CN106170550A - 用于产生导引rna的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开内容的多个方面和实施方案涉及组合多种哺乳动物RNA调控策略的方法和组合物，包括在人细胞中的RNA三螺旋结构、内含子、微小RNA，以及带有基于Cas的CRISPR转录因子的核酶，以及基于核糖核酸酶的RNA加工。在一些实施方案中，本公开内容的所述方法和组合物使得能够从单个紧凑的RNA聚合酶II表达的转录本多重产生蛋白质和多种导引RNA，以用于合成构建体和内源人启动子的有效调节。

Description

用于产生导引RNA的方法和组合物
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求提交于2014年4月3日的美国临时申请号61/974,672的权益，其通过引用整体并入本文。
联邦政府资助的研究
本发明根据由陆军研究办公室(Army Research Office)颁发的合同No.W911NF-11-2-0056在政府支持下完成。政府享有本发明中的某些权利。
技术领域
本公开内容的一些方面涉及生物技术。具体而言，一些实施方案涉及转录调控和合成生物学领域。
背景技术
最近，细菌II型CRISPR/Cas***(成簇的、规律间隔的短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关***(Cas)，clustered，regularly interspaced，short palindromicrepeats/CRISPR associate system)已经适用于获得可编程的DNA结合，而不需要复杂的蛋白质改造。Cas蛋白为专门用于切割DNA的核酸酶。在II型CRISPR/Cas***中，所述CasDNA结合蛋白的序列特异性通过导引RNA(guide RNA，gRNA)确定，其具有与靶DNA位点的核苷酸碱基配对互补性。这使得能够简单且高度灵活地编程Cas结合。
发明内容
在哺乳动物细胞(例如人细胞)中构建基于CRISPR的线路(circuit)的主要挑战是多个gRNA对于获得所需的激活水平经常是必需的，特别是与内源启动子相互作用的情况下。目前的技术依赖于使用多个gRNA表达构建体，每个构建体具有其各自的启动子。在一些实施方案中，本文描述的经改造构建体可用于从单个转录本中表达许多功能gRNA，从而使得对具有多个输出的合成基因线路进行紧凑的编码(compact encoding)，以及用于调节天然基因和重接(rewire)天然网络的简洁策略成为可能。因此，在一些实施方案中，本文提供了方法和组合物(例如核酸和细胞)，其使得能够通过整合基于核糖核酸(ribonucleicacid，RNA)的调控机制，如RNA干扰和CRISPR/Cas***，产生可扩展的合成基因线路和/或对内源基因及基因网络进行修饰。例如，本文的多个实施方案在人细胞中，将多个哺乳动物RNA调控策略(包括RNA三螺旋结构、内含子、微小RNA(microRNA)以及核酶)与基于细菌Cas的CRISPR转录因子(CRISPRtranscription factors，CRISPR-TF)以及基于核糖核酸酶(例如基于Cas6/Csy4)的RNA处理相组合，以修饰基因表达。出人意料的是，本公开内容的互补方法使得能够从通过RNA聚合酶II(RNA polymerase II，RNA pol II或RNAP II)启动子产生的转录本表达功能gRNA，同时允许目的蛋白质的共表达。此外，在一些实施方案中，本文提供的遗传构建体使得能够从单个转录本多重表达蛋白质和/或RNA干扰分子(例如微小RNA)以及多个gRNA，以用于对合成构建体和内源人启动子进行有效的调节。
本文提供的经改造构建体可用于例如实施可调的合成基因线路，包括多阶段转录级联。此外，在一些实施方案中，本公开内容的方法和组合物可用于在具有多个输出和反馈环(feedback loop)的RNA依赖性基因线路中重接调控连接，以实现复杂的功能行为。本文提供的经改造构建体对于基础生物学、治疗以及合成生物学应用之例如人细胞中的可扩展基因线路的构建，以及天然调控网络进行调节(例如微扰)是有价值的。
本公开内容的多个方面提供了经改造构建体，其包含与核酸有效相连的启动子，所述核酸包含(a)编码至少1个导引RNA(gRNA)的核苷酸序列；以及(b)选自以下的一个或更多个核苷酸序列：(i)编码目的蛋白质的核苷酸序列和(ii)编码RNA干扰分子的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述启动子为RNA聚合酶II依赖性(RNA pol II)启动子。
在一些实施方案中，至少1个gRNA的侧翼为编码核糖核酸酶识别位点的核苷酸序列。所述核糖核酸酶识别位点可以为例如Csy4核糖核酸酶识别位点。
在一些实施方案中，至少1个gRNA的侧翼为编码核酶的核苷酸序列。所述核酶可以选自例如锤头状核酶(hammerhead ribozyme)和丁型肝炎病毒核酶(Hepatitis deltavirus ribozyme)。
在一些实施方案中，(a)所述的核苷酸序列的侧翼为同源内含子剪接位点(cognate intronic splice sites)。
本公开内容的一些方面提供了经改造构建体，其包含与核酸有效相连的启动子，所述核酸包含编码至少1个导引RNA(gRNA)的第一核苷酸序列，所述gRNA的侧翼为核糖核酸酶识别位点。在一些实施方案中，所述启动子为RNA聚合酶II依赖性(RNA pol II)启动子。所述RNA pol II启动子可为例如人巨细胞病毒启动子、人泛素启动子、人组蛋白H2A1启动子或人炎性趋化因子CXCL1启动子。
在一些实施方案中，所述第一核苷酸序列的侧翼为同源内含子剪接位点。
在一些实施方案中，所述核酸还包含编码目的蛋白质的第二核苷酸序列。所述第一核苷酸序列可在所述第二核苷酸序列内，或者所述第二核苷酸序列可在所述第一核苷酸序列的上游。
在一些实施方案中，所述经改造构建体还包含编码至少1个微小RNA的核苷酸序列。可例如在所述目的蛋白质内编码微小RNA。
在一些实施方案中，所述核酸还包含编码三螺旋结构的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第二核苷酸序列与所述第一核苷酸序列之间。
在一些实施方案中，所述第一核苷酸序列编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或更多个gRNA，每个gRNA的侧翼为核糖核酸酶识别位点。
在一些实施方案中，所述第一核苷酸序列编码至少2个侧翼为核糖核酸酶识别位点的gRNA，并且其中所述gRNA彼此不同。
在一些实施方案中，所述核糖核酸酶识别位点为Csy4核糖核酸酶识别位点。每个所述Csy4核糖核酸酶识别位点的长度可为例如28个核苷酸。在一些实施方案中，所述Csy4核糖核酸酶识别位点来自于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
在一些实施方案中，所述三螺旋结构由来自于MALAT1基因座的3’末端或MENβ基因座的3’末端的核苷酸序列编码。
本公开内容的一些方面提供了经改造构建体，其包含与核酸有效相连的启动子，所述核酸包含编码目的蛋白质的第一核苷酸序列，以及编码至少1个侧翼为核糖核酸酶识别位点的导引RNA(gRNA)的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列的侧翼为编码同源内含子剪接位点的核苷酸序列并且位于所述第一核苷酸序列内。在一些实施方案中，所述启动子为RNA聚合酶II依赖性(RNA pol II)启动子。所述RNA pol II启动子可为例如人巨细胞病毒启动子、人泛素启动子、人组蛋白H2A1启动子或人炎性趋化因子CXCL1启动子。
在一些实施方案中，所述经改造构建体还包含编码至少1个微小RNA的核苷酸序列。可例如在目的蛋白质内编码微小RNA。
在一些实施方案中，所述核酸还包含编码三螺旋结构的第三核苷酸序列，以及编码至少1个侧翼为核糖核酸酶识别位点的gRNA的第四核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第一核苷酸序列的下游，并且在所述第四核苷酸序列的上游。
在一些实施方案中，所述第二核苷酸序列编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或更多个gRNA，每个gRNA的侧翼为核糖核酸酶识别位点。
在一些实施方案中，所述第二核苷酸序列编码至少2个侧翼为核糖核酸酶识别位点的gRNA，并且其中所述gRNA彼此不同。
在一些实施方案中，所述核糖核酸酶识别位点为Csy4核糖核酸酶识别位点。所述Csy4核糖核酸酶识别位点的长度可为例如28个核苷酸。在一些实施方案中，所述Csy4核糖核酸酶识别位点来自于铜绿假单胞菌。
在一些实施方案中，所述同源内含子剪接位点来自于共有内含子(consensusintron)。在一些实施方案中，所述同源内含子剪接位点来自于HSV1潜伏相关内含子(HSV1latency-associated intron)。在一些实施方案中，所述同源内含子剪接位点来自于sno-IncRNA2内含子。
在一些实施方案中，所述三螺旋结构由来自于MALAT1基因座的3’末端或MENβ基因座的3’末端的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，所述第四核苷酸序列编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或更多个gRNA，每个gRNA的侧翼为核糖核酸酶识别位点。
在一些实施方案中，所述第四核苷酸序列编码至少2个侧翼为核糖核酸酶识别位点的gRNA，并且其中所述gRNA彼此不同。
本公开内容的一些方面提供了经改造构建体，其包含与核酸有效相连的启动子，所述核酸包含编码至少1个侧翼为核酶的导引RNA(gRNA)的第一核苷酸序列。在一些实施方案中，所述启动子为RNA聚合酶II依赖性(RNA pol II)启动子。所述RNA pol II启动子可为例如人巨细胞病毒启动子、人泛素启动子、人组蛋白H2A1启动子或人炎性趋化因子CXCL1启动子。
在一些实施方案中，所述核酸还包含编码目的蛋白质的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列在所述第一核苷酸序列的上游。
在一些实施方案中，所述经改造构建体还包含编码至少1个微小RNA的核苷酸序列。可例如在所述目的蛋白质内编码微小RNA。
在一些实施方案中，所述核酸还包含编码三螺旋结构的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第二核苷酸序列与所述第一核苷酸序列之间。
在一些实施方案中，所述第四核苷酸序列编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或更多个gRNA，每个gRNA的侧翼为核糖核酸酶识别位点。
在一些实施方案中，所述第一核苷酸序列编码至少2个侧翼为核酶的gRNA，并且其中所述gRNA彼此不同。
在一些实施方案中，所述核酶为顺式作用核酶。例如，顺式作用核酶可以是锤头状核酶或丁型肝炎病毒核酶。在一些实施方案中，锤头状核酶位于所述至少1个gRNA的5’末端。在一些实施方案中，锤头状核酶位于所述至少1个gRNA的3’末端。在一些实施方案中，丁型肝炎病毒核酶位于所述至少1个gRNA的5’末端。在一些实施方案中，丁型肝炎病毒核酶位于所述至少1个gRNA的3’末端。
在一些实施方案中，所述三螺旋结构由来自于MALAT1基因座的3’末端或MENβ基因座的3’末端的核苷酸序列编码。
本公开内容的一些方面提供了经改造构建体，其包含与核酸有效相连的启动子，所述核酸包含编码目的蛋白质内的至少1个RNA干扰分子的第一核苷酸序列，编码至少1个侧翼为核糖核酸酶识别位点的导引RNA的第二核苷酸序列，以及编码三螺旋结构的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间。
本公开内容的一些方面提供了经改造构建体，其包含与核酸有效相连的启动子，所述核酸包含编码目的蛋白质内的至少1个RNA干扰分子的第一核苷酸序列，编码至少1个侧翼为核酶的导引RNA的第二核苷酸序列，以及编码三螺旋结构的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间。
在一些实施方案中，RNA干扰分子选自微小RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)。在一些实施方案中，所述至少1个RNA干扰分子包含至少1个miRNA。
一些方面提供了包含1个或更多个本公开内容之经改造构建体的载体。
一些方面提供了包含本公开内容之经改造构建体和/或本公开内容之载体的细胞。
本文还提供了包含至少2个本公开内容之经改造构建体和/或至少2个本公开内容之载体的细胞。
在一些实施方案中，所述细胞被修饰以稳定表达核糖核酸酶。所述核糖核酸酶可以是例如Csy4核糖核酸酶。
在一些实施方案中，所述细胞被修饰以稳定表达Cas蛋白。在一些实施方案中，所述Cas蛋白为Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶。在一些实施方案中，所述Cas蛋白为具有转录活性的Cas蛋白。在一些实施方案中，所述具有转录活性的Cas蛋白为具有转录活性的Cas9蛋白。
在一些实施方案中，所述细胞还包含经改造核酸，所述核酸包含与编码核糖核酸酶的核苷酸序列有效相连的启动子。所述核糖核酸酶可以是例如Csy4核糖核酸酶。
在一些实施方案中，所述细胞还包含经改造核酸，所述核酸包含与编码Cas蛋白的核苷酸序列有效相连的启动子。在一些实施方案中，所述Cas蛋白为Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶。在一些实施方案中，所述Cas蛋白为具有转录活性的Cas蛋白。在一些实施方案中，所述具有转录活性的Cas蛋白为具有转录活性的Cas9蛋白。
在一些实施方案中，所述细胞还包含至少1个(或至少2个)额外的经改造核酸，所述核酸包含与编码目的蛋白质的核苷酸序列有效相连的启动子。在一些实施方案中，额外的经改造核酸的所述目的蛋白质与所述细胞中的任何其他目的蛋白质不同。
在一些实施方案中，所述细胞为细菌细胞。在一些实施方案中，所述细胞为人细胞。
本文还提供了包括培养本公开内容的任意细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在允许核酸表达的条件下培养所述细胞。
本公开内容的一些方面提供了产生、修饰或重接细胞遗传线路(cellulargenetic circuit)的方法，所述方法包括在细胞中表达第一经改造构建体，所述构建体选自本文所提供的任意经改造构建体，以及在细胞中表达第二经改造构建体，所述构建体选自本文所提供的任意经改造构建体，其中所述第一经改造构建体的至少1个gRNA与所述第二经改造构建体的启动子的区域或者内源启动子的区域互补并结合。
在一些实施方案中，所述方法还包括表达第三经改造构建体，所述构建体选自本文所提供的任意经改造构建体，其中所述第二经改造构建体的至少1个gRNA与所述第三经改造构建体的启动子的区域或者内源启动子的区域互补并结合。在一些实施方案中，所述方法还包括表达至少1个额外的经改造核酸，所述核酸选自本文所提供的任意所述经改造构建体，其中所述至少1个额外的经改造核酸的至少1个gRNA与所述细胞的任一个经改造核酸的启动子的区域或者至少1个内源启动子的区域互补并结合。
在一些实施方案中，所述细胞被修饰以稳定表达核糖核酸酶。所述核糖核酸酶可以是例如Csy4核糖核酸酶。
在一些实施方案中，所述细胞被修饰以稳定表达Cas蛋白。在一些实施方案中，所述Cas蛋白为Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶。在一些实施方案中，所述Cas蛋白为具有转录活性的Cas蛋白。在一些实施方案中，所述具有转录活性的Cas蛋白为具有转录活性的Cas9蛋白。
在一些实施方案中，所述细胞还包含经改造核酸，所述核酸包含与编码核糖核酸酶的核苷酸序列有效相连的启动子。所述核糖核酸酶可以是例如Csy4核糖核酸酶。
在一些实施方案中，所述细胞还包含经改造核酸，所述核酸包含与编码Cas蛋白的核苷酸序列有效相连的启动子。在一些实施方案中，所述Cas蛋白为Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶。在一些实施方案中，所述Cas蛋白为具有转录活性的Cas蛋白。在一些实施方案中，所述具有转录活性的Cas蛋白为具有转录活性的Cas9蛋白。
在一些实施方案中，所述方法还包括培养所述细胞。
本公开内容的一些方面提供了多重细胞表达导引核糖核酸(gRNA)的方法，其包括在细胞中表达经改造构建体，所述构建体包含与核酸有效相连的启动子，所述核酸包含编码至少2个gRNA的第一核苷酸序列，每个gRNA的侧翼为核糖核酸酶识别位点。
在一些实施方案中，所述核酸还包含编码目的蛋白质的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列在所述第一核苷酸序列的上游。在一些实施方案中，所述经改造构建体还包含编码至少1个微小RNA的核苷酸序列。可例如在所述目的蛋白质内编码微小RNA。
在一些实施方案中，所述核酸还包含编码三螺旋结构的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第二核苷酸序列与所述第一核苷酸序列之间。在一些实施方案中，所述细胞被修饰以稳定表达核糖核酸酶。所述核糖核酸酶可以是例如Csy4核糖核酸酶。在一些实施方案中，所述细胞被修饰以稳定表达Cas蛋白。在一些实施方案中，所述Cas蛋白为Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶。在一些实施方案中，所述Cas蛋白为具有转录活性的Cas蛋白。在一些实施方案中，所述具有转录活性的Cas蛋白为具有转录活性的Cas9蛋白。
在一些实施方案中，所述细胞还包含经改造核酸，所述核酸包含与编码核糖核酸酶的核苷酸序列有效相连的启动子。所述核糖核酸酶可以是例如Csy4核糖核酸酶。
