CN106173182A - 高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法 - Google Patents

高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及蛋白粉的制备方法。更具体地说，本发明涉及高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法，包括：取新鲜或冷冻禽肝切碎后，匀浆、脱脂，离心后收集沉淀物；将得到的沉淀物干燥粉碎后得到脱脂禽肝粉，将脱脂禽肝粉与氢氧化钠溶液混合，并置于超声反应器中进行间歇式超声提取，每超声第一预定时间后，间歇第二预定时间，然后超声第三预定时间后，间歇第四预定时间，如此反复，超声时间为10～20min；离心取上层清液，用盐酸溶液滴至蛋白质的等电点，离心收集沉淀物，冷冻干燥后得到禽肝蛋白粉；第四预定时间、第三预定时间、第二预定时间和第一预定时间依次增大。本发明提供了一种处理时间短，蛋白得率高，能耗低的高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法。

Description

高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法
技术领域
本发明涉及一种蛋白粉的制备方法。更具体地说，本发明涉及一种高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法。
背景技术
从肝脏中提取蛋白的方法很多，主要有水溶液提取法、等电点提取法、有机溶剂提取法、蔗糖密度梯度离心法和超声波萃取法等。其中水溶液提取法、等电点提取法和超声波萃取法都存在提取率低、提取蛋白不完全等不足。而有机溶剂提取存在环境污染和不能食用等缺点。且使用以上提取方法主要集中于对肝蛋白多肽的活性研究，以开发蛋白类药物为目的的少量提取，蛋白得率低。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种操作简单，处理时间短，蛋白得率高，能耗低的高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法。
为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、取新鲜或冷冻禽肝切碎后，向切碎的禽肝中以料液比为1:1～3加入生理盐水，将混合物在5000～10000rpm下匀浆1～3min后，再以料液比为1:4～5加入乙醇溶液，于65～75℃水浴中脱脂25～30min，将混合物在4000～6000rpm下离心4～8min后，收集沉淀物；
步骤二、将步骤一得到的沉淀物干燥粉碎后得到脱脂禽肝粉，将所述脱脂禽肝粉与pH 11.0～12.0的氢氧化钠溶液按照料液比为1:30～35混合，并置于超声反应器中进行间歇式超声提取，每超声第一预定时间后，间歇第二预定时间，然后超声第三预定时间后，间歇第四预定时间，如此反复，超声功率为50～150W，超声时间为10～20min，超声温度为30～35℃；
步骤三、在将步骤二中超声后的混合物离心得到上清液后，再向所述上清液中加入1～2倍体积的蒸馏水，置于搅拌机中先以转速为2000～3000rpm顺时针搅拌10～15min，静置5～8min，再以转速为1000～2000rpm逆时针搅拌20～30min，静置15min后，离心收集沉淀物，然后按照料液比为1：2加入质量浓度为1.0％的氯化钠溶液，60℃搅拌20min，再用0.3～0.4mol/L的盐酸溶液滴至蛋白质的等电点，再次离心后收集沉淀物，冷冻干燥后得到禽肝蛋白粉；
其中，所述第二预定时间大于第一预定时间，第三预定时间大于第二预定时间，第四预定时间大于第三预定时间。
优选的是，所述的高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法中，所述第一预定时间为4s，所述第二预定时间为5s，第三预定时间为6s，第四预定时间为7s。
优选的是，所述的高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法中，所述步骤二中，将步骤一得到的沉淀物置于40～60℃的鼓风烘箱中干燥24～48h，再置于粉碎机中粉碎至60～100目备用。
优选的是，所述的高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法中，所述乙醇溶液的体积浓度大于等于80％。
