将长春质碱粗品用超纯水溶解至终浓度为4g/l，用氨水将pH调至9后，在25℃下搅拌6h，然后静置24h，即得。
对照例2
从长春花中提取分离长春质碱的方法，包括以下步骤：
(1)酶辅助超声提取
取100g长春花地上部分阴干并粉碎成粉末，得到长春花干粉，加入400ml混合酶液孵化，孵化的温度为50℃，时间为4h；孵化结束后，过滤，留长春花粉末，加入长春花粉末5倍重量的体积分数80％乙醇，并用盐酸调节pH至6.8，超声提取4次，每次4h；过滤，留提取液，将提取液减压浓缩，得到浓缩液；
所述的混合酶液包括：纤维素酶6U/ml，果胶酶7U/ml，半纤维素酶8U/ml；混合酶液的pH为7.0，混合酶液中还包括金属离子Fe2+，Fe2+的质量分数为1％；
减压浓缩的真空度为﹣0.9MPa，转速为150转/秒；
(2)普通萃取富集
调节浓缩液pH至7.8，以氯仿为萃取剂，对浓缩液进行萃取，萃取剂和浓缩液的体积比为2:1，萃取次数为4次，分离上层液，得到富含长春质碱的萃取液，减压浓缩，冷冻干燥，得到长春质碱粗品；
减压浓缩的真空度为﹣0.9MPa，转速为150转/秒；
(3)纯化
将所得的长春质碱粗品进行重结晶，具体方法为：将长春质碱粗品用超纯水溶解至终浓度为4g/l，用氨水将pH调至9后，在25℃下搅拌6h，然后静置24h，即得。
对照例3
从长春花中提取分离长春质碱的方法，包括以下步骤：
(1)无酶辅助超声提取
取100g长春花地上部分阴干并粉碎成粉末，得到长春花干粉，加入长春花干粉5倍重量的体积分数80％乙醇，并用盐酸调节pH至6.8，超声提取4次，每次6h；过滤，留提取液，将提取液减压浓缩，得到浓缩液；
减压浓缩的真空度为﹣0.9MPa，转速为150转/秒；
(2)普通萃取富集
调节浓缩液pH至7.8，以氯仿为萃取剂，对浓缩液进行萃取，萃取剂和浓缩液的体积比为2:1，萃取次数为4次，分离上层液，得到富含长春质碱的萃取液，减压浓缩，冷冻干燥，得到长春质碱粗品；
减压浓缩的真空度为﹣0.9MPa，转速为150转/秒；
(3)纯化
将所得的长春质碱粗品进行重结晶，具体方法为：将长春质碱粗品用超纯水溶解至终浓度为4g/L，用氨水将pH调至9后，在25℃下搅拌6h，然后静置24h，即得。
实验例
1、产物分析
1.1、紫外光谱分析
采用紫外光谱仪对本发明实施例1的纯化产物与长春质碱标准品同时进行检测，结果见图1和2。结果表明，本发明的纯化产物与长春质碱标准品的紫外光谱结果一致。
1.2、质谱分析
采用质谱仪对本发明实施例1的结晶产物进行检测，结果见图3。将本发明的纯化产物质谱数据与已知长春质碱标准品质谱数据对比，结果表明，本发明的纯化产物与已知长春质碱质谱数据一致。
1.3、HPLC法检测
产物的HPLC检测：采用Waters Symmetry 300 C18液相色谱柱，以乙腈：水(乙腈和水均含1％甲酸)为流动相，流速1ml/min，梯度洗脱(30-90％，30min)，检测波长230nm，可以得到较好的色谱分析结果。
检测对象：富含长春质碱的萃取液、纯化产物。
结果分析：HPLC分析结果见图4、5。图4表明，萃取液中有较高含量的目标物，萃取具有较高选择性；图5表明，通过重结晶，纯化产物纯度达到99％以上。
1.4、回收率
以实施例1-4和对照例1-3的萃取液为样品，研究不同提取纯化方法对长春质碱的提取分离效果，采用高效液相色谱技术检测各个样品浓度，计算各个方法的得率(表1)。
表1目标产物得率的结果分析
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 对照例1 | 对照例2 | 对照例3 | |
| 得率(％) | 93.2 | 92.3 | 92.4 | 93.1 | 82.1 | 80.1 | 70.1 |
从表1中可以看出，本发明采用酶辅助超声提取和络合萃取相结合的方法，从长春花中提取分离长春质碱，其长春质碱的得率明显高于单独采用酶辅助超声提取或络合萃取的提取方法，更是远远高于既没有采用酶辅助超声提取，也没有采用络合萃取的提取方法，因此可以说明，本发明的酶辅助络合萃取法能够显著提高从长春花中提取分离长春质碱的得率，有效提高了长春花的资源利用率。
Claims (6)
1.利用酶辅助络合萃取法从长春花中提取分离长春质碱的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)酶辅助超声提取
取长春花地上部分阴干并粉碎，得到长春花干粉，加入混合酶液孵化，过滤，留长春花粉末，在长春花粉末中加入乙醇，并用盐酸调节pH至5.6-6.8，超声提取；过滤，留提取液，将提取液减压浓缩，得到浓缩液；
(2)络合萃取富集
以二(2-乙基己基)磷酸作为络合剂，石油醚作为稀释剂，组成萃取体系，对浓缩液进行络合萃取，分离上层液，得到富含长春质碱的萃取液；
(3)反萃分离
将富含长春质碱的萃取液用稀盐酸反萃，稀盐酸层减压浓缩后，冷冻干燥，得到长春质碱粗品；
(4)纯化
将所得的长春质碱粗品进行重结晶，即得；
步骤(1)中的混合酶液包括：纤维素酶3-6U/mL、果胶酶4-8U/mL和半纤维素酶6-9U/mL；
步骤(1)中的混合酶液pH为4.0-7.0，混合酶液中还包括金属离子Fe2+、Co2+、Mn2+、Ca2+中的一种或多种，金属离子的总质量分数为1％；
步骤(4)长春质碱粗品进行重结晶的具体方法为：将长春质碱粗品用超纯水溶解，用氨水将pH调至8-9后，在20-25℃下搅拌5-6h，然后静置12-24h，即得；
步骤(4)中长春质碱粗品用超纯水溶解至终浓度为4-6g/L。
2.根据权利要求1所述的利用酶辅助络合萃取法从长春花中提取分离长春质碱的方法，其特征在于，所述孵化的温度为25-50℃，时间为4-6h。
3.根据权利要求1所述的利用酶辅助络合萃取法从长春花中提取分离长春质碱的方法，其特征在于，所述乙醇的加入量为5倍过滤得到的长春花粉末的重量，乙醇的体积分数为70-80％。
4.根据权利要求1所述的利用酶辅助络合萃取法从长春花中提取分离长春质碱的方法，其特征在于，步骤(1)中超声提取3-4次，每次4-6h。
5.根据权利要求1所述的利用酶辅助络合萃取法从长春花中提取分离长春质碱的方法，其特征在于，步骤(2)中二(2-乙基己基)磷酸和石油醚的体积比为1:1-3，萃取体系和浓缩液的体积比为1-3:1，萃取次数为3-5次。
6.根据权利要求1所述的利用酶辅助络合萃取法从长春花中提取分离长春质碱的方法， 其特征在于，步骤(3)中稀盐酸的质量分数为1-3％，稀盐酸与萃取液的体积比为1-3:1，反萃次数为3-5次。
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