在一些实施方案中，所述细胞还包含经改造核酸，所述核酸包含与编码Cas蛋白的核苷酸序列有效相连的启动子。在一些实施方案中，所述Cas蛋白为Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶。在一些实施方案中，所述Cas蛋白为具有转录活性的Cas蛋白。在一些实施方案中，所述具有转录活性的Cas蛋白为具有转录活性的Cas9蛋白。
在一些实施方案中，所述方法还包括培养所述细胞。
附图简述
图1A示出了经改造构建体CMVp-mK-Tr-28-g1-28，其包含与核酸有效相连的CMV启动子(CMVp)，所述核酸包含编码mKate2蛋白的核苷酸序列，其在编码三螺旋结构(三链体，triplex)的核苷酸序列的上游，而所述三螺旋结构在编码侧翼为Csy4识别位点(28bp)之导引RNA(gRNA1)的核苷酸序列的上游。该改造的构建体的构造可被称为“三链体/Csy4”构造。图1A中的示意图示出在共表达转录活性形式的Cas9蛋白(taCas9)、Csy4核糖核酸酶、CMVp-mK-Tr-28-g1-28以及P1-EYFP的细胞中，mKate2蛋白和导引RNA均表达。该导引RNA(gRNA)与具有转录活性的Cas9蛋白缔合以激活合成启动子(P1)，从而驱动增强的黄色荧光蛋白(P1-EYFP)的表达。
图1B示出了比较来自共表达CMVp-mK-Tr-28-g1-28、Cas9和Csy4之细胞的Csy4水平与相对的EYFP和mKate2表达水平的图。EYFP的表达水平有60倍的提高，证明了功能gRNA的产生。表达Csy4的质粒浓度的提高导致mKate2表达水平的提高。以本图和图2B至图2D的数据之间各自的最大荧光归一化荧光值，以使得能够在“三链体/Csy4”和“内含子/Csy4”构造之间进行交叉比较，如下文所讨论。
图1C示出了比较在共表达CMVp-mK-Tr-28-g1-28、Csy4和Cas9之细胞中的Csy4和Cas9表达对于mKate2表达水平的作用的图。Csy4和taCas9具有对mKate2荧光的相反作用。taCas9构建体单独降低mKate2水平，而Csy4构建单独增强mKate2荧光。以从四种检测条件下所观察到的最大mKate2表达值(仅Csy4)归一化所述mKate2表达水平。
图1D示出了比较不同RNAP II启动子对相对的IL1RN mRNA表达水平的作用的图。使用了人RNAP II启动子CXCL1p、H2A1p与UbCp，以及RNAP II启动子CMVp，驱动4种不同gRNA(gRNA3-6，表1)的表达，其激活“三链体/Csy4”构建体的IL1RN启动子。将结果与RNAP III启动子U6p对相同gRNA的直接表达的作用进行比较。将4种各自含有指定的启动子之一以及gRNA3-6的不同质粒与编码taCas9的质粒、有或无表达Csy4的质粒一起在细胞中共转染。使用qRT-PCR监测相比较于具有非特异性gRNA(NS、CMVp-mK-Tr-28-g1-28)的对照构建体之相对IL1RN mRNA表达。RNAP II启动子导致大范围的IL1RN激活，相比于不存在Csy4，Csy4的存在极大地提高激活。即使不存在Csy4，通过RNAP II启动子也会实现IL1RN的激活，虽然以比Csy4存在下低得多的水平。
图1E示出了比较通过“三链体/Csy4”构建体对内源IL1RN基因座激活的输入-输出转移曲线的图，其通过相对于相对IL1RN mRNA表达水平(作为输出)绘制mKate2表达水平(作为输入的代表)得以确定。该数据表明，可用不同长度的RNAP II启动子实现内源基因座的可调调节。IL1RN数据与图1D所示相同。
图2A示出了经改造构建体CMVp-mKEx1-[28-g1-28]内含子-mKEx2，其包含与核酸有效相连的CMV启动子(CMVp)，所述核酸包含编码侧翼为Csy4识别位点(28bp)之导引RNA(gRNA1)的核苷酸序列，其侧翼为同源内含子剪接位点，该位点在编码mKate2蛋白的核苷酸序列内。该改造的构建体的构造可被称为“内含子/Csy4”构造。图2A中的示意图示出了在共表达转录活性形式的Cas9蛋白、Csy4核糖核酸酶、CMVp-mKEx1-[28-g1-28]内含子-mKEx2以及P1-EYFP的细胞中，表达了导引RNA，之后其与具有转录活性的Cas9蛋白缔合以激活合成启动子(P1)，从而驱动增强的黄色荧光蛋白(P1-EYFP)的表达。与图1A所示的“三链体/Csy4”构造相反，在Csy4水平提高的情况下，该“内含子/Csy4”构造导致mKate2基因表达的降低，在不受理论束缚的情形下，这可能是由于剪接之前的前mRNA的切割。
图2B示出了比较来自共表达CMVp-mKEx1-[28-g1-28]内含子-mKEx2、Cas9和Csy4之细胞的Csy4水平与相对的EYFP和mKate2表达水平的图，其中所述同源内含子剪接位点来自于共有内含子。
图2C示出了比较来自共表达CMVp-mKEx1-[28-g1-28]内含子-mKEx2、Cas9和Csy4之细胞的Csy4水平与相对的EYFP和mKate2表达水平的图，其中所述同源内含子剪接位点来自于snoRNA2内含子。
图2D示出了比较来自共表达CMVp-mKEx1-[28-g1-28]内含子-mKEx2、Cas9和Csy4之细胞的Csy4水平与相对的EYFP和mKate2表达水平的图，其中所述同源内含子剪接位点来自于HSV1内含子。
图2E示出了比较来自共表达CMVp-mKEx1-[28-g1-28]内含子-mKEx2、Cas9和Csy4之细胞的Csy4水平与相对的EYFP和mKate2表达水平的图，其中单个Csy4结合位点位于HSV1内含子内的gRNA上游。该构造不产生功能gRNA但在更高的Csy4水平下会导致mKate2荧光的降低。以该实验和[28-g1-28]HSV1对照(图11)之间的最大荧光水平归一化荧光值。
图2F示出了比较来自共表达CMVp-mKEx1-[28-g1-28]内含子-mKEx2、Cas9和Csy4之细胞的Csy4水平与相对的EYFP和mKate2表达水平的图，其中单个Csy4结合位点位于HSV1内含子内的gRNA下游。该构造产生低水平的功能gRNA并且也导致在更高的表达Csy4的质粒浓度下mKate2水平的降低。以该实验和[28-g1-28]HSV1对照(图11)之间的最大荧光水平归一化荧光值。
图3A示出了经改造构建体CMVp-mK-Tr-HH-g1-HDV，其包含与核酸有效相连的CMV启动子(CMVp)，所述核酸包含编码mKate2蛋白的核苷酸序列，其在编码三螺旋结构(三链体)的核苷酸序列的上游，所述三螺旋结构在编码导引RNA(gRNA1)的核苷酸序列的上游，所述导引RNA侧翼为核酶(5’锤头状(HH)核酶，以及3’HDV核酶)。该改造的构建体的构造可被称为“三链体/核酶”构造。图3A中的示意图示出在共表达转录活性形式的Cas9蛋白、Csy4核糖核酸酶、以及CMVp-mK-Tr-HH-g1-HDV的细胞中，mKate2蛋白和导引RNA均表达。
图3B示出了经改造构建体CMVp-mK-HH-g1-HDV，其包含与核酸有效相连的CMV启动子(CMVp)，所述核酸包含编码mKate2蛋白的核苷酸序列，其在编码导引RNA(gRNA1)的核苷酸序列的上游，所述导引RNA的侧翼为核酶(5’锤头状(HH)核酶，以及3’HDV核酶)。图3B中的示意图示出在共表达转录活性形式的Cas9蛋白、Csy4核糖核酸酶、以及CMVp-mK-HH-g1-HDV的细胞中，mKate2蛋白和导引RNA均表达。
图3C示出了经改造构建体CMVp-HH-g1-HDV，其包含与核酸有效相连的CMV启动子(CMVp)，所述核酸包含编码导引RNA(gRNA1)的核苷酸序列，所述导引RNA的侧翼为核酶(5’锤头状(HH)核酶，以及3’HDV核酶)。图3C中的示意图示出在共表达转录活性形式的Cas9蛋白、Csy4核糖核酸酶、以及CMVp-HH-g1-HDV的细胞中，导引RNA表达。
图3D示出了比较共表达CMVp-mK-Tr-HH-g1-HDV、CMVp-mK-HH-g1-HDV或CMVp-HH-g1-HDV以及P1-EYFP的细胞中相对EYFP与mKate2表达水平的图。示出了有或无Csy4情况下表达“三链体/Csy4”构建体(mK-Tr-28-g1-28)的细胞，以及表达RNAP III启动子、U6p、驱动性gRNA1(U6p-g1)的细胞的表达水平，以用于比较。
图4A示出了经改造构建体，其包含与核酸有效相连的CMV启动子(CMVp)，所述核酸包含编码侧翼为Csy4识别位点(28bp)之导引RNA(gRNA1)的核苷酸序列，其侧翼为同源内含子剪接位点，所述位点在编码mKate2蛋白的核苷酸序列内，其位于编码三螺旋结构(三链体)的核苷酸序列的上游，所述三螺旋结构位于编码侧翼为Csy4识别位点(28bp)之gRNA(gRNA2)的核苷酸序列的上游(输入A，“内含子-三链体”)。通过gRNA1特异性P1-EYFP构建体和gRNA2特异性P2-ECFP构建体的激活评估功能gRNA的表达。
图4B示出了经改造构建体，其包含与核酸有效相连的CMV启动子(CMVp)，所述核酸包含编码mKate2蛋白的核苷酸序列，其位于编码三螺旋结构(三链体)的核苷酸序列的上游，所述三螺旋结构位于编码2个gRNA(gRNA1和gRNA2)的核苷酸序列的上游，所述gNRA各自的侧翼为Csy4识别位点。所述gRNA与间插及侧翼的Csy4识别位点串联地编码(输入B，“三链体-串联”)。通过gRNA1特异性P1-EYFP构建体和gRNA2特异性P2-ECFP构建体的激活评估功能gRNA的表达。
图4C示出的图证明了这两种多重gRNA表达构建体(输入A和输入B)表现出在Csy4存在下，对EYFP及ECFP表达的有效激活，从而证明了从单个转录本产生多活性gRNA。此外，如从图1和图2所预计的，mKate2水平因为内含子构造随着输入A而降低，而mKate2水平因为非内含子构造随着输入B而提高。
图5A示出了经改造构建体，其包含与核酸有效相连的CMV启动子(CMVp)，所述核酸包含编码mKate2蛋白的核苷酸序列，其位于编码三螺旋结构(三链体)的核苷酸序列的上游，所述三螺旋结构位于编码4个不同的gRNA(gRNA3至gRNA6)的核苷酸序列的上游，所述gNRA各自的侧翼为Csy4识别位点。所述gRNA与间插及侧翼的Csy4识别位点串联地编码(mK-Tr-(28-g-28)3-6)。
图5B示出的图证明了多重mK-Tr-(28-g-28)3-6构建体表现出在Csy4的存在下相比于不存在Csy4的情况下相同构建体之IL1RN表达的高水平激活。与具有通过“三链体/Csy4”构造表达的非特异性gRNA1(NS，CMVp-mK-Tr-28-g1-28)的对照构建体相比，确定相对IL1RNmRNA的表达。为了比较，示出了非多重质粒组，其含有相同的gRNA(gRNA3至gRNA6)，每一个gRNA由分开的单独质粒表达。
图6A示出了通过使用内含子gRNA1(CMVp-mKEX1-[28-g1-28]HSV-mKEX2)作为第一阶段实施的三阶段转录级联。gRNA1特异性地靶向P1启动子以表达gRNA2(P1-EYFP-Tr-28-g2-28)，之后从P2启动子激活ECFP的表达(P2-ECFP)。
图6B示出了通过使用“三链体/Csy4”构造以表达gRNA1(CMVp-mK-Tr-28-g1-28)从而实施的三阶段转录级联。gRNA1特异性地靶向P1启动子以表达gRNA2(P1-EYFP-Tr-28-g2-28)，之后从P2启动子激活ECFP的表达(P2-ECFP)。
图6C示出的图证明了图6A中的完整三阶段转录级联表现出所有三种荧光蛋白的表达。将级联中的三个阶段的任意一个移除会导致该具体阶段及依赖性的下游阶段的荧光丧失。
图6D示出的图证明了图6B中的完整三阶段转录级联表现出所有三种荧光蛋白的表达。将级联中的三个阶段的任意一个移除会导致该具体阶段及依赖性的下游阶段的荧光丧失。
图7A示出了经改造构建体，其通过从mKate2内的内含子表达miRNA以及从“三链体/Csy4”构造(CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28)表达gRNA1，编码miRNA以及基于CRISPR-TF的调控两者。在存在taCas9但不存在Csy4的情况下，该线路不激活下游的gRNA1特异性P1-EYFP构建体并且确实阻抑下游的ECFP转录本，该转录本具有8个(8x)miRNA结合位点，所述位点的侧翼为Csy4识别位点(CMVp-ECFP-Tr-28-miR8xBS)。在taCas9和Csy4两者均存在的情况下，该线路通过激活gRNA1的产生及随后的EYFP表达，以及通过将ECFP转录本从8xmiRNA结合位点分离而被重接，从而消除了miRNA对ECFP表达的抑制。
图7B示出的图证明了Csy4表达可通过重接线路互连改变图7A中所述线路的行为。
图7C示出了线路基序图(circuit motif diagram)，其举例说明了Csy4催化的重接。
图7D示出了通过编码位于输入转录本(CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28-miR4xBS)3’末端的4x miRNA结合位点而被并入描述于图7A中线路的网络拓扑结构的自我调控的反馈环路。该负反馈在Csy4不存在的情况下抑制mKate2的表达。然而，在Csy4存在下，所述4x miRNA结合位点被从mKate2mRNA中分离，从而导致mKate2的表达。
图7E示出的图证明了Csy4的表达可通过重接线路互连改变图7D中线路的行为。与图7A中的线路相反，mKate2在Csy4不存在的情况下被抑制，但当Csy4存在的情况下由于基于miRNA的自我调控负反馈的消除，mKate2大量表达。
图7F示出了线路基序图，其举例说明了Csy4催化的重接。以所有测试方案中的各自最大荧光水平归一化图7B和图7E中mKate2、EYFP以及ECFP每一个的水平。重复图7B和图7E中第3列和第4列的对照，而将图7A和图7D中的2个线路在相同的实验中用相同的对照进行测试。
图8A示出了对应于“三链体/csy4”构造以从RNAP II转录本产生功能gRNA的流式细胞术数据。
图8B示出了用于从RNAP II转录本产生功能gRNA的“内含子/Csy4”构造。缩写：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)；Comp-FITC-A(EYFP)。三链体：构建体#3(CMVp-mK-Tr-28-g1-28，1μg)。共有、snoRNA2以及HSV1：分别为构建体#8-构建体#10(CMVp-mKEX1-[28-g1-28]“内含子类型”-mKEX2，对应的内含子序列在gRNA和Csy4识别序列(“28”)侧翼)。将这些质粒以1μg转染。此外，指定了每个样品中转染的表达Csy4质粒(构建体#2)的量。其他转染的质粒包括构建体#1(taCas9，1μg)和#5(P1-EYFP，1μg)。
图9示出了对应于图1B的流式细胞术数据，以分析对于CMVp-mK-Tr-28-g1-28构造，Csy4和taCas9的多种组合如何影响mKate2基因的表达。缩写：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)。所有样品都含有构建体#3(CMVp-mK-Tr-28-g1-28，1μg)。将构建体#1(taCas9，1μg)与构建体#2(Csy4，100ng)按照指定方式应用。
图10示出的流式细胞术数据提供了多种对照，以证明通过gRNA3(上方两图)的P1启动子的最小非特异性激活以及具有内含子gRNA1而没有Csy4结合位点(下图)的启动子P1的最小EYFP激活。缩写：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)；Comp-FITC-A(EYFP)。上方两图每个样品中转染的Csy4DNA量如图中所指定。下图(CMVp-mKEX1-[g1]cons-mKEX2)在Csy4不存在的情况下测试。该实验中其他转染的质粒包括构建体#1(taCas9，1μg)和构建体#5(P1-EYFP，1μg)。
图11示出了对应于图2E和图2F的流式细胞术数据，以分析在内含子内gRNA侧翼的Csy4识别位点的多种构造如何影响CRISPR-TF活性。缩写：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)；Comb-FITC-A(EYFP)。“28-gRNA-28”为HSV1内含子gRNA，其侧翼为2个Csy4识别位点(构建体#4，CMVp-mKEX1-[28-g1-28]HSV1-mKEX2)；“28-gRNA”为HSV1内含子gRNA，其仅有5’Csy4识别位点(构建体#10，CMVp-mKEX1-[28-g1]HSV1-mKEX2)；“gRNA-28”为HSV1内含子gRNA，其仅有3’Csy4识别位点(构建体#11，CMVp-mKEX1-[g1-28]HSV1-mKEX2)。此外，在每个样品中转染的表达Csy4质粒的量如每个图中所指定。该实验中其他转染的质粒包括构建体#1(taCas9，1μg)和构建体#5(P1-EYFP，1μg)。
图12示出了对应于图3的流式细胞术数据。缩写：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)；Comp-FITC-A(EYFP)。“三链体-Csy4”机制含有构建体#3(CMVp-mK-Tr-28-g1-28)。该实验中其他转染的质粒包括构建体#1(taCas9，1μg)；构建体#5(P1-EYFP，1μg)；构建体#2(Csy4，指定的浓度)。“核酶设计1”包含构建体#13(CMVp-mK-Tr-HH-g1-HDV)。该实验中其他转染的质粒包括构建体#1(taCas9，1μg)；构建体#5(P1-EYFP，1μg)。“核酶设计2”包含构建体#14(CMVp-mK-HH-g1-HD)。该实验中其他转染的质粒包括构建体#1(taCas9，1μg)；构建体#5(P1-EYFP，1μg)。“核酶设计3”包含构建体#15(CMVp-HH-g1-HDV)。该实验中其他转染的质粒包括构建体#1(taCas9，1μg)；构建体#5(P1-EYFP，1μg)。“U6p-gRNA1”包含构建体#7(U6p-g1，1μg)。该实验中其他转染的质粒包括构建体#1(taCas9，1μg)。