优选的是，所述的高乳化禽肝蛋白粉的制备方法中，所述步骤三中，将再次离心后收集的沉淀物于-80～-70℃预冻，然后在大气压力为10～100Pa，温度为-70～-55℃下冷冻干燥24～72h，得到干燥的禽肝蛋白粉。
优选的是，所述的高乳化禽肝蛋白粉的制备方法中，所述禽肝为鸡肝、鸭肝、鹅肝或鸽肝中的任一种。
本发明至少包括以下有益效果：利用本发明的方法得到的禽肝蛋白粉得率为61.9％(w/w)，蛋白纯度为70.2％(w/w)，和常规碱提法比较，蛋白提取率增加了26.3％(w/w)，纯度提高了9.7％(w/w)。与常规碱提法相比，本发明的超声辅助碱提法极大地改善了禽肝蛋白的乳化性质，采用超声辅助碱提法提取后，禽肝蛋白的乳化指数提高了19.1％～32.3％，乳化稳定性提高了16.5％～28.9％。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的禽肝蛋白粉超声辅助碱提法和常规碱提法的差示量热扫描对比图；
图2为本发明的禽肝蛋白粉超声辅助碱提法和常规碱提法的色谱对比图；
图3为禽肝蛋白粉常规碱提法的扫描电镜图；
图4为禽肝蛋白粉超声辅助碱提法的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、取新鲜或冷冻禽肝切碎后，向切碎的禽肝中以料液比为1:1～3加入生理盐水，将混合物在5000～10000rpm下匀浆1～3min后，以将禽肝与生理盐水混合，打碎组织，使细胞膜中的蛋白充分释放出来，再以料液比为1:4～5加入乙醇溶液，于65～75℃水浴中脱脂25～30min，乙醇溶液的加入使得脱脂更快，更加充分，将混合物在4000～6000rpm下离心4～8min后，收集沉淀物。
步骤二、将步骤一得到的沉淀物干燥粉碎后得到脱脂禽肝粉，将所述脱脂禽肝粉与pH 11.0～12.0的氢氧化钠溶液按照料液比为1:30～35混合，并置于超声反应器中进行间歇式超声提取，每超声第一预定时间后，间歇第二预定时间，然后超声第三预定时间后，间歇第四预定时间，如此反复，超声功率为50～150W，超声时间为10～20min，超声温度为30～35℃。其中，所述第二预定时间大于第一预定时间，第三预定时间大于第二预定时间，第四预定时间大于第三预定时间。分阶段进行超声提取，使得提取更加充分、均匀，同时缩短了超声提取的时间。
步骤三、在将步骤二中超声后的混合物离心得到上清液后，再向所述上清液中加入1～2倍体积的蒸馏水，置于搅拌机中先以转速为2000～3000rpm顺时针搅拌10～15min，静置5～8min，再以转速为1000～2000rpm逆时针搅拌20～30min，静置15min后，离心收集沉淀物，然后按照料液比为1：2加入质量浓度为1.0％的氯化钠溶液，60℃搅拌20min，再用0.3～0.4mol/L的盐酸溶液滴至蛋白质的等电点，再次离心后收集沉淀物，冷冻干燥后得到禽肝蛋白粉。超声后的混合物经过搅拌机的再次顺时针搅拌和逆时针搅拌，通过机械切割撞击使得搅拌更加充分均匀，蛋白质的粒径更小，结构更加疏松，乳化性能得到进一步提高。离心收集的沉淀物与氯化钠溶液混合后，有助于蛋白的溶解，从而更充分地发挥其表面活性作用，提高了蛋白的乳化效果。
所述的高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法中，所述第一预定时间为4s，所述第二预定时间为5s，第三预定时间为6s，第四预定时间为7s，以使超声波的能量充分释放到混合物中，且不引起过高的温度。且超声时间短长间隔，以使得超声混合更加均匀，且混合物保持在一定的范围内。
所述的高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法中，所述步骤二中，将步骤一得到的沉淀物置于40～60℃的鼓风烘箱中干燥24～48h，再置于粉碎机中粉碎至60～100目备用。
所述的高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法中，所述乙醇溶液的体积浓度大于等于80％。
所述的高乳化禽肝蛋白粉的制备方法中，所述步骤三中，将再次离心后收集的沉淀物于-80～-70℃预冻，以使得沉淀物中的水分凝结为固态，在后期冷冻干燥时，固态水直接升华为气态，然后在大气压力为10～100Pa，温度为-70～-55℃下冷冻干燥24～72h，得到干燥的禽肝蛋白粉。
所述的高乳化禽肝蛋白粉的制备方法中，所述禽肝为鸡肝、鸭肝、鹅肝或鸽肝中的任一种。
对比例