图13示出了对应于图4C的流式细胞术数据。缩写：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)；Comp-FITC-A(EYFP)；Comp-Pacific Blue-A(ECFP)。“机制1”指“内含子-三链体”构造，并且含有构建体#16(CMVp-mKEX1-[28-g1-28]HSV1-mKEX2-Tr-28-g2-28，1μg)；构建体#5(P1-EYFP，1μg)；构建体#6(P2-ECFP，1μg)；以及构建体#1(taCas9，1μg)。“机制2”指“串联-三链体”构造，并且含有构建体#17(CMVp-mK-Tr-28-g1-28-g2-28，1μg)；构建体#5(P1-EYFP，1μg)和构建体#6(P2-ECFP，1μg)；以及构建体#1(taCas9，1μg)。此外，在每个样品中转染的表达Csy4的质粒DNA(构建体#2)的量如上文每个图中所指定。
图14示出了对应于图6C和图6D的流式细胞术数据。缩写：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)；Comp-FITC-A(EYFP)；Comp-Pacific Blue-A(ECFP)。所有样品均用列于每个图表名称中的构建体(每种1μg，表2)，以及200ng的表达Csy4的质粒(构建体#2)转染。
图15示出了对应于图7B和图7E的流式细胞术数据。缩写：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)；Comp-FITC-A(EYFP)；Comp-Pacific Blue-A(ECFP)。“机制1”含有以下构建体：构建体#20(CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28)；构建体#22(CMVp-ECFP-Tr-28-miR8xBS-28)；以及构建体#5(P1-EYFP)。这些质粒以每种1μg的浓度转染。该机制对应于图7A中的线路图。“机制2”含有以下构建体：构建体#21(CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28-miR4xBS)；构建体#22(CMVp-ECFP-Tr-28-miR8xBS-28)；以及构建体#5(P1-EYFP)。这些质粒以每种1μg的浓度转染。该机制对应于图7D中的线路图。“对照”样品仅含有构建体#22(CMVp-ECFP-Tr-28-miR8xBS-28)以及构建体#5(P1-EYFP)。这些质粒以每种1μg的浓度转染。此外，在每个样品中转染的表达Csy4的质粒(构建体#2)的量如上文每个图中所指定。
发明详述
建立复杂、稳健并可扩展的对人工部分与天然细胞过程之间的限定的互连进行操作的合成基因网络的能力，是改造生物***的核心。该能力可以使例如用于重接、微扰以及探知自然生物网络的新策略成为可能。大量可调、正交、紧凑以及可多重的基因调控机制对于这些应用的实施具有根本的重要性。尽管在转录调控和合成生物学领域中有许多进展，但在本公开内容之前的可用工具无法满足一种或更多种上述标准。转录调控利用与目的预定DNA序列相结合的转录因子。II型CRISPR/Cas***(例如，具有靶向DNA的Cas蛋白)已经适用于获得可编程的DNA结合而不需要复杂的蛋白质改造(Sander和Joung，2014)。在这些***中，所述Cas DNA结合蛋白的序列特异性通过导引RNA(gRNA)确定，其具有与靶DNA位点的碱基配对互补性。这使得能够简单且高度灵活地编程Cas结合。
在本公开内容以前，在人细胞中用于基因调控的gRNA仅从RNA聚合酶III(RNAPIII)启动子表达。这对于将CRISPR/Cas调控与内源基因网络整合的情况是限制，因为RNAPIII启动子仅包含小部分的细胞启动子，而且大部分为组成型活性，因此阻止了大部分细胞启动子和信号与基于CRISPR-TF的网络的连接。此外，通常需要多个gRNA以有效地激活内源启动子，但在本公开内容之前，没有可用的从单个转录本多重产生gRNA以用于转录调控的策略。因此，需要多个gRNA表达构建体以微扰天然转录网络，从而限制了可扩展性。
除了转录调控之外，天然线路通过基于RNA的翻译和翻译后调控，以获得复杂的行为。本文所提供的将RNA与转录改造相结合的合成基因调控策略可用于天然***的建模或人工行为的实施。因此，本文在多个方面中提供了整合基于哺乳动物与细菌RNA的调控机制的方法和组合物，以例如产生复杂的合成线路拓扑结构以及调控内源启动子。可以使用多个哺乳动物RNA处理策略，包括3’RNA三螺旋(称为三链体)、内含子与核酶，连同哺乳动物miRNA调控、来源于细菌的CRISPR-TF以及来自于铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的Csy4RNA修饰蛋白。这些构建体可用于例如在人细胞中从RNAP-II调控的mRNA产生功能gRNA，同时使伴随的mRNA翻译可调。
如本文所示，功能gRNA用于靶向合成的以及内源启动子两者，以通过CRISPR-TF激活。此外，开发了用于多重gRNA产生的策略，从而使得能够紧凑地编码单个转录本中的蛋白质和多个gRNA。为了证明这些调控部分的用途，实施了可用于复杂的合成基因线路构建的多阶段转录级联。在一些实施方案中，通过基于Csy4的RNA处理，本文还组合了基于哺乳动物miRNA的调控以及CRISPR-TF，以产生多组件的遗传线路，其具有反馈环、互连和可重接的行为。因此，通过使用合成转录和RNA依赖性的机制，本公开内容的平台可用于例如构建、同步以及转换人工和内源这两种复杂的调控网络。在一些实施方案中，基于CRISPR-TF的基因调控***与哺乳动物RNA调控构造的整合使得用于合成生物学以及基础生物学应用的可扩展基因调控***成为可能。
本公开内容的一些方面涉及经改造构建体以及经改造核酸。“经改造构建体”为用于描述经改造具有多个遗传元件的核酸的术语，所述遗传元件包括例如启动子及多种核苷酸序列(例如，编码蛋白质和/或RNA干扰分子的核苷酸序列，如本文所提供的)。核酸是至少两个共价连接在一起的核苷酸，并且在一些情况下，其可以含有磷酸二酯键(例如磷酸二酯“骨架”)。经改造核酸是不天然存在的核酸。然而，应该理解的是，尽管经改造核酸整体上不是天然存在的，其可以包括天然存在的核苷酸序列。在一些实施方案中，经改造核酸包含来自于不同生物体的核苷酸序列(例如，来自于不同物种)。例如，在一些实施方案中，经改造核酸包括鼠核苷酸序列、细菌核苷酸序列、人核苷酸序列和/或病毒核苷酸序列。经改造核酸包括重组核酸以及合成核酸。重组核酸是通过将核酸(例如，分离的核酸、合成核酸或其组合)连接构建的分子，并且在一些实施方案中，其可以在活细胞中复制。合成核酸是扩增得到的或通过化学方法或其他手段合成的分子。合成核酸包括以化学方法修饰的或以其他方法修饰的，但可以与天然存在的核酸分子碱基配对的那些。重组和合成核酸也包括前述任一复制产生的那些分子。
在一些实施方案中，本公开内容的核酸被认为是核酸类似物，其可以含有至少一部分其他骨架，所述骨架包含例如磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基亚磷酰胺键和/或肽核酸。具体而言，核酸可以为单链(single-stranded，ss)或双链(double-stranded，ds)，或可以含有单链和双链序列两种部分。在一些实施方案中，核酸可含有三链序列的部分。核酸可以是DNA(基因组和/或cDNA两者)，RNA或杂合体，其中核酸含有任何脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸的组合(例如，人工的或天然的)，以及任何碱基的组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤。
本公开内容的经改造构建体(包括经改造核酸)包含一个或更多个遗传元件。“遗传元件”指在核酸表达中具有作用的特定核苷酸序列(例如启动子、增强子、终止子)或编码经改造核酸之不连续产物的特定核苷酸序列(例如编码导引RNA、蛋白质和/或RNA干扰分子的核苷酸序列)。本公开内容遗传元件的实例包括但不限于启动子以及编码蛋白质、导引RNA、Csy4结合位点、三螺旋结构、内含子和内含子序列(例如，供***点、接受***点(acceptor site)和/或分支位点)、外显子以核酶的核苷酸序列。
本公开内容的经改造核酸的遗传元件的位置可相对于其他遗传元件沿着5’至3’方向的编码(有义)链限定。例如，图1A示出了与编码mKate2蛋白的核苷酸序列有效相连的CMV启动子，该序列位于编码三螺旋结构(或三链体)的核苷酸序列的上游，该编码三螺旋结构的核苷酸序列位于编码侧翼为Csy4结合位点的导引RNA的核苷酸序列的上游。或者，图1A所示的经改造核酸可描述为具有编码侧翼为Csy4结合位点的导引RNA的核苷酸序列，该序列位于编码三螺旋结构的核苷酸序列的下游，该编码三螺旋结构的核苷酸序列位于编码mKate2蛋白的核苷酸序列的下游，该编码mKate2蛋白的核苷酸序列与上游的启动子有效相连。因此，如果第一遗传元件位于第二遗传元件的3’，则认为所述第一遗传元件位于所述第二遗传元件的下游。相似地，如果第二遗传元件位于第一遗传元件的5’，则认为所述第二遗传元件位于所述第一遗传元件的上游。如果两个遗传元件彼此接近(例如，没有其他遗传元件位于两者之间)，则认为一个遗传元件是另一个遗传元件的“紧接的下游”或“紧接的上游”。例如在图1A所示的构造中，编码侧翼为Csy4结合位点的导引RNA的核苷酸序列位于编码三螺旋结构的核苷酸序列的紧接的下游。
本公开内容的一些方面涉及经改造核酸，其包含(例如1个或更多个，至少1个)核苷酸序列，所述核苷酸序列编码(例如至少1个，包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个，或更多个)导引RNA(gRNA)。gRNA是CRISPR/Cas***的组成部分。多种细菌和古细菌使用CRISPR/Cas***来介导针对病毒和其他外来核酸的防御。CRISPR/Cas***的组成部分协调选择性地切割核酸。II型CRISPR/Cas***包括靶向DNA的Cas蛋白，而III型CRISPR/Cas***包括靶向RNA的Cas蛋白。Cas DNA结合蛋白的序列特异性由gRNA确定，其具有与靶DNA位点的碱基配对互补性。因此，Cas蛋白由gRNA“导引”至靶DNA位点。在一些实施方案中，gRNA的碱基配对互补性使得能够简单且灵活地编程Cas结合。碱基配对互补性指腺嘌呤与胸腺嘧啶(DNA)或尿嘧啶(RNA)之间，以及鸟嘌呤与胞嘧啶之间的相区别的相互作用。
在一些实施方案中，本公开内容的导引RNA的长度为10至500个核苷酸。在一些实施方案中，gRNA的长度为10至20个核苷酸、10至30个核苷酸、10至40个核苷酸、10至50个核苷酸、10至60个核苷酸、10至70个核苷酸、10至80个核苷酸、10至90个核苷酸、10至100个核苷酸、20至30个核苷酸、20至40个核苷酸、20至50个核苷酸、20至60个核苷酸、20至70个核苷酸、20至80个核苷酸、20至90个核苷酸、20至100个核苷酸、30至40个核苷酸、30至50个核苷酸、30至60个核苷酸、30至70个核苷酸、30至80个核苷酸、30至90个核苷酸、30至100个核苷酸、40至50个核苷酸、40至60个核苷酸、40至70个核苷酸、40至80个核苷酸、40至90个核苷酸、40至100个核苷酸、50至60个核苷酸、50至70个核苷酸、50至80个核苷酸、50至90个核苷酸或50至100个核苷酸。在一些实施方案中，gRNA的长度为10至200个核苷酸、10至250个核苷酸、10至300个核苷酸、10至350个核苷酸、10至400个核苷酸或10至450个核苷酸。在一些实施方案中，gRNA的长度为超过500个核苷酸。在一些实施方案中，gRNA的长度为10、15、20、15、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500或更多个核苷酸。
出人意料的是，在一些实施方案中，本公开内容的方法和组合物允许从单个转录本产生多个导引RNA(gRNA)。然而，应理解，可在单细胞中从多个转录本产生多个gRNA。本文提供的所产生的gRNA可具有相同的核苷酸序列或可具有不同的核苷酸序列。因此，gRNA可靶向并结合相同的靶位点或不同的靶位点(例如，在特定启动子内的区域)。例如，一些经改造核酸包含编码第一gRNA的核苷酸序列以及编码第二gRNA的核苷酸序列(或编码至少2个gRNA的核苷酸序列)。所述第一gRNA可具有与第二gRNA相同的RNA序列，并且，因此这2个gRNA可靶向相同的位点。或者，所述第一gRNA可具有与第二gRNA不同的RNA序列，并且，因此这2个gRNA可靶向不同的位点(例如，在相同的启动子内或在不同的启动子内)。如图4A中所示例，“gRNA1”靶向与增强的黄色荧光蛋白(EYFP)有效连接的启动子(P1)，而“gRNA2”靶向与增强的青色荧光蛋白(ECFP)有效连接的启动子(2)。
如果第一核苷酸序列***第二核苷酸序列的2个核苷酸之间，或者如果该核苷酸序列替换了第二核苷酸序列的一段连续的核苷酸，则认为所述第一核苷酸序列在所述第二核苷酸序列“内”。在一些实施方案中，核苷酸序列编码目的蛋白质内的gRNA或RNA干扰分子。例如在此构造中，编码gRNA的核苷酸序列位于目的蛋白质的两个相邻外显子之间，以使得当所编码的gRNA被移除时(例如，如果该gRNA侧翼为同源内含子剪接位点，则通过RNA剪接)，该蛋白质被翻译。在一些实施方案中，如上文所讨论的导引RNA“导引”Cas蛋白至核酸。
Cas蛋白是切割核酸的核酸酶。在一些实施方案中，Cas蛋白(如Cas9蛋白)的核酸酶活性可被用于原核和真核细胞中的精确且有效的基因组编辑。本文还考虑到了突变的Cas蛋白。在一些实施方案中，突变的Cas蛋白缺乏核酸酶活性(例如，dCas9)。在一些实施方案中，对缺乏核酸酶活性的突变Cas蛋白进行修饰，以使得能够在哺乳动物细胞中进行异位和天然启动子的可编程转录调控，以产生基于CRISPR的转录因子(CRISPR-TF)(Cheng等，2013；Farzadfard等，2013；Gilbert等，2013；Maeder等，2013a；Mali等，2013a；Perez-Pinera等，2013a)。例如，将激活结构域(例如，VP16、VP64或p65)与Cas蛋白融合使得Cas具有转录活性(也称为“taCas”蛋白)。转录激活蛋白募集RNA聚合酶II机器以及染色质修饰活性至启动子。因此，在一些实施方案中，根据本公开内容使用了“具有转录活性的”Cas(taCas)蛋白，其缺乏核酸酶活性。在一些实施方案中，具有转录活性的Cas蛋白为具有转录活性的Cas9(taCas9)蛋白。本文考虑了其他具有转录活性的Cas蛋白。
在一些实施方案中，本公开内容的导引RNA的侧翼为核糖核酸酶识别位点。核糖核酸酶(缩写为RNA酶)是催化RNA水解的核酸酶。核糖核酸酶可以为核糖核酸内切酶或核糖核酸外切酶。核糖核酸内切酶切割单链或双链RNA。核糖核酸外切酶通过从RNA的5’末端或3’末端移除末端核苷酸降解RNA。在一些实施方案中，本公开内容的导引RNA的侧翼为Csy核糖核酸酶识别位点(例如Csy4核糖核酸酶识别位点)。Csy4是核糖核酸内切酶，其识别特定的RNA序列、切割该RNA并保持与上游片段的结合。在一些实施方案中，Csy核糖核酸酶(例如Csy4核糖核酸酶)被用于从经改造核酸转录本释放导引RNA。因此，在一些实施方案中，用包含编码侧翼为Csy4或其他Cas6核糖核酸酶识别位点之导引RNA的核苷酸序列的经改造构建体，以及编码Csy4或其他Cas6核糖核酸酶的经改造核酸对细胞共转染。或者，或另外地，细胞可稳定表达，或经修饰而稳定表达Csy4或其他Cas6核糖核酸酶。在一些实施方案中，Csy核糖核酸酶(例如Csy4核糖核酸酶)来自于铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)或硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)。本文考虑了其他核糖核酸酶及核糖核酸酶识别位点(参见例如，Mojica，F.J.M.等，CRISPR-Cas Systems，RNA-mediated Adaptive Immunity in Bacteria andArchaea，Barrangou，Rodolphe，van der Oost，John(编辑)，2013，ISBN978-3-642-34657-6，其涉及核糖核酸酶/识别位点的主题通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，核糖核酸酶识别位点(例如Csy4核糖核酸酶识别位点)的长度为10至50个核苷酸。例如，Csy核糖核酸酶识别位点的长度可以为10至40、10至30、10至20、20至50、20至40或20至30个核苷酸。在一些实施方案中，Csy核糖核酸酶识别位点的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，Csy核糖核酸酶识别位点(例如Csy4核糖核酸酶识别位点)的长度为28个核苷酸。在一些实施方案中，编码核糖核酸酶识别位点的核苷酸序列包含SEQ IDNO：26。本文还考虑了Csy同源物(参见例如，Mojica，F.J.M.等，CRISPR-Cas Systems，RNA-mediated Adaptive Immunityin Bacteria and Archaea，Barrangou，Rodolphe，van der Oost，John(编辑)，2013，ISBN978-3-642-34657-6，其涉及核糖核酸酶/识别位点的主题通过引用并入本文)。
当第一遗传元件位于其他遗传元件之间并与其紧邻时，则称所述第一遗传元件的“侧翼”为其他遗传元件。例如，图1A示出的示意图，其为编码侧翼为Csy4结合位点(“28bp”)之“gRNA1”的核苷酸序列。相似的，图2A中的示意图代表编码侧翼为Csy4结合位点(“28bp”)之“gRNA1”的核苷酸序列，其侧翼还有编码同源内含子剪接位点的核苷酸序列，其侧翼还有编码mKate2蛋白外显子的核苷酸序列。在一些实施方案中，经改造构建体含有多个串联的gRNA，例如图5A所示。这样的构建体本文可描述为具有编码至少2个gRNA的核苷酸序列，每个gRNA的侧翼为核糖核酸酶识别位点。应当理解的是该构造意在包含多个串联的gRNA，每个gRNA的侧翼为单个核糖核酸酶识别位点(ribonuclease recognition site，RRS)，如图5A所示(在图中RSS指代为“28bp”)；还包含多个串联的gRNA，每个gRNA的侧翼为2个或更多个核糖核酸酶识别位点。例如，在经改造构建体中，可以遗传元件的顺序可以如下：RRS1-gRNA1-RRS2-gRNA2-RRS3-gRNA-RRS4，其中单个核糖核酸酶识别位点将1个gRNA与相邻的gRNA分开；或者RRS1-gRNA1-RRS2-RRS3-gRNA2-RRS4-RRS5-gRNA-RRS6，其中2个核糖核酸酶识别位点将1个gRNA与相邻的gRNA分开。所述RRS可以是相同或不同的。即，在一些实施方案中，可以使用不同类型的核糖核酸酶以从经改造构建体释放1个或更多个gRNA。
本公开内容的一些方面涉及经改造构建体，其包含3’RNA稳定序列(stabilizingsequence)，例如形成三螺旋结构(或“三链体”)的RNA序列。3’RNA稳定序列为添加到编码产物之核苷酸序列3’末端以补充poly(A)尾缺乏的核苷酸序列。因此，在一些实施方案中，如那些形成三螺旋结构的3’RNA稳定序列使得能够对缺乏poly(A)尾的mRNA进行有效翻译。三螺旋结构是例如通过富含腺嘌呤和尿苷的基序所形成的的二级或三级RNA结构。在一些实施方案中，3’RNA稳定序列来自于核酸的3’非翻译区(untranslated region，UTR)。
在一些实施方案中，三螺旋结构促进RNA稳定性和/或翻译。在一些实施方案中，本公开内容的三螺旋结构由来自于MALAT1(转移相关肺腺癌转录本1，metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1)基因座或MENβ(多发性内分泌腺瘤形成β，multiple endocrine neoplasia-β)基因座的3’末端的核苷酸片段编码。在一些实施方案中，三螺旋结构由来自于MALAT1基因座3’末端或MENβ基因座3’末端的核苷酸片段编码(参见例如，Wilusz等，2012，通过引用并入本文；还参见，Brown JA等Proc Natl Acad SciUSA.201211月20；109(47)，通过引用并入本文)。在一些实施方案中，三螺旋结构由来自于MALAT1基因座3’末端的110个核苷酸序列(例如，110个连续的核苷酸序列)编码。在一些实施方案中，三螺旋结构由包含SEQ ID NO：1或由其组成的核酸编码。本文考虑了其他3’RNA稳定序列，包括编码三螺旋结构的那些(参见例如，Wilusz J.E.等RNA 2010.16：259-266，通过引用并入本文)。
本公开内容的一些方面涉及经改造构建体，其包含编码侧翼为核糖核酸酶(例如，Csy4)识别位点的gRNA的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列的侧翼为编码同源内含子剪接位点的核苷酸序列。在本领域中，术语“内含子”经常指基因中的DNA序列以及在RNA转录本中的对应序列两者。本文为了清楚和一致，应当理解的是，在经改造构建体的情景中，“编码内含子的核苷酸序列”指DNA序列，而术语“内含子”指RNA序列。内含子是非编码RNA序列，其通过RNA剪接而被移除。RNA剪接是这样的过程，通过其对前信使RNA进行修饰以移除内含子并将外显子(例如，核酸的编码蛋白质的区域)连到一起，以形成成熟的信使RNA(mRNA)分子。“同源内含子剪接位点”包括供***点(例如，在内含子的5’末端)、分支位点(例如，接近内含子的3’末端)以及接受***点(例如，在内含子的3’末端)，以使得在RNA剪接期间，移除任何间插序列(例如在5’剪接位点与3’剪接位点之间的序列)。例如，图2A所示的经改造构建体包含侧翼为内含子剪接位点的间插遗传元件(例如，编码侧翼为Csy4结合位点之gRNA的核苷酸序列)。在从图2A的经改造构建体产生转录本的过程中，所述间插遗传元件被移除。
在一些实施方案中，5’剪接供***点在更大的、较不高度保守的区域内包含几乎不变的序列GU。在一些实施方案中，3’剪接接受***点包含几乎不变的AG序列。在一些实施方案中，在所述AG的上游有高嘧啶(例如，C和U)的区域，称为多聚嘧啶串(polypyrimidinetract)。在一些实施方案中，在多聚嘧啶串上游是分支点(branchpoint)，其可以包含例如腺嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，内含子的共有序列(在IUPAC核酸标记法中)为：M-A-G-[切割]-G-U-R-A-G-U(供***点)...内含子序列...C-U-R-[A]-Y(分支序列，例如在接受***点上游的20至50个核苷酸)...Y-富含-N-C-A-G-[切割]-G(接受***点)。
在一些实施方案中，本文考虑了产生相对稳定的(例如“长寿命的”)内含子的内含子序列。该序列的实例包括但不限于HSV-1潜伏相关内含子，其形成稳定的环状内含子(Block和Hill，1997)，以及sno-IncRNA2内含子(Yin等，2012)。所述sno-IncRNA2内含子(或“sno-RNA2内含子”)在snoRNA机器的两端上处理，这防止其降解并导致侧翼为snoRNA序列的IncRNA的累积，其缺乏5’帽和3’poly(A)尾。本文还考虑了其他对内含子序列赋予结构稳定性的序列。
本公开内容的一些方面涉及经改造构建体，其包含编码侧翼为核酶的gRNA的核苷酸序列。核酶是能够催化特异性生化反应的RNA分子，与蛋白质酶的作用相似。顺式作用核酶通常为自体形成并且能够自体切割。顺式作用核酶可介导从RNA pol II启动子的功能gRNA表达。相比而言，反式作用核酶不进行自体切割。自体切割指分子内的催化过程，其中含有核酶的RNA分子被其自身切割。根据本公开内容所使用的顺式作用核酶的实例包括但不限于锤头状(HH)核酶(参见例如，Pley等，1994，通过引用并入本文)以及丁型肝炎病毒(HDV)核酶(参见例如，Ferre-D’Amare等，1998，通过引用并入本文)。根据本公开内容所使用的反式作用核酶的实例包括但不限于发现于烟草环斑病毒(tobacco ringspotvirus，sTRSV)、菊苣黄色斑驳病毒(chicory yellow mottle virus，sCYMV)和南芥菜花叶病毒(arabis mosaic virus，sARMV)之卫星RNA中的发夹核酶的天然及人工形式。例如，图3A至图3C示出的示意图为编码侧翼为核酶之“gRNA1”的核苷酸序列。在一些实施方案中，经改造构建体含有多个串联的gRNA，每个的侧翼为编码核酶的核苷酸序列。这样的构建体本文可描述为具有编码至少2个gRNA的核苷酸序列，每个gRNA的侧翼为核酶。应当理解的是该构造意在包含多个串联的gRNA，每个gRNA的侧翼为单个核酶(Ribo)；还包含多个串联的gRNA，每个gRNA的侧翼为2个或更多个核酶。例如，在经改造构建体中，遗传元件的顺序可以如下：Ribo1-gRNA1-Ribo2-gRNA2-Ribo3-gRNA-Ribo4，其中单个核酶将1个gRNA与相邻的gRNA分开；或者Ribo1-gRNA1-Ribo2-Ribo3-gRNA2-Ribo4-Ribo5-gRNA-Ribo6，其中2个核酶将1个gRNA与相邻的gRNA分开。所述核酶可以是相同或不同的。即，在一些实施方案中，可以使用不同类型的核酶以从经改造构建体释放1个或更多个gRNA。
本公开内容的一些方面涉及编码目的蛋白质的核酸。目的蛋白质可以是任何蛋白质。目的蛋白质的实例包括但不限于涉及细胞信号传导(例如，受体/配体结合)及信号转导的那些。例如，目的蛋白质可以为纤维蛋白或球蛋白。纤维蛋白的实例包括但不限于细胞骨架蛋白和胞外基质蛋白。球蛋白的实例包括但不限于血浆蛋白(例如凝血因子、急性期蛋白)、血红素蛋白、细胞粘附蛋白、跨膜转运蛋白(例如，离子通道蛋白、同向转运蛋白、逆向转运蛋白)、激素和生长因子、受体(例如，跨膜受体、胞内受体)、DNA结合蛋白(例如，转录因子或其他涉及转录调控的蛋白质)、免疫***蛋白、营养物储存/转运蛋白、伴侣蛋白，以及酶。考虑了其他蛋白质，并可以根据本公开内容使用。
本公开内容的一些方面考虑了将基于CRISPR的机制与哺乳动物RNA干扰机制进行整合，以例如实施更复杂的线路拓扑结构。如非限制性实施例8所示，将微小RNA调控与CRISPR-TF和Csy4合并，以通过移除同源miRNA结合位点破坏miRNA对靶RNA的抑制。RNA干扰通常指这样的生物学过程，其中RNA分子通常通过对特定mRNA分子的破坏抑制基因表达。这样的RNA分子的实例包括微小RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)。
miRNA是短的非编码单链RNA分子。本公开内容的miRNA可为天然存在的或合成的(例如，人工的)。miRNA通常通过与在所靶向的mRNA3’UTR(非翻译区)内发现的靶位点结合来诱导基因沉默。该相互作用通过抑制蛋白质的合成和/或通过启动mRNA的降解而阻止蛋白质的产生。mRNA上的大多数靶位点与其对应的微小RNA仅具有部分碱基互补性，因此，单独的微小RNA可靶向100个不同的mRNA，或更多个。此外，单独的mRNA可含有不同miRNA的多个结合位点，从而导致复杂的调控网络。在一些实施方案中，miRNA的长度为10至50个核苷酸。例如，miRNA的长度可以为10至40、10至30、10至20、20至50、20至40或20至30个核苷酸。在一些实施方案中，miRNA的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，miRNA的长度为22个核苷酸。
siRNA是短的非编码单链RNA分子。本公开内容的siRNA可为天然存在的或合成的(例如，人工的)。siRNA与同源mRNA的结合通常导致所述mRNA的降解。在一些实施方案中，siRNA的长度为10至50个核苷酸。例如，siRNA的长度可以为10至40、10至30、10至20、20至50、20至40或20至30个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA的长度为21至25个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的经改造构建体包含与核苷酸序列(例如，编码目的蛋白质)有效相连的启动子。“启动子”是核酸的控制区，在该区核酸其余部分的转录起始和速率受到控制。启动子也可含有亚区域，在该区域调控蛋白和分子可结合例如RNA聚合酶和其他转录因子。启动子可以是组成型的、诱导型的、可激活的、可抑制的、组织特异性的、或其任意组合。
启动子驱动其调控的核酸序列的表达或转录。当启动子位于其所调控的核苷酸序列相关的正确功能位置和方向以控制(“驱动”)该序列的转录起始和/或表达时，则认为所述启动子被“有效连接”。
可根据启动子对RNA聚合酶(和/或σ因子)的亲和性将其分类为强或弱；这与启动子序列与聚合酶理想的共有序列相似的相近程度相关联。启动子的强度可依据在该启动子上发生的转录起始是高频还是低频。可以使用具有不同强度的不同启动子以构建具有不同基因/蛋白质表达水平(例如，从弱启动子起始的表达的水平低于从强启动子起始的表达的水平)的核酸。
启动子可以是一个与基因或序列天然缔合的启动子，如可通过分离位于给定基因或序列编码区段上游的5’非编码序列获得。这样的启动子可称为“内源的”。在一些实施方案中，本公开内容的gRNA被设计为靶向内源启动子(例如，内源人启动子)。
在一些实施方案中，核苷酸序列可位于重组或异源启动子的控制下，其是指在其自然环境下通常不与该核苷酸序列缔合的启动子。这样的启动子可包括其他基因的启动子；从任何其他原核细胞分离的启动子；以及不“天然存在”的合成启动子，例如包含不同转录调控区和/或突变的不同元件的那些，其通过本领域已知的遗传改造方法改变表达。除了通过合成产生启动子的核苷酸序列之外，也可使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR))产生序列。
在一些实施方案中，从启动子起始转录依赖于RNA聚合酶(也称为DNA依赖性RNA聚合酶)的活性。RNA聚合酶是在RNA转录本的3’末端聚合核糖核苷酸的核苷酸基转移酶。真核生物具有多种类型的细胞核RNA聚合酶，每一种负责不同RNA亚组的合成。所有RNA聚合酶均在结构和机制上彼此相关以及与细菌RNA聚合酶相关。RNA聚合酶I合成前rRNA 45S(在酵母中为35S)，其成熟为28S、18S和5.8S rRNA，它们将形成核糖体的主要RNA部分。RNA聚合酶II合成大多数snRNA和微小RNA以及mRNA的前体。RNA聚合酶III合成tRNA、rRNA 5S以及其他发现于细胞核及胞质中的小RNA。RNA聚合酶IV合成植物中的siRNA。RNA聚合酶V合成在植物中参与siRNA所引导的异染色质形成的RNA。
在一些实施方案中，本文考虑了RNA poi II和RNA pol III启动子。通过RNA聚合酶II引导准确的转录起始的启动子称为RNA pol II启动子。根据本公开内容所使用的RNApol II启动子的实例包括但不限于人巨细胞病毒启动子、人泛素启动子、人组蛋白H2A1启动子和人炎性趋化因子CXCL1启动子。本文还考虑了其他RNA pol II启动子。通过RNA聚合酶III引导准确的转录起始的启动子称为RNA pol III启动子。根据本公开内容所使用的RNA pol III启动子的实例包括但不限于U6启动子、H1启动子和转移RNA的启动子、5S核糖体RNA(rRNA)以及信号识别颗粒7SL RNA。
在一些实施方案中，启动子可以是诱导型启动子。诱导型启动子是这样的启动子，其特征在于，当其在诱导物或诱导剂存在、影响或接触下，会起始或增强转录活性。诱导物或诱导剂可以是内源的或通常为外源条件、化合物或蛋白质，其以这样的方式接触经改造核酸，从而在由该诱导型启动子诱导转录活性中有活性。
本公开内容的经改造核酸可使用标准分子生物学方法(参见，例如Green和Sambrook，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2012，Cold Spring Harbor Press)产生。
在一些实施方案中，使用GIBSONCloning(参见例如，Gibson，D.G.等Nature Methods，343-345，2009；和Gibson，D.G.等Nature Methods，901-903，2010，其各自通过引用并入本文)产生经改造构建体和/或经改造核酸。GIBSON通常在单个试管反应中使用3种酶促活性：5’核酸外切酶、DNA聚合酶的3’延伸活性和DNA连接酶活性。所述5’核酸外切酶活性回嚼(chew back)序列的5’末端，并暴露互补序列以用于退火。然后，聚合酶活性填补在退火区域上的空位中。然后DNA连接酶封住该缺口并将DNA片段共价连接到一起。邻近片段的重叠序列远远长于用于Golden Gate组装的那些，并且因此导致更高百分比的正确组装。
在一些实施方案中，经改造构建体和/或经改造核酸包在于载体内。载体是用作人工地携带遗传物质(例如经改造核酸)至另一个细胞中的载剂(vehicle)的核酸(例如DNA)，在该细胞中，例如，其可被复制和/或表达。在一些实施方案中，载体是附加型载体(episomal vector)(参见例如Van Craenenbroeck K.等Eur.J.Biochem.267，5665，2000，通过引用并入本文)。载体的一个非限制性实例是质粒。质粒是双链的，通常为环状的DNA序列，其能够在宿主细胞中自动复制。质粒载体通常含有复制起始及转基因***物，前者使所述质粒得以在宿主中半独立复制。质粒可具有更多特征，包括例如，“多克隆位点”，其包括核苷酸突出端以用于核酸***物的***，以及在***物任意一侧的多个限制性酶共有位点。载体的另一个非限制性实例是病毒载体。
本公开内容的经改造构建体可表达于多种细胞类型中。在一些实施方案中，经改造构建体表达于哺乳动物细胞中。例如，在一些实施方案中，经改造构建体表达于人细胞、灵长类动物细胞(例如vero细胞)、大鼠细胞(例如，GH3细胞、OC23细胞)或小鼠细胞(例如MC3T3细胞)中。有多种人细胞系，包括但不限于HEK细胞、HeLa细胞、来自于国家癌症研究所的60个癌细胞系的癌细胞(NCI60)、DU145(***癌)细胞、Lncap(***癌)细胞、MCF-7(乳腺癌)细胞、MDA-MB-438(乳腺癌)细胞、PC3(***癌)细胞、T47D(乳腺癌)细胞、THP-1(急性髓性白血病)细胞、U87(胶质母细胞瘤)细胞、SHSY5Y人神经母细胞瘤细胞(克隆自骨髓瘤)以及Saos-2(骨癌)细胞。在一些实施方案中，经改造构建体表达于人胚胎肾(humanembryonic kidney，HEK)细胞(例如，HEK 293或HEK 293T细胞)中。在一些实施方案中，经改造构建体表达于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或其他类型细胞中。在一些实施方案中，经改造构建体表达于干细胞(例如，人干细胞)，例如多能干细胞(例如，人多能干细胞，包括人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cell，hiPSC))中。“干细胞”指具有在培养物中的不定期***能力以及产生特化细胞能力的细胞。“多能干细胞”指这样类型的干细胞，其能够分化为生物体的所有组织，但其单独不能够维持完整的生物体的发育。“人诱导多能干细胞”指这样的体(例如，成熟或成体)细胞，其通过强制表达对于维持胚胎干细胞的规定特性重要的基因和因子而已经被重编程为胚胎干细胞样状态(参见例如，Takahashi和Yamanaka，Cell 126(4)：663-76，2006，通过引用并入本文)。人诱导多能干细胞表达干细胞标志物并能够产生具有所有三个胚层(外胚层、内胚层、中胚层)特征的细胞。