一种高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、取新鲜或冷冻鸡肝切碎后，向切碎的鸡肝中以料液比为1:3加入生理盐水，将混合物在10000rpm下匀浆3min后；再以料液比为1:5加入体积分数为80％的乙醇溶液，于75℃水浴中脱脂30min，将混合物在6000rpm下离心8min后，收集沉淀物。
步骤二、将步骤一得到的沉淀物置于60℃的鼓风烘箱中干燥48h，再置于粉碎机中粉碎至100目后得到脱脂鸡肝粉。将所述脱脂鸡肝粉与pH 12.0的氢氧化钠溶液按照料液比为1:35混合。
步骤三、将步骤二中的混合物离心取上层清液，用0.4mol/L的盐酸溶液滴至蛋白质的等电点，再次离心后收集沉淀物，于-70℃预冻，然后在大气压力为100Pa，温度为-55℃下冷冻干燥72h，得到干燥的鸡肝蛋白粉。
实施例1
一种高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、取新鲜或冷冻鸡肝切碎后，向切碎的鸡肝中以料液比为1:3加入生理盐水，将混合物在10000rpm下匀浆3min后；再以料液比为1:5加入体积分数为80％的乙醇溶液，于75℃水浴中脱脂30min，将混合物在6000rpm下离心8min后，收集沉淀物。
步骤二、将步骤一得到的沉淀物置于60℃的鼓风烘箱中干燥48h，再置于粉碎机中粉碎至100目后得到脱脂鸡肝粉。将所述脱脂鸡肝粉与pH 12.0的氢氧化钠溶液按照料液比为1:35混合，并置于超声反应器中进行间歇式超声提取，每超声4s后，间歇5s，然后超声6s后，间歇7s，如此反复，超声功率为150W，超声时间为20min，超声温度为35℃。
步骤三、在将步骤二中超声后的混合物离心得到上清液后，再向所述上清液中加入2倍体积的蒸馏水，置于搅拌机中先以转速为3000rpm顺时针搅拌15min，静置8min，再以转速为2000rpm逆时针搅拌30min，静置15min后，离心收集沉淀物，然后按照料液比为1：2加入质量浓度为1.0％的氯化钠溶液，60℃搅拌20min，再用0.4mol/L的盐酸溶液滴至蛋白质的等电点，再次离心后收集沉淀物，于-70℃预冻，然后在大气压力为100Pa，温度为-55℃下冷冻干燥72h，得到干燥的鸡肝蛋白粉。
本发明实施例1的超声辅助碱提法提取的蛋白质的粒径减小了26％-34％。如图3和4所示的扫描电镜图片显示，超声后蛋白的结构变得疏松，蛋白表面的空洞明显增加，表面疏水性增加了49％-63％。如图1和2所示的差示量热扫描的温度动态函数和色谱图中，其中，图1中的曲线1为超声辅助碱提法提取的鸡肝蛋白的热流随温度变化的趋势，曲线2为常规碱提法提取的鸡肝蛋白的热流随温度变化的趋势，点3处为超声辅助碱提法中峰值热焓为3.317J/g，点4处为常规碱提法中峰值热焓为5.691J/g，超声辅助碱提法相比于常规碱提法，峰值温度(Td)升高了22％-35％，热焓(ΔH)降低了28％-42％；图2中曲线1为常规碱提法提取的鸡肝蛋白的色谱图，曲线2为超声辅助碱提法提取的鸡肝蛋白的色谱图，从图2中可以看出蛋白分子的二级结构中α-螺旋和无规则卷曲分别降低了15％-26％和17％-23％，β-折叠和β-卷曲分别增加了9％-15％和41％-54％。以上结果说明，超声对鸡肝蛋白的空间结构产生了影响，一些极性基因能离子化，使得与原料中各种离子之间相引相斥，蛋白质二级结构中的四个含量发生改变，形成松散结构，导致蛋白质内部的疏水基团暴露出来，破坏了蛋白质的非共价结合力，进一步使蛋白质的粒径分布减小。与常规碱提法相比，蛋白空间结构的变化和粒径的减小又导致了差示量热扫描中的Td的升高和ΔH的降低；蛋白提取率增加了26.3％(w/w)，纯度提高了9.7％(w/w)，如表1所示；乳化活性指数(EAI)提高了19.1％～32.3％，乳化稳定指数(ESI)提高了16.5％～28.9％，如表2所示。
表1对比例和实施例1的最终蛋白含量和最终回收率的对比
表1中同一列的不同字母表示具有显著性差异，P<0.05。
表2对比例和实施例1在不同浓度时乳化活性指数和乳化稳定指数的对比
表2中在同一方案的同一列中的不同的小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)。
表2中在同一溶液浓度时同一列中的不同的大写字母表示具有显著性差异(P<0.05)。
实施例2