可根据本公开内容所使用的细胞系的另外的非限制性实例包括293-T、293-T、3T3、4T1、721、9L、A-549、A172、A20、A253、A2780、A2780ADR、A2780cis、A431、ALC、B16、B35、BCP-1、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR293、BxPC3、C2C12、C3H-10T1/2、C6、C6/36、Cal-27、CGR8、CHO、CML T1、CMT、COR-L23、COR-L23/5010、COR-L23/CPR、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、E14Tg2a、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、Hepalc1c7、High Five细胞、HL-60、HMEC、HT-29、HUVEC、J558L细胞、Jurkat、JY细胞、K562细胞、KCL22、KG1、Ku812、KYO1、LNCap、Ma-Mel1、2、3....48、MC-38、MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468、MDCKII、MG63、MONO-MAC6、MOR/0.2R、MRC5、MTD-1A、MyEnd、NALM-1、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NW-145、OPCN/OPCT Peer、PNT-1A/PNT2、PTK2、Raji、RBL细胞、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、S2、Saos-2细胞、Sf21、Sf9、SiHa、SKBR3、SKOV-3、T-47D、T2、T84、THP1、U373、U87、U937、VCaP、WM39、WT-49、X63、YAC-1以及YAR细胞。
在一些实施方案中，本公开内容的细胞被修饰。被修饰的细胞为含有外源核酸或不天然存在的核酸的细胞。在一些实施方案中，被修饰的细胞含有基因组核酸中的突变。在一些实施方案中，被修饰的细胞含有外源独立复制的核酸(例如，存在于附加型载体上的经改造核酸)。在一些实施方案中，被修饰的细胞通过向细胞中引入外来或外源核酸产生。核酸可通过常规方法引入细胞中，例如电穿孔(参见例如Heiser W.C.TranscriptionFactorProtocols：Methods in Molecular BiologyTM 2000；130：117-134)、化学方法(例如磷酸钙或脂质)、转染(参见例如Lewis W.H.，等，Somatic CellGenet.19805月；6(3)：333-47；ChenC.，等，Mol Cell Biol.19878月；7(8)：2745-2752)、与含有重组质粒的细菌原生质体融合(参见例如Schaffner W.Proc Natl Acad Sci USA.19804月；77(4)：2163-7)，或将纯化的DNA直接微注射到细胞的核中(参见例如Capecchi M.R.Cell.198011月；22(2Pt 2)：479-88)。
在一些实施方案中，细胞被修饰以过表达目的内源蛋白质(例如，通过引入或者修饰启动子或编码目的蛋白质的内源基因附近的其他调控元件，以提高其表达水平)。在一些实施方案中，通过诱变修饰细胞。在一些实施方案中，为了产生目的遗传改变，通过向细胞中引入重组核酸修饰细胞(例如通过***或同源重组)。在一些实施方案中，经改造核酸可以经过密码子优化，例如，以用于在人细胞或其他类型细胞中表达。密码子优化是在活生物体中通过将一个物种的DNA核苷酸序列转换至另一个物种的DNA核苷酸序列来提高目的基因的翻译效率，从而将蛋白质表达最大化的技术。密码子优化的方法是公知的。
本公开内容的经改造构建体可瞬时表达或稳定表达。“瞬时细胞表达”指未整合入细胞的细胞核基因组中的核酸的细胞表达。相比之下，“稳定细胞表达”指存留于细胞及其子细胞的细胞核基因组中的核酸的细胞表达。通常，为了获得稳定细胞表达，用标志物基因和旨在细胞中稳定表达的外源核酸(例如，经改造核酸)共转染细胞。所述标志物基因为细胞提供了某些可选择的优势(例如，对毒素、抗生素或其他因子的抗性)。极少的经转染细胞有机会将外源核酸整合至其基因组中。然后，如果例如向细胞培养物添加毒素，则仅有那些将毒素抗性标志物基因整合入其基因组中的少量细胞将能够增殖，而其他细胞将死亡。在将该选择压力施加一段时间后，仅具有稳定转染的细胞保留，并且可进一步培养。根据本公开内容所使用的标志物基因和选择剂的实例包括但不限于二氢叶酸还原酶与甲氨蝶呤、谷氨酰胺合成酶与甲硫氨酸亚砜亚胺(methionine sulphoximine)、潮霉素磷酸转移酶与潮霉素、嘌呤霉素N乙酰转移酶与嘌呤霉素，以及新霉素磷酸转移酶与遗传霉素，也称为G418。本文考虑了其他标志物基因/选择剂。
在瞬时转染的和/或稳定转染的细胞中的核酸表达可以是组成型或诱导型。本文提供使用的诱导型启动子已于上文中描述。
经修饰以包含本公开内容经改造构建体的哺乳动物细胞(例如，人细胞)可使用常规哺乳动物细胞培养方法进行培养(例如，维持于细胞培养物中)(参见例如PhelanM.C.Curr Protoc Cell Biol.20079月；第1章：1.1节，通过引用并入本文)。例如细胞可生长并维持在细胞培养箱中的合适的温度以及气体混合物中(例如，对于哺乳动物细胞为37℃，5％CO2)。对于每种细胞类型的培养条件可以变化。例如，细胞生长培养基可在pH、葡萄糖浓度、生长因子以及其他营养物的存在方面变化。用于补充培养基的生长因子通常来自于动物血液的血清，如胎牛血清(FBS)、小牛血清、马血清和/或猪血清。在一些实施方案中，本文提供使用的培养基可以是市售的和/或详细描述的(参见例如Birch J.R.，R.G..Spier(编辑)Encyclopedia of Cell Technology，Wiley.411-424，2000；KeenM.J.Cytotechnology 17：125-132，1995；Zang，等Bio/Technology.13：389-392，1995)。在一些实施方案中，使用了化学成分确定的培养基(chemically defined media)。
本文也在多个方面考虑了用于在细胞(例如，哺乳动物细胞，如人细胞)内构建遗传线路(包括转录级联)的方法和组合物。许多复杂的基因线路需要实施级联的能力，其中在一个阶段整合的信号被传送到多个下游阶段中，以进行处理和促动(actuation)。例如，基因级联对于合成生物学应用是重要的，如在活细胞中进行计算的多层人工基因线路(Weber和Fussenegger，2009)。转录级联对于天然调控***是重要的，如控制分节(segmentation)、性别决定以及发育的那些(Dequeant和Pourquie，2008；Peel等，2005；Sinha等，2014)。图6A和6B提供了本公开内容的多个经改造构建体可如何在单细胞中一起使用以构建转录级联的非限制性实例。
如图6A所示，例如，可将细胞用以下构建体共转染：具有“内含子-Csy4”构造的第一经改造构建体，以表达第一gRNA(“gRAN1”)，具有“三链体-Csy4”构造的第二经改造构建体mKate2，以表达第二gRNA(“gRNA2”)及EYFP，以及第三经改造构建体，设置为表达ECFP。所述细胞也表达Csy4和具有转录活性的Cas9(taCas9)。这些经改造构建体这样设置，以使得当在Csy4核糖核酸酶存在下表达时，gRNA1从构建体释放并导引taCas9蛋白至互补的在第二经改造构建体启动子内的gRNA1结合位点(并使mKate2表达)。然后，所述taCas9蛋白激活第二经改造构建体的转录，从而产生第二gRNA(“gRNA2”)(并使EYFP表达)。然后，gRNA导引taCas9蛋白至互补的在第三经改造构建体启动子内的gRNA2结合位点。然后，taCas9蛋白激活第三经改造构建体的转录，其表达ECFP。
如图6B所示，细胞可被例如2个经改造构建体共转染，每个均具有“三链体-Csy4”构造，其中由第一构建体所编码的gRNA(“gRNA1”)与由第二构建体所编码的gRNA(“gRNA2”)不同。图6B中每个构建体的激活机制与图6A所述的机制相似。
在一些实施方案中，本公开内容考虑了本文所提供的多个经改造构建体的表达。例如，细胞可表达2至500个或更多个不同的经改造构建体。在一些实施方案中，细胞可表达2至10、2至25、2至50、2至75、2至100、2至200、2至300或2至400个不同的经改造构建体。在一些实施方案中，细胞可表达2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个不同的本公开内容的经改造构建体。如果经改造构建体的遗传元件的构造不同，则认为这些构建体是彼此不同的，如图6A所示。如果经改造构建体的遗传元件的构造相同，但是具体的元件不同，则也认为这些构建体是彼此不同的，如图6B所示。
应当理解的是，在一些实施方案中，本文所提供的遗传元件为模块化的(modular)，以使得细胞可包含多个本公开内容的经改造构建体，每个构建体包含以不同方式设置的不同元件组合，只要元件设置的方式允许转录激活以及随后的核酸表达。例如，经改造构建体可包含与核酸有效相连的启动子(例如，RNA pol II启动子)，所述核酸包含：(a)编码至少1个导引RNA(gRNA)的核苷酸序列；以及(b)选自以下的一个或更多个核苷酸序列：(i)编码目的蛋白质的核苷酸序列和(ii)编码RNA干扰分子的核苷酸序列。这样的经改造构建体可以还包含或可以不包含gRNA或RNA干扰分子(例如，miRNA)侧翼的同源内含子剪接位点。
编码gRNA的核苷酸序列侧翼可以为核糖核酸酶识别位点(例如Csy4核糖核酸酶识别位点)或者gRNA的侧翼可以为核酶。在一些实施方案中，经改造构建体包含编码侧翼为核糖核酸酶识别位点的gRNA的核苷酸序列与编码侧翼为核酶的gRNA的核苷酸序列的组合。在一些实施方案中，经改造构建体包含编码侧翼为核糖核酸酶识别位点的gRNA的第一核苷酸序列与编码侧翼为核酶的gRNA的第二核苷酸序列的组合，其中所述第一核苷酸序列或所述第二核苷酸序列的侧翼为同源内含子剪接位点。在一些实施方案中，经改造构建体包含编码侧翼为核糖核酸酶识别位点的gRNA的第一核苷酸序列与编码侧翼为核酶的gRNA的第二核苷酸序列的组合，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列每个的侧翼均为同源内含子剪接位点。在一些实施方案中，经改造构建体包含编码侧翼为核糖核酸酶识别位点的gRNA的第一核苷酸序列和/或编码侧翼为核酶的gRNA的第二核苷酸序列，以及侧翼为同源内含子剪接位点的编码gRNA(其侧翼有或没有核糖核酸酶识别位点或核酶)的额外的核苷酸序列的组合。
在一些实施方案中，编码目的蛋白质的核苷酸序列也可编码侧翼为核糖核酸酶识别位点的gRNA，其侧翼为同源内含子剪接位点。在一些实施方案中，侧翼为核糖核酸酶识别位点的gRNA也可在目的蛋白质内编码RNA干扰分子(例如miRNA和/或siRNA)。
本公开内容的经改造构建体依据构建体具体的构造和稳定性，可包含或可不包含编码三螺旋结构的核苷酸序列。
本文在多个方面也考虑了用于“重接”细胞调控线路的方法和组合物。基于CRISPR转录因子的调控可与RNA干扰整合，例如以使抑制输出无活性，和/或反之激活无活性的输出。如图7A至7F所示，本公开内容整合的方法可用于重接遗传组件之间的多个互连和反馈环，从而导致线路行为同步转换(synchronized shift)。
因此，本公开内容的多个方面和实施方案可用于促进多机制遗传线路的构建，该线路整合RNA干扰和基于CRISPR的***以用于可调的、多输出基因调控。此外，基于核糖核酸酶的RNA处理可用于重接遗传组件之间的多个互连和反馈环，从而导致线路行为的同步转换。
实施例
实施例1.用RNA三螺旋和Csy4产生功能gRNA
使得复杂的基于CRISPR-TF线路成为可能的重要的第一步是从人细胞的RNAP II启动子产生功能gRNA，其允许gRNA产物与特异性调控信号偶联。例如，gRNA依赖性线路的激活可在限定的细胞类型或状态下，或响应于外界输入被起始。此外，从单个转录本同时表达gRNA以及蛋白质的能力是有益的。这使得能够从简洁的遗传构造产生多个输出，所述输出包括效应物蛋白质和调控连接。其也可使得能够将gRNA表达整合到内源基因座中。因而，本实施例证明了这样的***，其中通过内源RNAP II启动子，同时产生功能gRNA和蛋白质。
在本实施例中利用来自于铜绿假单胞菌之Csy4蛋白的RNA结合与RNA核酸内切酶能力(Haurwitz等，2012；Sternberg等，2012)。Csy4识别28个核苷酸的RNA序列(下文中称为“28”序列)，切割RNA，并保持与RNA片段上游的结合(Haurwitz等，2012)。因此，利用Csy4以从由RNAP II启动子产生的转录本释放gRNA，其也编码功能蛋白质序列。为了产生含有gRNA的转录本，使用强效的CMV启动子(CMVp)以表达mKate2蛋白。在mKate2编码区的下游编码侧翼为2个Csy4结合位点的gRNA(gRNA1)(图1A)。在该构造中，通过Csy4切割RNA释放出功能gRNA，而且从上游mRNA(在该情况中编码mKate2)移除了poly(A)尾，从而导致大多数真核生物mRNA的翻译受损(Jackson，1993；Proudfoot，2011)。
为了使得缺乏poly(A)尾的mRNA能够有效地翻译，使用了三螺旋结构以功能性地补充poly(A)的丧失。将来源于小鼠MALAT1基因座3’末端的110bp片段(Wilusz等，2012)克隆至mKate2的下游以及侧翼为Csy4识别位点的gRNA序列的上游。在许多人癌症中，MALAT1IncRNA失调(Lin等，2006)，并且尽管缺乏poly(A)尾，MALAT1仍是稳定的转录本(Wilusz等，2008；Wilusz等，2012)，其被高度保守的3’三螺旋结构(三链体)保护以防止外来体和3，-5，核酸外切酶(Wilusz等，2012)。因此，最终的“三链体/Csy4”构造是由CMVp驱动的mKate2转录本，其具有3’三链体序列，之后为28-gRNA-28序列(CMVp-mK-Tr-28-gRNA-28)(图1A)。
为了表征gRNA活性，用CMVp-mK-Tr-28-gRNA1-28表达质粒以及编码合成P1启动子的质粒共转染HEK-293T细胞，所述P1启动子特异性地由gRNA1激活以表达EYFP。该P1启动子含有gRNA1的8x结合位点并且基于最小启动子构建体(Farzadfard等，2013)。在本实验及随后的那些实验中(除非另有说明)，用CMV启动子表达的具有转录活性的dCas9-NLS-VP64蛋白(taCas9)共转染细胞。用0ng至400ng的Csy4表达质粒(其中通过鼠PGK1启动子产生Csy4)以及1μg的其他质粒(原始数据见图1B和图8A)共转染HEK-293T细胞。
提高的Csy4浓度水平未导致mKate2水平的降低，而是导致5倍的提高(图1B)。此外，产生自该构建体的功能gRNA诱导了从P1启动子EYFP的达60倍的表达。虽然mKate2表达随着Csy4表达质粒的浓度继续提高，但是EYFP激活在50ng的Csy4产生质粒之后达到平台(plateau)。此外，有证据表明400ng的Csy4质粒浓度具有细胞毒性。因此，在后续实验中使用了100ng至200ng的Csy4质粒(除非某处另有说明)，尽管这会减少转染之后的Csy4阳性细胞数目。或者，可使用更弱的启动子以降低Csy4表达水平，或者可以用低或中等的Csy4水平产生稳定细胞系。
有趣的是，尽管5’Csy4识别位点单独应足以从RNA转录本释放gRNA，然而该变体构造并未产生能够激活下游靶启动子至背景水平之上的功能gRNA(数据未展示)。不被理论束缚，这可能是由于RNA不稳定、poly(A)介导的胞质转运、具有taCas9活性的poly(A)尾的干扰，或其他机制。
还对Csy4和taCas9对mKate2表达的相对作用进行了表征。在Csy4和taCas9、Csy4单独、taCas9单独，或没有其中任何一种蛋白质存在的情况下，测量了来自基于“三链体/Csy4”的gRNA表达构建体的mKate2荧光(图1C和图9)。最低的mKate2荧光水平来源于仅有taCas9的条件。不被理论束缚，因为使用了具有强细胞核定位序列(nuclear localizationsequence，NLS)的taCas9，所述该作用可能产生自taCas9与在mRNA内的gRNA的结合并将转录本定位于核。该理论得到了数据的支持，该数据证明，即便不存在Csy4，内源启动子可被产生自基于“三链体/Csy4”构造的gRNA激活(参见下文及图1D、图1E)。用单独Csy4获得了最高的mKate2表达水平，表明Csy4处理可增强mKate2水平。在Csy4和taCas9两者都不存在以及Csy4和taCas9两者都存在的情况下，mKate2表达相似，并且相比于仅有Csy4的情况降低了3倍至4倍。
实施例2.用从人启动子表达的CRISPR-TF对内源基因座进行调节
为了证实“三链体/Csy4”构造的稳健，对其进行调整以调节人细胞中天然基因组靶标的表达。通过共表达4个不同的gRNA，即gRNA3至gRNA6，靶向内源IL1RN基因座以用于基因激活(表1)(Perez-Pinera等，2013a)。
表1.该研究中使用的序列
4个gRNA的每一个均被设计为与mKate2伴随地表达，每个均来自于单独的质粒。每组的4个gRNA由下列启动子中的1个调控(根据其在HEK-293T细胞中的活性水平降序排列)：巨细胞病毒立即早期(CMVp)、人泛素C(UbCp)、人组蛋白H2A1(H2A1p)(Rogakou等，1998)，以及人炎性趋化因子CXCL1(CXCL1p)启动子(Wang等，2006)。作为对照，使用了RNAP III启动子U6(U6p)驱动4个gRNA的表达。对于每种测试的启动子，将4种编码所述4个不同gRNA的质粒与表达taCas9和Csy4的质粒一起共转染。作为阴性对照，用表达gRNA1的质粒替代靶向IL1RN的gRNA表达质粒，所述表达gRNA1的质粒对于IL1RN启动子为非特异性的(图1D，“NS”)。
使用qRT-PCR以对内源IL1RN基因的mRNA水平进行定量，并以阴性对照归一化结果。对于U6启动子调控的4个gRNA，IL1RN激活水平相对于阴性对照，在不存在Csy4的情况下提高了8,410倍，而在有100ng的Csy4表达质粒的情况下提高了6,476倍(图1D，“U6p”)。用从CMV启动子表达的gRNA明显激活IL1RN(图1D，“CMVp”)，在不存在Csy4的情况下有61倍的增强，而存在Csy4的情况下有1539倍的增强。人RNAP II启动子在不存在Csy4的情况下产生了约2至7倍的激活，而在存在Csy4的情况下产生了约85至328倍的激活(图1D，“CXCLp”、“H2A1p”、“UbCp”)。
为了进一步表征内源基因调控的输入-输出转移功能，将由每种启动子所产生的mKate2荧光用作多种RNAP II启动子之输入启动子活性的标志(图1E)。在所测试的mKate2的范围中，所得到的IL1RN激活中的转移函数几乎为线性。该数据表明，IL1RN的激活在所测试的条件下并未饱和，并且用人RNAP II启动子可获得大动态范围的内源基因调控。因此，使用具有从“三链体/Csy4”构造表达的gRNA的CRISPR-TF可达到天然基因的可调调节。
实施例3.从具有Csy4的内含子产生功能gRNA
作为对“三链体/Csy4”构造的补充，开发出了用于通过在基因编码序列中的内含子内编码gRNA，而从RNAP II启动子产生功能gRNA的一个替代策略。具体而言，使用“共有”接受体、供体，以及分支序列，将gRNA1作为mKate2编码序列内的内含子进行编码(图2A)(Smith等，1989；Taggart等，2012)。出人意料的是，该简单的构造产生不可检测的EYFP水平(图10，下图)。不被理论束缚，没有任何稳定化的情况下，内含子gRNA表现为快速地降解。为了稳定内含子gRNA，使用了产生长寿命内含子的内含子序列。这些序列包括如HSV1潜伏相关内含子和sno-IncRNA2(snoRNA2)内含子，前者形成稳定的环状内含子(Block和Hill，1997)。所述snoRNA2内含子的两端被snoRNA机器处理，这保护该内含子不被降解并导致侧翼为snoRNA序列的IncRNA的累积，所述snoRNA序列缺乏5’帽和3’poly(A)尾(Yin等，2012)。然而，这些用于产生稳定内含子gRNA的方法也导致了靶启动子不可检测的激活(数据未示出)。
作为一个替代策略，通过在gRNA盒侧翼添加2个Csy4识别位点稳定内含子gRNA。不被理论束缚，经剪接的含有gRNA的内含子应当被Csy4结合，这应当释放功能gRNA。与“三链体/Csy4”设置相比，Csy4也可在剪接发生之前潜在地结合并消化前mRNA。在此情况下，将会产生功能gRNA，但含有mKate的前mRNA在该过程中被破坏(图2A)。因此，提高的Csy4浓度预期会导致mkate2水平降低但功能gRNA的水平更高。不被理论束缚，在该构造中，随着Csy4浓度的mKate2水平的降低以及功能gRNA的提高预期依赖于几种因素，其示于图2A中(黑线，不依赖于Csy4的过程；灰线，Csy4介导的过程)。这些竞争性因素包括Csy4与其靶位点结合并切割RNA的速率、剪接的速率，以及Csy4不存在下经剪接的gRNA的降解速率。为了检查“内含子/Csy4”构造的行为，使用了CMV启动子以驱动HSVl、snoRNA和含有侧翼为两个Csy4结合位点的gRNA1的共有内含子与mKate2(CMVp-mKEX1-[28-g1-28]内含子-mKEX2)，以及调控EYFP表达的合成P1启动子的表达(图2A)。
通过EYFP激活测定，Csy4的存在产生功能gRNA1(原始数据参见图2B至图2D和图8B)。产生自HSV1内含子的gRNA1产生了最强的EYFP激活(图2D)，其在200ng的Csy4质粒下达到饱和。相比之下，snoRNA2内含子使EYFP表达在50ng的Csy4质粒下达到饱和，但由该内含子产生的最大EYFP水平在所有测试的内含子中最低(约为HSV1内含子的65％)。此外，Csy4水平的提高伴随地降低了mKate2的水平。虽然这些趋势对所有三种测试的内含子是相似的，但作用的量级是内含子特异性的。snoRNA2内含子表现出随着Csy4质粒浓度提高的最大的mKate2水平降低，在400ng的Csy4质粒下，相比于无Csy4条件，具有15倍的mKate2荧光的降低(图2C)。共有和HSV1内含子表现出mKate2水平对Csy4水平提高的较低敏感性(图2B和图2D)。因此，该“内含子/Csy4”方法与“三链体/Csy4”构造一起，提供了用于从翻译的基因可调产生功能gRNA的一套组件。具体地，含有gRNA的基因及下游靶基因的绝对蛋白质水平，以及它们之间的比，可通过Csy4的浓度和具体组件的选择确定。
实施例4.Csy4和内含子gRNA之间的相互作用
为了确定是否5’和3’Csy4识别位点两者对于功能gRNA从内含子产生都是必需的，使用了mKate2内基于HSV1的内含子。该内含子包含gRNA1序列，所述序列在其5’侧的前面有Csy4结合位点(“28-gRNA”，图2E和图11)，或者在其3’末端的后面有Csy4结合位点(“gRNA-28”，图2F和图11)。使用了合成P1-EYFP构建体评估gRNA1活性。以“内含子/Csy4”构造的性能归一化图2E和2F的数据，其中内含子gRNA1侧翼为2个Csy4结合位点(“28-gRNA-28”，图11)。这两种仅含有单个Csy4结合位点的构造的mKate2水平，相对于无Csy4的情况，都随着Csy4的添加而降低(图2E，图2F)。
相比之下，通过gRNA1引导的CRISPR-TF的下游EYFP激活对于单个Csy4结合位点构造(图2E，图2F)显著低于“内含子/Csy4”构建体(图2D)。当仅有1个Csy4结合位点位于gRNA1内含子的5’末端时，EYFP的表达不可检测(图2E)。当仅有1个Csy4结合位点位于gRNA1内含子的3’末端时，相比于“内含子/Csy4”构造(其含有gRNA1侧翼的Csy4识别位点)(图2D)，观察到EYFP水平6倍的降低(图2F)。不受理论束缚，可能Csy4可以帮助稳定内含子gRNA。例如，被Csy4切割的RNA的5’末端含有羟基(OH-)，其可保护它们不受主要的5’-＞3’细胞RNA酶(如XRN家族)的作用，所述RNA酶需要5’磷酸以用于底物识别(Houseley和Tollervey,2009；Nagarajan等，2013)。此外，Csy4蛋白与被切割的gRNA 3’末端的结合(Haurwitz等，2012)可保护其不受由真核生物外来体复合物所介导的3’-＞5’降解(Houseley和Tollervey，2009)。
实施例5.用顺式作用核酶产生功能gRNA
除了上文描述的基于“三链体/Csy4”和“内含子/Csy4”的机制外，还利用了自体切割核酶以使得能够在人细胞中通过产生自RNAP II启动子的gRNA进行基因调控。具体而言，对gRNA进行改造，以使其在其5’末端含有锤头状(HH)核酶(Pley等，1994)并在其3’末端含有HDV核酶(Ferre-D′Amare等，1998)，如图3所示。测试了3种不同构造中的核酶，所有均由CMVp驱动：(1)mKate2转录本，其后为三链体和HH-gRNA1-HDV序列(CMVp-mK-Tr-HH-g1-HDV，图3A)；(2)mKate2转录本，其后为HH-gRNA1-HDV序列(CMVp-mK-HH-g1-HDV，图3B)；以及(3)HH-gRNA1-HDV序列本身，无相关联的蛋白质编码序列(CMVp-HH-g1-HDV，图3C)。将从这些构造产生的gRNA与之前所述的通过RNAP III启动子U6和“三链体/Csy4”构造(具有200ng的Csy4质粒)产生的gRNA相比较。所有构建体使用gRNA1，其驱动从含有P1-EYFP的质粒的EYFP表达。
所有含有mKate2的构建体均表现出可检测的mKate2荧光水平(图3D和图12)。出人意料的是，这包括CMVp-mK-HH-g1-HDV，其不含有三链体序列，并因此，由于poly(A)尾的移除而预期为具有低mKate2水平。不受理论束缚，这可能是由于无效的核酶切割(Beck和Nassal，1995；Chowrira等，1994；R Hormes，1997)，这允许未处理的转录本被转运至胞浆并翻译，mKate2转录本受到残留的3’核酶序列的保护，或其他机制。在输出EYFP激活的方面，最高EYFP荧光水平从U6p表达的gRNA产生，随后为CMVp-HH-g1-HDV和CMVp-mK-HH-g1-HDV构建体(图3D)。CMVp-mK-Tr-HH-gRNA1-HDV和“三链体/Csy4”构造具有相似的EYFP水平。
顺式作用核酶是有用的，并可介导从RNAP II启动子的功能gRNA表达。具有可由外界配体调控的活性的核酶(如茶碱)也可用于引发gRNA的外源释放。然而，这样的策略不能将胞内核酶活性与单细胞内所产生的内源信号相关联。相比之下，如下所示，遗传编码的Csy4的表达可用于重接由RNA引导的遗传线路并改变其行为(图7)。因此，反式作用核酶可用于将RNA切割和gRNA产生与细胞内事件相关联。
实施例6.从单RNA转录本进行多重gRNA表达
为了证明从单个RNA转录本表达2个独立的gRNA激活2个独立的下游启动子，使用了2种构造。在第一种构造(“内含子-三链体”)中，在HSV1内含子内编码gRNA1，其侧翼为位于mKate2编码序列内的2个Csy4结合位点。此外，被2个Csy4结合位点包围的gRNA2在mKate2-三链体序列的下游编码(图4A，CMVp-mKEX1-[28-g1-28]HSV1-mKEX2-Tr-28-g2-28)。在第二种构造中(“三链体-串联”)，gRNA1和gRNA2两者都用Csy4结合位点所围绕，并串联放置于mKate2-三链体序列的下游(图4B，CMVp-mK-Tr-28-g1-28-g2-28)。在这两种构造中，gRNA1和gRNA2分别靶向合成启动子P1-EYFP和P2-ECFP。
如图4C所示(原始数据参见图13)，这两种策略均导致活性多重gRNA的产生。“内含子-三链体”构建体表现出在200ng的Csy4质粒存在下，相比于无Csy4，有3倍的mKate2下降、10倍的EYFP提高，以及100倍的ECFP提高。在“三链体-串联”构造中，在200ng的Csy4存在下，相比于无Csy4，mKate2、EYFP和ECFP的表达分别提高了3倍、36倍和66倍。与“三链体-串联”构建体相比，“内含子-三链体”构造具有更高的EYFP和ECFP水平。因此，这两种用于多重gRNA表达的策略均使得在多个下游靶标有CRISPR-TF活性，并可以对所需的应用进行调整。
为了进一步探究多重构建体的可扩展性，并证明其在靶向内源基因座中的应用，从单个转录本产生了4个不同的gRNA种类。将这4个对于IL1RN激活所需的gRNA串联地克隆到单个转录本上的mKate2-三链体序列的下游，由Csy4结合位点分开(图5A)。将由该多重单个转录本构建体激活的IL1RN与这样的构造相比较，该构造中从4种不同的质粒表达4个不同的gRNA(图5B，分别为“多重”对“非多重”)。在100ng的Csy4质粒存在下，多重构造导致了相对于非特异性gRNA1(“NS”)约1111倍的激活，并比单gRNA表达质粒的非多重组更有效约2.5倍。此外，即使不存在Csy4，检测到多重构造的约155倍的IL1RN的激活，这表明即便不存在Csy4，taCas9也可结合gRNA并募集其用于基因激活。这些结果证明，有可能从单个的简洁RNA转录本编码多个功能gRNA，以用于多重表达。因此，这些构造使得能够紧凑编程Cas9功能，以用于实施多输出的合成基因线路、用于调节内源基因，以及用于潜在地获得有条件的多重基因组编辑。
实施例7.具有RNA导引的调控的合成转录级联
为了证明RNA依赖性调控构建体的用途，本文使用其创建了第一基于CRISPR-TF的转录级联。将“三链体/Csy4”和“内含子/Csy4”策略整合以建立2种不同的三阶段CRISPR-TF介导的转录级联(图6)。在第一种设计中，来自“内含子/Csy4”构建体的由CMVp驱动的gRNA1表达从HSV1内含子产生gRNA1，其激活合成启动子P1以从“三链体/Csy4”构造产生gRNA2，其随后激活下游调控ECFP的合成启动子P2(图6A)。在第二种设计中，级联第一阶段中的内含子gRNA表达盒被替换为“三链体/Csy4”构造，以表达gRNA1(图6B)。这两种设计在200ng的Csy4质粒存在下进行测试(图6C、6D和图14)。
在第一种级联设计中，相比于对照，观察到EYFP 76倍的提高和ECFP 13倍的提高，对照中将级联的第二阶段(P1-EYFP-Tr-28-g2-28)替换为空质粒(图6C)。在第二种级联设计中，相比于对照，观察到EYFP31倍的提高和ECFP 21倍的提高，对照中将级联的第二阶段(P1-EYFP-Tr-28-g2-28)替换为空质粒(图6D)。这些结果证明，存在通过gRNA1的启动子P2的最小非特异性激活，其对于转录级联的可扩展性和可靠性是关键的。此外，级联中每一阶段的倍数激活依赖于所有上游节点(node)的存在，这是在正确起作用的转录级联中所预期的(图6C、6D)。
实施例8.重接RNA依赖性的合成调控线路
下述实验试图证明CRISPR-TF调控如何可以与哺乳动物RNA干扰整合，以实施更复杂的线路拓扑结构。此外，下述实验示出了网络基序如何可以基于以Csy4为基础的RNA处理而被重接。具体而言，将miRNA调控与CRISPR-TF合并，并使用Csy4通过移除同源miRNA结合位点干扰miRNA对靶RNA的抑制。建立单个RNA转录本，其能够表达功能miRNA(Greber等，2008；Xie等，2011)和功能gRNA两者。这是通过编码mKate2基因内共有内含子内部的哺乳动物miRNA，以及随后的三链体序列和侧翼为Csy4识别位点的gRNA1序列所实现的(图7A，CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28)。也使用了2种输出构建体，以证明用经改造构建体进行多重基因调控的潜力。第一输出为组成型表达的ECFP基因，其后为三链体序列、Csy4识别位点、8x miRNA结合位点(8x miRNA-BS)，以及另一个Csy4识别位点(图7A)。第二输出为合成P1启动子，其调控EYFP表达(图7A)。
在Csy4不存在下，ECFP和EYFP水平低，因为miRNA抑制了ECFP表达，并且没有功能gRNA1产生(图7B和图15“机制1”)。在Csy4存在下，相比于无Csy4条件，ECFP表达提高30倍，我们将其归因于Csy4诱导的8x miRNA-BS与ECFP转录本的分离(图7B)。此外，Csy4的存在产生了功能gRNA1，导致相比于无Csy4条件EYFP表达提高了17倍(图7B)。mKate2荧光水平在Csy4阳性和Csy4阴性条件下均高。因此，通过同时使抑制性输出连接失活并使激活性输出连接有功能，Csy4催化了基于RNA的线路连接的重接，该连接位于输入节点及其2个输出之间(图7C)。
为了证明使用RNA依赖性机制可对额外的线路拓扑结构进行编程的便捷特性，通过在含有mKate的转录本3’末端并入额外的4x miRNA-BS，对图7A中的设计进行了扩展(图7D，CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28-miR4xBS)。在Csy4不存在下，这通过产生于mKate2内含子内的miRNA导致了mKate2表达的自调控负反馈抑制(图7E和图15，“机制2”)。此外，由于miRNA对ECFP的抑制及缺乏功能gRNA1的产生，ECFP和EYFP两者的水平均保持较低。然而，在Csy4存在下，由于Csy4介导的4x miRNA-BS与mKate2转录本的分离，mKate2水平提高了21倍。此外，miRNA对ECFP的抑制以相似的方式得到缓解，导致了ECFP水平27倍的提高。最后，产生了功能gRNA1，导致EYFP水平50倍的提高(图7E)。因此，通过同时使抑制性输出连接失活、使激活性输出连接有功能，并使自调控反馈环路失活，Csy4催化了基于RNA的线路连接的重接，该连接位于输入节点及其2个输出之间(图7F)。
合成生物学提供了用于通过破坏、重接以及模仿天然网络基序(network motif)来研究天然调控网络的工具。此外，合成线路可用于连接外源信号与内源基因调控，以实施生物医学应用及进行细胞计算。尽管许多合成基因线路基于转录调控，然而基于RNA的调控可用于构建多种合成基因线路。尽管有许多优势，然而先前的工作并未将基于RNA的调控与CRISPR-TF整合，考虑到其可编程性以及多重的潜力，它们对于实施可扩展的遗传线路均是有前景的策略。本文提供了用于在人细胞中对人工基因线路和内源基因调控进行改造的构建体。该框架整合了哺乳动物RNA调控机制与来自于细菌的RNA依赖性蛋白质dCas9和RNA加工蛋白Csy4。此外，这使得能够基于核酸之间的碱基配对互补对调控连接进行方便的编程。
在一些实施方案中，本文提供了多种互补的方法，以从RNAP II启动子调控的蛋白质编码序列产生功能gRNA，其也允许目的蛋白质的伴随表达。所使用的基因为荧光基因，因为它们是启动子活性的方便的报告基因。然而，这些基因可容易地与任何其他蛋白质编码序列交换，从而使得能够从单个构建体多重表达gRNA以及任意蛋白质输出。基于RNA三链体与Csy4、RNA内含子与Csy4、以及顺式作用核酶，证实了这些策略通过靶向合成启动子产生功能gRNA的能力。此外，当gRNA侧翼为Csy4识别位点并位于RNA三链体之前的基因的下游时，所述基因的水平随着Csy4的水平而提高。相反的作用发现于当gRNA侧翼为Csy4识别位点并位于内含子之内时，该作用的量级根据所使用的特定内含子序列而变化。因此，这些互补的构造使得能够在合成基因线路内获得可调的RNA和蛋白质水平。
作为对合成线路的补充，在一些实施方案中，本公开内容的经改造构建体可用于从多个不同的人RNAP II启动子以及CMV启动子激活内源启动子。在一些实施方案中，本文提供了新策略以用于从紧凑的单个转录本的多重gRNA表达，以对合成和天然启动子两者进行调节。该特征是有用的，因为其可用于例如从单个节点调控多个节点。在单个转录本内简洁地编码多个gRNA的能力使得具有大量平行“输出端(fan-ont)”(例如，来自给定节点的对外互连)的复杂线路以及具有密集互连的网络成为可能。此外，用几个gRNA以精简的方式协同调节内源基因座的能力是有优势的，因为例如，经常需要多个gRNA以对天然启动子进行明显的调节。因此，在一些情况下，本文所述的经改造构建体可用于建立有效的人工基因网络以及微扰天然调控网络。
除了转录调控之外，在一些实施方案中，也可使用成熟的核酸酶Cas9(nuclease-proficient Cas9)代替taCas9，以通过gRNA表达的调控条件性将多重基因组编辑活性与细胞信号连接。这使得能够在体内环境(例如细胞特异性的、时间或空间控制)下条件性地多重敲除。除了遗传研究之外，在一些实施方案中，该能力可用于创建体内基于DNA的将细胞事件与突变相连的“纸带(ticker tape)”。