一种高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、取新鲜或冷冻鹅肝切碎后，向切碎的鹅肝中以料液比为1:1加入生理盐水，将混合物在5000rpm下匀浆1min后；再以料液比为1:4加入体积分数为99％的乙醇溶液，于65℃水浴中脱脂25min，将混合物在4000rpm下离心4min后，收集沉淀物。
步骤二、将步骤一得到的沉淀物置于40℃的鼓风烘箱中干燥24h，再置于粉碎机中粉碎至60目后得到脱脂鹅肝粉。将所述脱脂鹅肝粉与pH 11.0的氢氧化钠溶液按照料液比为1:30混合，并置于超声反应器中进行间歇式超声提取，每超声4s后，间歇5s，然后超声6s后，间歇7s，如此反复，超声功率为50W，超声时间为10min，超声温度为30℃。
步骤三、在将步骤二中超声后的混合物离心取上层清液后，再向所述上清液中加入1倍体积的蒸馏水，置于搅拌机中先以转速为2000rpm顺时针搅拌10min，静置5min，再以转速为1000rpm逆时针搅拌20min，静置15min后，离心收集沉淀物，然后按照料液比为1：2加入质量浓度为1.0％的氯化钠溶液，60℃搅拌20min，再用0.3mol/L的盐酸溶液滴至蛋白质的等电点，再次离心后收集沉淀物，于-80℃预冻，然后在大气压力为10Pa，温度为-70℃下冷冻干燥24h，得到干燥的鹅肝蛋白粉。
利用本实施例的方法得到的鹅肝蛋白粉得率为67.5％(w/w)，蛋白纯度为75.7％(w/w)，和常规碱提法比较，蛋白提取率增加了30.1％(w/w)，纯度提高了11.3％(w/w)。本实施例的超声辅助碱提法极大地改善了鹅肝蛋白的乳化性质，鹅肝蛋白的乳化指数提高了22.9％～37.8％，乳化稳定性提高了19.6％～35.2％。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (6)

1.一种高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、取新鲜或冷冻禽肝切碎后，向切碎的禽肝中以料液比为1:1～3加入生理盐水，将混合物在5000～10000rpm下匀浆1～3min后，再以料液比为1:4～5加入乙醇溶液，于65～75℃水浴中脱脂25～30min，将混合物在4000～6000rpm下离心4～8min后，收集沉淀物；
步骤二、将步骤一得到的沉淀物干燥粉碎后得到脱脂禽肝粉，将所述脱脂禽肝粉与pH11.0～12.0的氢氧化钠溶液按照料液比为1:30～35混合，并置于超声反应器中进行间歇式超声提取，每超声第一预定时间后，间歇第二预定时间，然后超声第三预定时间后，间歇第四预定时间，如此反复，超声功率为50～150W，超声时间为10～20min，超声温度为30～35℃；
步骤三、在将步骤二中超声后的混合物离心得到上清液后，再向所述上清液中加入1～2倍体积的蒸馏水，置于搅拌机中先以转速为2000～3000rpm顺时针搅拌10～15min，静置5～8min，再以转速为1000～2000rpm逆时针搅拌20～30min，静置15min后，离心收集沉淀物，然后按照料液比为1：2加入质量浓度为1.0％的氯化钠溶液，60℃搅拌20min，再用0.3～0.4mol/L的盐酸溶液滴至蛋白质的等电点，再次离心后收集沉淀物，冷冻干燥后得到禽肝蛋白粉；
其中，所述第二预定时间大于第一预定时间，第三预定时间大于第二预定时间，第四预定时间大于第三预定时间。
2.如权利要求1所述的高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法，其特征在于，所述第一预定时间为4s，所述第二预定时间为5s，第三预定时间为6s，第四预定时间为7s。
3.如权利要求1所述的高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，将步骤一得到的沉淀物置于40～60℃的鼓风烘箱中干燥24～48h，再置于粉碎机中粉碎至60～100目备用。
4.如权利要求1所述的高乳化性禽肝蛋白粉的制备方法，其特征在于，所述乙醇溶液的体积浓度大于等于80％。
5.如权利要求1所述的高乳化禽肝蛋白粉的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，将再次离心后收集的沉淀物于-80～-70℃预冻，然后在大气压力为10～100Pa，温度为-70～-55℃下冷冻干燥24～72h，得到干燥的禽肝蛋白粉。
6.如权利要求1所述的高乳化禽肝蛋白粉的制备方法，其特征在于，所述禽肝为鸡肝、鸭肝、鹅肝或鸽肝中的任一种。
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