在一些实施方案中，这些构造为人细胞中复杂且紧凑的合成基因线路的构建奠定了基础。不受理论束缚，因为用经改造构建体的调控互链的特异性仅由RNA序列决定，所以可构建具有几乎任何网络拓扑结构的可扩展的线路。例如，多层网络拓扑结构在人工和天然遗传环境下，对于获得复杂行为是重要的。因此，为了证明本构建体对于实施更复杂合成线路的用途，将其用于创建高度特异且有效的第一基于CRISPR-TF的转录级联。本文通过所提供的实施例证明了这是可靠的具有2种不同构造的三步转录级联，所述不同构造合并了RNA三链体、内含子、Csy4和CRISPR-TF。在所述级联的不同阶段之间不存在不希望的串扰，这突出了RNA依赖性调控方案对于合成基因线路设计的正交性及可扩展性。在一些情况下，可使用多重gRNA表达与转录级联的组合以创建多阶段、多输入/多输出的基因网络，其能够推理、计算、以及与内源***交互。此外，在一些实施方案中，可用的拓扑结构，如多阶段前馈和反馈环，可被容易地编程。
此外，RNA调控部分(如CRISPR-TF和RNA干扰)被整合在一起以创建多种线路拓扑结构，其可通过条件性RNA处理而重接。因为正调控和负调控两者均可能以相同的taCas9蛋白和miRNA进行可调的负调控，许多重要的多组件网络拓扑结构可使用该组调控部分实施。此外，Csy4可用于例如通过修饰RNA转录本催化基因表达中的改变。例如，释放功能gRNA以用于转录调节，并且从RNA转录本移除miRNA结合位点以消除基于miRNA的连接。此外，Csy4的不存在或存在用于分别转换基于miRNA的自调控负反馈环的开与关(图7B)。在一些实施方案中，该特征可在线路中扩展以使得将正反馈环中不需要的泄漏最小化，并使线路在不同状态之间动态地转换。通过连接Csy4表达与例如内源启动子，线路与网络行为之间的互连也可条件性地与特定的组织、事件(例如，细胞周期阶段，突变)或环境条件相连。通过基因组发掘或对Csy4的定向诱变，正交的Csy4变体可用于更复杂的RNA处理方案。此外，通过使用正交的Cas9蛋白可获得额外的灵活性和可扩展性。
总之，本公开内容提供了多样的构建体组，以用于建立可扩展的调控基因线路、对其调整、修饰线路组件之间的连接，以及使网络中的多个基因表达同步。此外，在一些实施方案中，这些调控部分可用于交互合成基因线路与内源***以及用于重接内源网络。将RNA依赖性调控机制与RNA处理整合将使得复杂的转录及转录后调控成为可能，加快合成生物学，并促进在人细胞中的基础生物学的研究。
质粒构建
CMVp-dCas9-3xNLS-VP64(taCas9，构建体1，表2)质粒的建立如前所述(Farzadfard等，2013)。来自于铜绿假单胞菌菌株UCBPP-PA14(Qi等，2012)的csy4基因被密码子优化以用于在人细胞中表达，经PCR扩增含有N端6x-His标签以及TEV识别序列，并克隆至PGK1-EBFP2质粒(Farzadfard等，2013)中HindIII/SacI位点之间的PGK1启动子下游，以创建PGK1p-Csy4-pA(构建体2，表2)。
表2.构建体名称、设计及缩写
使用GIBSON由用合适的同源突出端扩增的三个部分建立质粒CMVp-mKate2-三链体-28-gRNA1-28-pA(构建体3，表2)：1)mKate2的全长编码序列；2)小鼠MALAT1 3’三螺旋的前110个碱基对(bp)(Wilusz等，2012)；以及3)含有20bp特异性决定序列(Specificity Determining Sequence，SDS)和酿脓链球菌(S.pyogenes)gRNA骨架以及28个核苷酸(nt)Csy4识别位点的gRNA1。
报告质粒P1-EFYP-pA(构建体5，表2)和P2-ECFP-pA(构建体6，表2)为通过将gRNA1结合位点的8个重复和gRNA2结合位点的8个重复经由对互补寡核苷酸退火克隆到pG5-Luc(Promega)的NheI位点中建立。然后，将EYFP和ECFP分别克隆到NcoI/FseI位点中。
通过GIBSON由具有合适同源性突出端的以下部分建立质粒CMVp-mKate2_EX1-[28-gRNA1-28]HSV1-mKate2-EX2-pA(构建体4，表2)：1)mKate2的mKate2_EX1(a.a.1-90)；2)mKate2的mKate_EX2(a.a.91-239)以及3)gRNA1，其含有20bp SDS，之后为酿脓链球菌gRNA骨架，所述骨架的侧翼为Csy4识别位点和HSV1接受体、供体及分支序列。以相似的方式建立CMVp-mKate2_EX1-[28-gRNA1-28]HSV1-mKate2_EX2-pA质粒的变化，所述质粒含有共有接受体和SnoRNA2接受体、供体及分支序列，并且具有或不具有Csy4识别序列(构建体8至12，表2)。
通过GIBSON由XmaI消化的CMVp-mKate2和经PCR延伸的gRNA1扩增子(具有或不具有三链体，并在5’末端上含有HHRibo(Gao和Zhao，2014)以及在3’末端上含有HDVRibo(Gao和Zhao，2014))建立核酶表达质粒CMVp-mKate2-三链体-HHRibo-gRNA1-HDVRibo-pA和CMVp-mKate2-HHRibo-gRNA1-HDVRibo-pA质粒(分别为构建体13和14，表2)。相似地通过GIBSON由SacI消化的CMVp-mKate2和经PCR延伸的gRNA1扩增子(在5’末端上含有HHRibo，且在3’末端上含有HDVRibo)建立质粒CMVp-HHRibo-gRNA1-HDVRibo-pA(构建体15，表2)。使用合适的同源性通过GIBSON由以下部分建立质粒CMVp-mKate2_EX1-[28-gRNA1-28]HSV1-mKate2_EX2-三链体-28-gRNA2-28-pA(构建体16，表2)：1)XmaI消化的CMVp-mKate2_EX1-[28-gRNA1-28]HSV1-mKate2_EX2-pA(构建体4，表2)以及2)从CMVp-mKate2-三链体-28-gRNA1-28-pA(构建体3，表2)之经PCR扩增的三链体-28-gRNA2-28。使用合适的同源性通过GIBSON的以下部分建立质粒CMVp-mKate2-三链体-28-gRNA1-28-gRNA2-28-pA(构建体17，表2)：1)XmaI消化的CMVp-mKate2-三链体-28-gRNA1-28-pA(构建体3，表2)以及2)经PCR扩增的28-gRNA2-28。
利用Golden Gate方法，使用II型限制性酶，BsaI构建质粒CMVp-mKate2-三链体-28-gRNA3-28-gRNA4-28-gRNA5-28-gRNA6-28-pA(构建体19，表2)。具体而言，PCR扩增靶向含有20bp SDS的gRNA3、gRNA4、gRNA5、gRNA6序列的IL1RN以及酿脓链球菌gRNA骨架，以使其含有5’末端上的BsaI限制性位点以及Csy4“28”和3’末端上的BsaI限制性位点。使PCR扩增产物进行30个如下交替的循环：消化随后分别在37℃和20℃连接。将含有gRNA3-28-gRNA4-28-gRNA5-28-gRNA6-28排列的540bp PCR产物扩增并用NheI/XmaI消化，并且克隆至CMVp-mKate2-三链体-28-gRNA1-28-pA质粒(构建体3，表2)中。
以来自Lila Wroblewska的赠送接受含有内含子FF4(合成miRNA)的CMVp-mKate2_EX1-[miRNA]-mKate2_EX2-pA质粒。将合成FF4miRNA克隆至位于mKate2的a.a.90与91之间的具有共有接收者、供体及分支序列的内含子中，以产生CMVp-mKate2_EX1-[miRNA]-mKate2_EX2-三链体-28-gRNA1-28-pA(构建体20，表2)以及CMVp-mKate2_EX1-[miRNA]-mKate2_EX2-三链体-28-gRNA1-28-4xFF4BS-pA(构建体21，表2)。
质粒CMVp-ECFP-三链体-28-8xmiRNA-BS-28-pA(构建体22，表2)通过具有以下部分的GIBSON克隆：1)ECFP的全长编码序列，和2)110nt的MALAT1 3’三螺旋序列，其用含有8个FF4miRNA结合位点及两端上的Csy4识别序列的寡核苷酸通过PCR延伸扩增。
细胞培养和转染
HEK293T细胞获自美国组织保藏中心(American Tissue Collection Center，ATCC)，并在Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，DMEM)中在37℃、5％CO2下维持，所述培养基补充有10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、1％青霉素-链霉素、1％GlutaMAX、非必需氨基酸。将HEK293T细胞用HD转染试剂(Promega)根据制造商的说明书转染。在6孔板中，使用200,000细胞/孔进行每个转染。作为对照，使用了2μg的单质粒，其中CMV启动子调控mKate2，转染效率常规地高于90％(通过用与实验相同的设置进行的流式细胞术测定)。除非另有说明，每种质粒以1μg/样品转染。所有样品用taCas9转染，除非具体说明。在转染后72小时将细胞进行流式细胞术或qRT-PCR分析。
定量反转录-PCR(RT-PCR)
下述实验过程描述于(Perez-Pinera等，2013a)中。在转染后72小时收获细胞。使用RNeasy Plus RNA分离试剂盒(Qiagen)分离总RNA。使用qScript cDNA SuperMix(QuantaBiosciences)进行cDNA合成。用具有以下寡核苷酸引物的Mastercycler ep realplex实时PCR***(Eppendorf)进行使用PerfeCTa SYBR Green FastMix(Quanta Biosciences)的实时PCR：
IL1RN-正向GGAATCCATGGAGGGAAGAT(SEQ ID NO：22)，
反向TGTTCTCGCTCAGGTCAGTG(SEQ ID NO：23)；
GAPDH-正向CAATGACCCCTTCATTGACC(SEQ ID NO：24)，
反向TTGATTTTGGAGGGATCTCG(SEQ ID NO：25)。
使用Primer3Plus软件设计所述引物并且其购自IDT。通过熔化曲线分析确定引物特异性。计算了合适动态范围内的反应效率，以确保标准曲线的线性。通过ddCt法计算以GAPDH表达归一化的目的基因mRNA表达的倍数提高。然后，我们以非特异性gRNA1对照条件归一化mRNA水平。报告的值为用对每个实验进行平均的技术性重复的三次独立生物学重复的平均值。误差条代表平均值的标准差(standard error of the mean，s.e.m)。
流式细胞术
转染后72小时用胰蛋白酶收获细胞，用DMEM培养基和1xPBS洗涤，用1xPBS重悬到流式细胞术管中并立即用Becton Dickinson LSRII Fortessa流式细胞仪测定。在每个数据组中对每个样品至少记录50,000个细胞。每个实验结果代表来自至少3次生物学重复的数据。误差条为对加权中位荧光值的s.e.m(关于数据分析的详细信息参见扩展的实验流程)。
补偿对照
补偿对照是严格的并设计为移除假阳性细胞，甚至以移除真阳性细胞为代价。用BD FACSDiva(版本号6.1.3；BD Biosciences)完成补偿，详细信息如下：
表3.用于流式细胞术的补偿设置
荧光染料 -％荧光染料 光谱重叠
PE-Tx-Red-YG FITC 0％
Pacific Blue FITC 0.2％
FITC PE-Tx-Red-YG 21.1％
Pacific Blue PE-Tx-Red-YG 1％
FITC Pacific Blue 7.5％
流式细胞术分析
对补偿的流式细胞术结果使用FlowJo软件(vX.0.7r2)进行分析。按以下描述进行计算：
对所有样品进行设门(gate)以排除细胞团块和碎片(群P1)。根据以下设门分析P1细胞的柱状图，根据在相同获取条件下非转染细胞的自体荧光对其进行确定，以使得假阳性细胞的比例低于0.1％：
mKate2：“mKate2阳性”细胞限定为高于100a.u.的荧光阈值的细胞。
EYFP：“EYFP阳性”细胞限定为高于300a.u.的荧光阈值的细胞。
ECFP：“ECFP阳性”细胞限定为高于400a.u.的荧光阈值的细胞。
计算每个“阳性细胞”群的阳性细胞的百分比(％阳性)和中位荧光。将％阳性细胞乘以中位荧光，得到加权中位荧光表达水平，其将荧光强度与细胞数目相关联。该检测策略与几个先前的研究(Auslander等，2012；Xie等，2011)相一致。
确定每个样品的加权中位荧光。计算生物学重复的加权中位荧光的平均值。这些是展示于文章中的数据。还计算了平均值的标准差(s.e.m)并以误差条表示。
为了促进不同构建体之间的比较以及说明不同荧光蛋白的亮度变化，将每种实验条件的加权中位荧光除以相同实验设置下测试的所有条件中相同荧光团的最大加权中位荧光。
示于补充信息中的流式细胞术数据图代表来自单个实验的补偿数据。如上文所述，对细胞进行设门以排除细胞团块和碎片(群P1)，并将活细胞的整个设门的群呈现于每个图中。根据上述阈值设定每个亚群Q1至Q4的阈值。每个亚群中细胞的百分比如图中所示。图中的黑色十字表明了具体亚群的中位荧光。
虽然本文描述并举例说明了几个创造性实施方案，然而本领域普通技术人员将容易地预见到用于实施本文所描述的功能和/或获得结果和/或一种或更多种优势的多种其他手段和/或构建体，并且每个这样的变化和/或修改都被认为是在本文所描述的创造性实施方案的范围内。更普遍地说，本领域技术人员将容易地理解，所有本文描述的参数、尺寸、材料和构造意在作为示例，并且实际的参数、尺寸、材料和/或构造将取决于使用该创造性教导的具体应用。本领域技术人员将认识到，或能够仅使用常规实验确定本文所描述的具体创造性实施方案的许多等同方案。因此，应当理解的是，上述实施方案仅通过实例的方式展示，并且除非具体描述和要求保护，创造性实施方案可在附加权利要求及其等同方案的范围内实施。本公开内容的创造性实施方案针对本文所述的每个单独特征、***、制品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果这些特征、***、制品、材料、试剂盒和/或方法相互不一致，则任何2种或更多种所述特征、***、制品、材料、试剂盒和/或方法的组合均包括在本公开内容的创造性范围内。
本文所限定并使用的所有定义应当理解为相比于词典的定义、通过参考并入的文件中的定义，和/或所限定的术语的普通含义，以本文所限定并使用的所有定义为准。
除非清楚指明相反，否则本文用于说明书和权利要求中的没有数词限定的表述应理解为意指“至少一个/种”。
本文用于说明书和权利要求中的短语“和/或”应理解为意指这样连接的要素的“任一个或两者全部”，即要素在一些情况下相结合，而在其他情况下不结合。用“和/或”列出的多个要素应以相同方式诠释，即这样连接的要素的“一个/种或更多个/种”。除了通过“和/或”分句具体限定的要素外的其他要素可以任选地存在，无论其是否与那些具体限定的要素相关。因此，作为一个非限制性实例，提及“A和/或B”，当其与开放式语句(如“包含”)联用时，在一个实施方案中，可指仅有A(任选地包括除B以外的要素)；在另一个实施方案中，可指仅有B(任选地包括除A以外的要素)；而在另一个实施方案中，可指A与B两者(任选地包括其他要素)；等。
本文用于说明书和权利要求中的“或”应理解为具有与上文限定的“和/或”相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或者“和/或”应解释为包括性的，即包括许多要素或要素列表的至少一个/种，但也包括多于一个/种，并且任选地包括未列出的额外项目。仅有清楚相反指明的短语时，如“仅其中一个/种”或“确切地其中一个/种”或当用于权利要求中时的“由...组成”，指确切地包括许多要素或要素列表中的一个要素。通常，当前面是排他性短语，如“两者之一”、“其中一个/中”、“仅其中一个/种”或“确切地其中一个/种”时，本文所使用的术语“或”仅应当被解释为表示排斥的选择(即，“一个/种或另一个/种但并非两者全部”)。当“基本上由...组成”用于权利要求中时，应具有其在专利法领域使用时的普通含义。
本文用于说明书和权利要求中的涉及一个/种或更多个/种要素列表的短语“至少一个/种”应理解为意指选自该要素列表中的任何一个/种或更多个/种要素中的至少一个/种要素，但并非必须包括该要素列表内所具体列出的各个/种和每个/种要素的至少一个/种，也不排除该要素列表中的要素的任意组合。该定义也允许除了短语“至少一个/种”所指的要素列表内所具体限定的要素外的要素可以任选地存在，无论其是否与所具体限定的要素相关。因此，作为一个非限制性实例，“A和B中的至少一个/种”(或等同地，“A或B中的至少一个/种”，或等同地，“A和/或B中的至少一个/中”)在一个实施方案中可指至少一个/种，任选地包括多于一个/种，A而不存在B(并且任选地包括除B以外的要素)；在另一个实施方案中，指至少一个/种，任选地包括多于一个/种，B而不存在A(并且任选地包括除A以外的要素)；而在另一个实施方案中，指至少一个/种，任选地包括多于一个/种A，以及至少一个/种，任选地包括多于一个/种B(并且任选地包括其他要素)；等。
应当理解的是，除非清楚相反指明，在本文所要求保护的任何包括多于一个步骤或动作的方法中，所述方法的步骤或动作的顺序并不必须受限于其中记载了所述方法的步骤或动作的顺序。
本文所公开的所有参考文献、专利及专利申请均以其各自被引用的主题通过引用并入，在一些情况下其可包括整个文件。
在权利要求以及上述说明书中，所有过渡短语如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”、“由...构成”等应理解为开放式的，即意指包括但不限于。只有过渡短语“由...组成”和“基本上...组成”应分别为封闭的或半封闭的过渡短语，如美国专利局专利审查程序手册，章节2111.03所阐释的。
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(下面的每一篇参考文献均通过引用并入本文。)
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Claims (127)

1.经改造构建体，其包含与核酸有效相连的启动子，所述核酸包含：
(a)编码至少1个导引RNA(gRNA)的核苷酸序列；以及
(b)选自以下的一个或更多个核苷酸序列：(i)编码目的蛋白质的核苷酸序列和(ii)编码RNA干扰分子的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的经改造构建体，其中所述启动子为RNA聚合酶II依赖性(RNA polII)启动子。
3.权利要求1或2所述的经改造构建体，其中所述至少1个gRNA的侧翼为编码核糖核酸酶识别位点的核苷酸序列。
4.权利要求3所述的经改造构建体，其中所述核糖核酸酶识别位点为Csy4核糖核酸酶识别位点。
5.权利要求1或2所述的经改造构建体，其中所述至少1个gRNA的侧翼为编码核酶的核苷酸序列。
6.权利要求5所述的经改造构建体，其中所述核酶选自锤头状核酶和丁型肝炎病毒核酶。
7.权利要求1至6中任一项所述的经改造构建体，其中(a)所述的核苷酸序列侧翼为同源内含子剪接位点。
8.经改造构建体，其包含与核酸有效相连的启动子，所述核酸包含编码至少1个导引RNA(gRNA)的第一核苷酸序列，所述gRNA侧翼为核糖核酸酶识别位点。
9.权利要求8所述的经改造构建体，其中所述第一核苷酸序列的侧翼为同源内含子剪接位点。
10.权利要求8或9所述的经改造构建体，其中所述核酸还包含编码目的蛋白质的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列在所述第二核苷酸序列内。
11.权利要求8至10中任一项所述的经改造构建体，其中所述核酸还包含编码目的蛋白质的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列在所述第一核苷酸序列的上游。
12.权利要求8至11中任一项所述的经改造构建体，其中所述经改造构建体还包含编码至少1个微小RNA的核苷酸序列。
13.权利要求12所述的经改造构建体，其中在所述目的蛋白质内编码所述至少一个微小RNA。
14.权利要求10至13中任一项所述的经改造构建体，其中所述核酸还包含编码三螺旋结构的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第二核苷酸序列与所述第一核苷酸序列之间。
15.权利要求8至14中任一项所述的经改造构建体，其中所述启动子为RNA聚合酶II依赖性(RNA pol II)启动子。
16.权利要求15所述的经改造构建体，其中所述RNA pol II启动子为人巨细胞病毒启动子、人泛素启动子、人组蛋白H2A1启动子或人炎性趋化因子CXCL1启动子。
17.权利要求8至16中任一项所述的经改造构建体，其中所述第一核苷酸序列编码至少2个gRNA，每个gRNA的侧翼为核糖核酸酶识别位点。
18.权利要求17所述的经改造构建体，其中所述第一核苷酸序列编码至少3个gRNA，每个gRNA的侧翼为核糖核酸酶识别位点。
19.权利要求18所述的经改造构建体，其中所述第一核苷酸序列编码至少4个gRNA，每个gRNA的侧翼为核糖核酸酶识别位点。
20.权利要求19所述的经改造构建体，其中所述第一核苷酸序列编码至少5个gRNA，每个gRNA的侧翼为核糖核酸酶识别位点。
21.权利要求8至20中任一项所述的经改造构建体，其中所述第一核苷酸序列编码至少2个侧翼为核糖核酸酶识别位点的gRNA，并且其中所述gRNA彼此不同。
22.权利要求8至21中任一项所述的经改造构建体，其中所述核糖核酸酶识别位点为Csy4核糖核酸酶识别位点。
23.权利要求22所述的经改造构建体，其中每个所述Csy4核糖核酸酶识别位点的长度为28个核苷酸。
24.权利要求22或23所述的经改造构建体，其中所述Csy4核糖核酸酶识别位点来自于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
25.权利要求14至24中任一项所述的经改造构建体，其中所述三螺旋结构由来自于MALAT1基因座的3’末端或MENβ基因座的3’末端的核苷酸序列编码。
26.经改造构建体，其包含与核酸有效相连的启动子，所述核酸包含：
编码目的蛋白质的第一核苷酸序列；以及
编码至少1个侧翼为核糖核酸酶识别位点的导引RNA(gRNA)的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列的侧翼为编码同源内含子剪接位点的核苷酸序列并且位于所述第一核苷酸序列内。
27.权利要求26所述的经改造构建体，其中所述经改造构建体还包含编码至少1个微小RNA的核苷酸序列。
28.权利要求27所述的经改造构建体，其中在所述目的蛋白质内编码所述至少1个微小RNA。
29.权利要求26至28中任一项所述的经改造构建体，其中所述核酸还包含：
编码三螺旋结构的第三核苷酸序列；以及
编码至少1个侧翼为核糖核酸酶识别位点的gRNA的第四核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第一核苷酸序列的下游，并且在所述第四核苷酸序列的上游。
30.权利要求26至29中任一项所述的经改造构建体，其中所述启动子为RNA聚合酶II依赖性(RNA pol II)启动子。
31.权利要求30所述的经改造构建体，其中所述RNA pol II启动子为人巨细胞病毒启动子、人泛素启动子、人组蛋白H2A1启动子或人炎性趋化因子CXCL1启动子。
32.权利要求26至31中任一项所述的经改造构建体，其中所述第二核苷酸序列编码至少2个gRNA，每个gRNA的侧翼为核糖核酸酶识别位点。
33.权利要求32所述的经改造构建体，其中所述第二核苷酸序列编码至少3个gRNA，每个gRNA的侧翼为核糖核酸酶识别位点。
34.权利要求33所述的经改造构建体，其中所述第二核苷酸序列编码至少4个gRNA，每个gRNA的侧翼为核糖核酸酶识别位点。
35.权利要求34所述的经改造构建体，其中所述第二核苷酸序列编码至少5个gRNA，每个gRNA的侧翼为核糖核酸酶识别位点。
36.权利要求26至35中任一项所述的经改造构建体，其中所述第二核苷酸序列编码至少2个侧翼为核糖核酸酶识别位点的gRNA，并且其中所述gRNA彼此不同。
37.权利要求26至36中任一项所述的经改造构建体，其中所述核糖核酸酶识别位点为Csy4核糖核酸酶识别位点。
38.权利要求37所述的经改造构建体，其中每个所述Csy4核糖核酸酶识别位点的长度为28个核苷酸。
39.权利要求37或38所述的经改造构建体，其中所述Csy4核糖核酸酶识别位点来自于铜绿假单胞菌。
40.权利要求26至39中任一项所述的经改造构建体，其中所述同源内含子剪接位点来自于共有内含子。
41.权利要求26至39中任一项所述的经改造构建体，其中所述同源内含子剪接位点来自于HSV1潜伏相关内含子。
42.权利要求26至39中任一项所述的经改造核酸，其中所述同源内含子剪接位点来自于sno-IncRNA2内含子。
43.权利要求29至42中任一项所述的经改造核酸，其中所述三螺旋结构由来自于MALAT1基因座的3’末端或MENβ基因座的3’末端的核苷酸序列编码。
44.权利要求29至43中任一项所述的经改造构建体，其中所述第四核苷酸序列编码至少2个gRNA，每个gRNA的侧翼为核糖核酸酶识别位点。
45.权利要求44所述的经改造构建体，其中所述第四核苷酸序列编码至少3个gRNA，每个gRNA的侧翼为核糖核酸酶识别位点。
46.权利要求45所述的经改造构建体，其中所述第四核苷酸序列编码至少4个gRNA，每个gRNA的侧翼为核糖核酸酶识别位点。
47.权利要求46所述的经改造构建体，其中所述第四核苷酸序列编码至少5个gRNA，每个gRNA的侧翼为核糖核酸酶识别位点。
48.权利要求29至47中任一项所述的经改造构建体，其中所述第四核苷酸序列编码至少2个侧翼为核糖核酸酶识别位点的gRNA，并且其中所述gRNA彼此不同。
49.经改造构建体，其包含与核酸有效相连的启动子，所述核酸包含编码至少1个侧翼为核酶的导引RNA(gRNA)的第一核苷酸序列。
50.权利要求49所述的经改造构建体，其中所述核酸还包含编码目的蛋白质的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列在所述第一核苷酸序列的上游。
51.权利要求49或50所述的经改造构建体，其中所述经改造构建体还包含编码至少1个微小RNA的核苷酸序列。
52.权利要求51所述的经改造构建体，其中在所述目的蛋白质内编码所述至少1个微小RNA。
53.权利要求50至52中任一项所述的经改造构建体，其中所述核酸还包含编码三螺旋结构的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第二核苷酸序列与所述第一核苷酸序列之间。
54.权利要求49至53中任一项所述的经改造构建体，其中所述启动子为RNA聚合酶II依赖性(RNA pol II)启动子。
55.权利要求54所述的经改造构建体，其中所述RNA pol II启动子为人巨细胞病毒启动子、人泛素启动子、人组蛋白H2A1启动子或人炎性趋化因子CXCL1启动子。
56.权利要求49至55中任一项所述的经改造构建体，其中所述第一核苷酸序列编码至少2个gRNA，每个gRNA的侧翼为核酶。
57.权利要求56所述的经改造构建体，其中所述第一核苷酸序列编码至少3个gRNA，每个gRNA的侧翼为核酶。
58.权利要求57所述的经改造构建体，其中所述第一核苷酸序列编码至少4个gRNA，每个gRNA的侧翼为核酶。
59.权利要求58所述的经改造构建体，其中所述第一核苷酸序列编码至少5个gRNA，每个gRNA的侧翼为核酶。
60.权利要求49至59中任一项所述的经改造构建体，其中所述第一核苷酸序列编码至少2个侧翼为核酶的gRNA，并且其中所述gRNA彼此不同。
61.权利要求49至60中任一项所述的经改造构建体，其中所述核酶为顺式作用核酶。
62.权利要求61所述的经改造构建体，其中至少1个所述顺式作用核酶为锤头状核酶。
63.权利要求62所述的经改造构建体，其中所述锤头状核酶位于所述至少1个gRNA的5’末端。
64.权利要求61所述的经改造构建体，其中至少1个所述顺式作用核酶为丁型肝炎病毒核酶。
65.权利要求64所述的经改造构建体，其中所述丁型肝炎病毒核酶位于所述至少1个gRNA的3’末端。
66.权利要求53至65中任一项所述的经改造构建体，其中所述三螺旋结构由来自于MALAT1基因座的3’末端或MENβ基因座的3’末端的核苷酸序列编码。
67.经改造构建体，其包含与核酸有效相连的启动子，所述核酸包含：
编码目的蛋白质内的至少1个RNA干扰分子的第一核苷酸序列；
编码至少1个侧翼为核糖核酸酶识别位点的导引RNA的第二核苷酸序列；以及
编码三螺旋结构的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间。
68.经改造构建体，其包含与核酸有效相连的启动子，所述核酸包含：
编码目的蛋白质内的至少1个RNA干扰分子的第一核苷酸序列；
编码至少1个侧翼为核酶的导引RNA的第二核苷酸序列；以及
编码三螺旋结构的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间。
69.权利要求67或68所述的经改造构建体，其中所述至少1个RNA干扰分子选自微小RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)。
70.权利要求69所述的经改造构建体，其中所述至少1个RNA干扰分子包含至少1个miRNA。
71.载体，其包含权利要求1至70中任一项所述的经改造构建体。
72.细胞，其包含权利要求1至70中任一项所述的经改造构建体或权利要求71所述的载体。
73.细胞，其包含至少2个权利要求1至70中任一项所述的经改造构建体或至少2个权利要求71所述的载体。
74.权利要求72或73所述的细胞，其中所述细胞被修饰以稳定表达核糖核酸酶。
75.权利要求74所述的细胞，其中所述核糖核酸酶为Csy4核糖核酸酶。
76.权利要求72至75中任一项所述的细胞，其中所述细胞被修饰以稳定表达Cas蛋白。
77.权利要求76所述的细胞，其中所述Cas蛋白为Cas核酸酶。
78.权利要求76所述的细胞，其中所述Cas核酸酶为Cas9核酸酶。
79.权利要求76所述的细胞，其中所述Cas蛋白为具有转录活性的Cas蛋白。
80.权利要求79所述的细胞，其中所述具有转录活性的Cas蛋白为具有转录活性的Cas9蛋白。
81.-权利要求72至80中任一项所述的细胞，其中所述细胞还包含经改造核酸，所述核酸包含与编码核糖核酸酶的核苷酸序列有效相连的启动子。
82.权利要求81所述的细胞，其中所述核糖核酸酶为Csy4核糖核酸酶。
83.权利要求72至82中任一项所述的细胞，其中所述细胞还包含经改造核酸，所述核酸包含与编码Cas蛋白的核苷酸序列有效相连的启动子。
84.权利要求83所述的细胞，其中所述Cas蛋白为Cas核酸酶。
85.权利要求84所述的细胞，其中所述Cas核酸酶为Cas9核酸酶。
86.权利要求83所述的细胞，其中所述Cas蛋白为具有转录活性的Cas蛋白。
87.权利要求86所述的细胞，其中所述具有转录活性的Cas蛋白为具有转录活性的Cas9蛋白。
88.权利要求72至87中任一项所述的细胞，其中所述细胞还包含至少1个额外的经改造核酸，所述核酸包含与编码目的蛋白质的核苷酸序列有效相连的启动子。
89.权利要求88所述的细胞，其中所述至少1个额外的经改造核酸的目的蛋白质与所述细胞中的任何其他目的蛋白质不同。
90.权利要求72至89中任一项所述的细胞，其中所述细胞为细菌细胞。
91.权利要求72至89中任一项所述的细胞，其中所述细胞为人细胞。
92.方法，其包括培养权利要求72至91中任一项所述的细胞。
93.权利要求92所述的方法，其包括在允许核酸表达的条件下培养所述细胞。
94.产生、修饰或重接细胞遗传线路的方法，其包括：
在细胞中表达第一经改造构建体，所述构建体选自权利要求1至70中任一项所述的经改造构建体；以及
在细胞中表达第二经改造构建体，所述构建体选自权利要求1至70中任一项所述的经改造构建体，其中所述第一经改造构建体的至少1个gRNA与所述第二经改造构建体的启动子的区域或者内源启动子的区域互补并结合。
95.权利要求94所述的方法，其还包括表达第三经改造构建体，所述构建体选自权利要求1至70中任一项所述的经改造构建体，其中所述第二经改造构建体的至少1个gRNA与所述第三经改造构建体的启动子的区域或者内源启动子的区域互补并结合。
96.权利要求95所述的方法，其还包括表达至少1个额外的经改造核酸，所述核酸选自权利要求1至70中任一项所述的经改造核酸，其中所述至少1个额外的经改造核酸的至少1个gRNA与所述细胞的任一个所述经改造核酸的启动子的区域或者至少1个内源启动子的区域互补并结合。
97.权利要求94至96中任一项所述的方法，其中所述细胞被修饰以稳定表达Cas蛋白。
98.权利要求97所述的方法，其中所述Cas蛋白为Cas核酸酶。
99.权利要求98所述的方法，其中所述Cas核酸酶为Cas9核酸酶。
100.权利要求97所述的方法，其中所述Cas蛋白为具有转录活性的Cas蛋白。
101.权利要求100所述的方法，其中所述具有转录活性的Cas蛋白为具有转录活性的Cas9蛋白。
102.权利要求94至101中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含经改造核酸，所述核酸包含与编码核糖核酸酶的核苷酸序列有效相连的启动子。
103.权利要求102所述的方法，其中所述核糖核酸酶为Csy4核糖核酸酶。
104.权利要求94至103中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含经改造核酸，所述核酸包含与编码Cas蛋白的核苷酸序列有效相连的启动子。
105.权利要求104所述的方法，其中所述Cas蛋白为Cas核酸酶。
106.权利要求105所述的方法，其中所述Cas核酸酶为Cas9核酸酶。
107.权利要求104所述的方法，其中所述Cas蛋白为具有转录活性的Cas蛋白。
108.权利要求107所述的方法，其中所述具有转录活性的Cas蛋白为具有转录活性的Cas9蛋白。
109.权利要求94至108中任一项所述的方法，其还包括培养所述细胞。
110.多重细胞表达导引核糖核酸(gRNA)的方法，其包括在细胞中表达经改造构建体，所述构建体包含与核酸有效相连的启动子，所述核酸包含编码至少2个gRNA的第一核苷酸序列，每个gRNA的侧翼为核糖核酸酶识别位点。
111.权利要求110所述的方法，其中所述核酸还包含编码目的蛋白质的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列在所述第一核苷酸序列的上游。
112.权利要求111所述的方法，其中所述经改造构建体还包含编码至少1个微小RNA的核苷酸序列。
113.权利要求112所述的经改造构建体，其中在所述目的蛋白质内编码所述至少1个微小RNA。
114.权利要求111至113中任一项所述的方法，其中所述核酸还包含编码三螺旋结构的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第二核苷酸序列与所述第一核苷酸序列之间。
115.权利要求110至114中任一项所述的方法，其中所述细胞被修饰以稳定表达Cas蛋白。
116.权利要求115所述的方法，其中所述Cas蛋白为Cas核酸酶。
117.权利要求116所述的方法，其中所述Cas核酸酶为Cas9核酸酶。
118.权利要求115所述的方法，其中所述Cas蛋白为具有转录活性的Cas蛋白。
119.权利要求118所述的方法，其中所述具有转录活性的Cas蛋白为具有转录活性的Cas9蛋白。
120.权利要求110至119中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含经改造核酸，所述核酸包含与编码核糖核酸酶的核苷酸序列有效相连的启动子。
121.权利要求120所述的方法，其中所述核糖核酸酶为Csy4核糖核酸酶。
122.权利要求110至121中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含经改造核酸，所述核酸包含与编码Cas蛋白的核苷酸序列有效相连的启动子。
123.权利要求122所述的方法，其中所述Cas蛋白为Cas核酸酶。
124.权利要求123所述的方法，其中所述Cas核酸酶为Cas9核酸酶。
125.权利要求122所述的方法，其中所述Cas蛋白为具有转录活性的Cas蛋白。
126.权利要求125所述的方法，其中所述具有转录活性的Cas蛋白为具有转录活性的Cas9蛋白。
127.权利要求110至126中任一项所述的方法，其还包括培养所述细胞。
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